一種從牦牛骨骼中提取的牦牛小分子肽及其提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從牦牛骨骼中提取的牦牛小分子肽及其提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基酸的分子小，蛋白質(zhì)大，兩個(gè)或以上的氨基酸脫水縮合形成若干個(gè)肽鍵從而組成一個(gè)肽，多個(gè)肽進(jìn)行多級(jí)折疊就組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子。二勝肽，簡(jiǎn)稱(chēng)二肽，就是由二個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)片斷。生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)幾百種肽，是機(jī)體完成各種復(fù)雜的生理活性必不可少的參與者。所有細(xì)胞都能合成多肽物質(zhì)，其功能活動(dòng)也受多肽的調(diào)節(jié)。它涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖各領(lǐng)域，其重要性在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)器官和細(xì)胞。酶法多肽的生理和藥理作用主要是激活體內(nèi)有關(guān)酶系，促進(jìn)中間代謝膜的通透性，或通過(guò)控制DNA轉(zhuǎn)錄或翻譯而影響特異的蛋白合成，最終產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)或發(fā)揮其藥理作用。肽優(yōu)于氨基酸，一是較氨基酸吸收快速；二是以完整的形式被機(jī)體吸收；三是主動(dòng)吸收(氨基酸屬被動(dòng)吸收)；四是低耗，與氨基酸比較，肽吸收具有低耗或不需消耗能量的特點(diǎn)，肽通過(guò)十二指腸吸收后，直接進(jìn)入血液循環(huán)，將自身能量營(yíng)養(yǎng)輸送到人體各個(gè)部位；五是肽吸收較氨基酸，具有不飽和的特點(diǎn)；六是氨基酸只有20種，功能可數(shù)，而肽以氨基酸為底物，可合成上百上千種。
[0003]在諸多的多肽中，由于小分子活性肽具有易吸收，不增加人體消化負(fù)擔(dān)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極其高而廣泛被當(dāng)代人們所意識(shí)和接受，逐漸成為當(dāng)下人們養(yǎng)生品而受到熱捧。那么在現(xiàn)有技術(shù)中制備小分子肽的方法有多種，例如CN101194733A，CN101532044A，CN102090680A,以及CN12 8 O8 34A均公開(kāi)了關(guān)于多肽的制備方法，但是方法單一，提取性能不高，再例如，CN101120724A公開(kāi)了一種微生物發(fā)酵制作飼料用多肽制劑，由以下重量百分比原料組成:枯草芽孢桿菌40-55、植物乳桿菌25-35、干酪乳桿菌10-35。但制備的多肽制劑在用于骨骼提取多肽時(shí)，提取效率不高，生物發(fā)酵劑單一，使用場(chǎng)合也受到限制。CN102488073A公開(kāi)一種海參肽的提取方法，采用酶解方法，加入海參專(zhuān)用酶，酶解6小時(shí)，酶解過(guò)程中每隔I小時(shí)攪拌2分鐘；加入活性炭進(jìn)行去味，然后加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，濃縮過(guò)程中測(cè)定控制波美度在10，該方法不能提取較多成分的多肽，且波美度較低，造成一定程度的資源浪費(fèi)。CN1931020A公開(kāi)了一種低含鹽量的多肽生產(chǎn)方法，其工藝流程包括:牛羊鮮骨的清洗破碎，高壓蒸煮，加蛋白酶酶解，加酸、堿調(diào)節(jié)PH值，過(guò)濾濃縮，噴粉干燥，成品包裝，原料來(lái)源廣泛，成品的多肽成分可達(dá)90%，提高了水解度，可用于配制多種保健食品，適用于酶法提取牛、羊動(dòng)物骨骼中多肽的方法，但是對(duì)于貴重的骨骼原料不能盡可能的提高多肽成分，造成不必要的浪費(fèi)。
[0004]綜上，現(xiàn)有技術(shù)的的多肽提取方法單一，提取效率不高，造成浪費(fèi)，適用場(chǎng)合受到限制，制備的多肽尤其是小分子活性肽難以用于肽類(lèi)藥物和肽類(lèi)保健品，對(duì)滿足日益增長(zhǎng)的保健品和藥品市場(chǎng)不具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為有效解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種小分子活性多肽尤其是從牦牛中提取小分子多肽的方法，該方法能夠綜合優(yōu)勢(shì)，極大的提高小分子活性多肽的提取效率，且該方法能夠適用于多種骨骼多肽的提取。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是一種從牦牛骨骼中提取牦牛小分子肽的方法，依次包括如下步驟:⑴制備發(fā)酵劑；⑵牦牛骨骼前處理；⑶初級(jí)微生物發(fā)酵；⑷電解初級(jí)牦牛蛋白；
