)質(zhì)粒（命名為祀T-28a(+)-l-l)，可用于進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
[0045] 實(shí)施例3 :脂肪酶L-I在大腸桿菌化21 0E3)中的高效表達(dá)
[0046] 3. 1大腸桿菌化21 〇)E3)感受態(tài)細(xì)胞制備
[0047] 曰、將大腸桿菌化21 〇)E3)接入5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜搖培，250巧m;
[004引 b、按1 %體積比的接種率將過夜搖培后的大腸桿菌化21觸扣菌液接種到LB搖瓶 中，37°C搖培化（> 300巧m)，得到原培養(yǎng)物；
[0049] C、將搖瓶在冰水中迅速冷卻至0°C，將原培養(yǎng)物分裝至冰預(yù)冷的離屯、管巧0血)， 冰置數(shù)分鐘；
[0050] d、4°C，4000rpm離屯、IOmin回收細(xì)胞，將殘留液空干（迅速）；
[0051] e、冰預(yù)冷的IOmL0.IM的CaClz重懸細(xì)胞，4°C，4000巧m離屯、IOmin回收細(xì)胞；
[0052] f、10血0.IM的CaClz重懸細(xì)胞，冰浴比W上；
[0053] g、4°C，4000巧m離屯、IOmin回收細(xì)胞；
[0054]h、每50血原培養(yǎng)物得到的回收細(xì)胞用2血含15 %甘油的化Cl冰重懸，分裝于 1. 5血離屯、管，200UL每管。-80°C保藏。由此得到大腸桿菌化21觸3)感受態(tài)細(xì)胞。
[00巧]3. 2轉(zhuǎn)化
[0056] 取實(shí)施例2中得到的祀T-28a(+)-l-l質(zhì)粒0. 5~IyL與50化BL21 〇)E3)感受 態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，于42°C水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500yLLB液體培養(yǎng)基， 37°C20化pm培養(yǎng)比。培養(yǎng)物離屯、后涂布50yL/mL的卡那霉素LB平板，培養(yǎng)2化后挑選單 菌。由此得到含有祀T-28a(+)-l-l的大腸桿菌化21 0E3)。
[0057]實(shí)施例4 :脂肪酶的表達(dá)和純化 [005引 4.1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
[0059] 含有祀T-28a(+)-l-l的大腸桿菌化21值E3)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600為0. 5 左右，加IPTG至濃度0. 2mM，22°C培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。300血菌液4000巧m，4°C離屯、lOmin，收 集菌體，用20血巧OmM,pH7. 2)PBS緩沖液重懸菌體，超聲400w，超4s，停6s，破碎IOmin分 鐘，離屯、，收集上清。上清于-80°C冷凍過夜，冷凍干燥制備成脂肪酶L-I粗酶粉。
[0060] 4. 2脂肪酶的純化
[0061] 用儀離子親和層析柱對(duì)步驟4.1中收集的上清進(jìn)行了純化得純化的脂肪酶 (圖5)，純化的蛋白大小約35kD，符合理論預(yù)期。具體實(shí)施方案如下：使用5mM的咪挫 洗脫5個(gè)柱體積，20~IOOmM咪挫洗脫30個(gè)柱體積，最后使用100~1000 mM咪挫洗脫5個(gè) 柱體積，收集中間3. 5mL。用脫鹽柱Se地adexG25對(duì)上述脂肪酶進(jìn)行脫鹽，具體操作方法參 照GE公司的操作手冊(cè)進(jìn)行。
[0062] 4. 3脂肪酶酶活測(cè)定
[006引脂肪酶活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酪醋，具體方法如下：①配制IOmM的對(duì)硝基 苯酪醋；②在1血反應(yīng)體系中加入220 y L his-肥1 buffer (50mM，pH 8.0) ,IOyL乙醇， 20^1脂肪酶心1酶液化26111旨/1110;@于35°(：下，3~5111111后，410皿測(cè)定吸光度。
[0064] 酶活單位定義：lmin內(nèi)水解對(duì)硝基苯酪醋，釋放1 Jimol對(duì)硝基苯酪所需的酶量定 義