(5)酒精激活胰漿制備；(6)酶解過(guò)程；(7)后處理過(guò)程。
[0007]進(jìn)一步的步驟(I)制備發(fā)酵劑過(guò)程中，使用有益菌株的液體培養(yǎng)制備發(fā)酵劑，包括枯草芽孢桿菌、雙歧螺桿菌、鼠李糖乳桿菌、光合菌、地衣芽孢桿菌，還加入營(yíng)養(yǎng)素，所述的營(yíng)養(yǎng)素為麥芽汁；
[0008]進(jìn)一步的步驟(2)牦牛骨骼前處理中，采用高壓蒸煮的方法得到骨湯；步驟(3)初級(jí)微生物發(fā)酵中，加入促產(chǎn)劑，所述的促產(chǎn)劑為植酸質(zhì)，發(fā)酵得到初級(jí)微生物發(fā)酵的牦牛蛋白，即初級(jí)耗牛蛋白；
[0009]進(jìn)一步的步驟(4)電解初級(jí)牦牛蛋白中，將所述的初級(jí)牦牛蛋白進(jìn)行電解，得到牦牛寡肽骨湯；步驟(5)酒精激活胰漿制備中:胰臟做蛋白酶來(lái)源，采用食用酒精一步激活形成胰酶，形成酒精激活胰漿；
[0010]進(jìn)一步的步驟(6)酶解過(guò)程中:牦牛寡肽骨湯、酒精激活胰漿按照一定質(zhì)量比進(jìn)行酶解，分三次加入所述酒精激活胰漿，得到初級(jí)牦牛小分子肽；步驟(7)后處理過(guò)程中:經(jīng)過(guò)后處理得到牦牛小分子肽。
[0011]本發(fā)明提供的一種小分子活性多肽尤其是從牦牛中提取小分子多肽的方法，更具體的步驟如下:(I)制備發(fā)酵劑:使用有益菌株的液體培養(yǎng)制備發(fā)酵劑，稱(chēng)取枯草芽孢桿菌10重量份，雙歧螺桿菌10重量份，鼠李糖乳桿菌40重量份，麥芽汁15重量份，光合菌20重量份，地衣芽孢桿菌5重量份混合在一起，并置入到盛裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在所述三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)的溫度為37°C，在200-250rpm/min下培養(yǎng)18_20h，使菌體或者孢子濃度達(dá)到5 X 113個(gè)/升(CFU/L)，制得發(fā)酵劑；(2)牦牛骨骼前處理:將新鮮的牦牛骨骼破碎，清洗，在蒸煮罐中，采用溫度為130°C以上溫度，壓力0.17-0.18MPa高壓蒸煮300_400min，骨渣排出，湯油導(dǎo)入湯油儲(chǔ)罐中分層分離，得到骨湯；(3)初級(jí)微生物發(fā)酵:將步驟(2)得到的骨湯轉(zhuǎn)入至初級(jí)發(fā)酵生產(chǎn)罐中，并加入所述骨湯重量的0.5-0.8%的促產(chǎn)劑，所述的促產(chǎn)劑為植酸質(zhì)，在35-38°C的低溫下發(fā)酵8-10h，然后升溫至160-200°C繼續(xù)發(fā)酵5-8h，得到初級(jí)微生物發(fā)酵的牦牛蛋白，即初級(jí)牦牛蛋白；(4)電解初級(jí)牦牛蛋白，將所述的初級(jí)牦牛蛋白進(jìn)行電解，使用常規(guī)的蛋白質(zhì)電解法，電解過(guò)程中，槽電壓為20-50mV，電解時(shí)間為3-5h，取三個(gè)試樣測(cè)試，每個(gè)試樣中的牦牛肽的分子量范圍均不超過(guò)800道爾頓時(shí)，則停止電解，得到牦牛寡肽骨湯；(5)酒精激活胰漿制備:酒精激活胰漿制備過(guò)程如下:在胰酶激活器中，放入洗凈的胰臟做蛋白酶來(lái)源，采用食用酒精一步激活形成胰酶，所述食用酒精的加入量是所述胰酶質(zhì)量的2倍，所述食用酒精的體積濃度是45%，所述激活時(shí)間為60-80h，激活溫度為6-8°C，成為酒精激活胰漿；(6)酶解過(guò)程:將所述牦牛寡肽骨湯導(dǎo)入水解罐中，然后分三次加入所述酒精激活胰漿，三次加入的所述酒精激活胰漿的質(zhì)量之比為1:1: 4，第一次是在所述酶解開(kāi)始時(shí)加入，第二次是在所述酶解進(jìn)行Ih時(shí)加入，第三次加入是所述酶解進(jìn)行2h時(shí)加入，所述酶解總時(shí)間為7h，所述酒精激活胰漿的加入質(zhì)量是牦牛寡肽骨湯質(zhì)量的1/9-1/5，在所述酶解過(guò)程中保持水解罐中PH為6.7-7.0 ;在所述酶解過(guò)程中第一次加入酒精激活胰漿后至第二次加入酒精激活胰漿前的酶解溫度為60°C，第二次加入酒精激活胰漿后的酶解溫度為45°C，得到初級(jí)牦牛小分子肽；(7)后處理過(guò)程:經(jīng)過(guò)所述酶解過(guò)程，即經(jīng)過(guò)所述酒精激活胰漿在水解罐中的水解，成為水解最終的混合液體，經(jīng)過(guò)過(guò)濾后導(dǎo)入濃縮罐進(jìn)行濃縮，濃縮溫度為50°C，濃縮至少2h，之后降溫，在降溫至30°C時(shí)，測(cè)定波美度不小于30時(shí)，停止?jié)饪s，將濃縮液煮沸滅菌，噴粉干燥，水分含量降至2.5%以下，送入儲(chǔ)罐，密封包裝，得到牦牛小分子肽。
[0012]優(yōu)選，步驟⑴制備發(fā)酵劑過(guò)程中，在所述三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)的溫度為37°C，在200rpm/min下培養(yǎng)20h ;步驟(2)牦牛骨骼前處理:在蒸煮罐中，采用溫度為150°C，壓力
0.17MPa 高壓蒸煮 400min。
[0013]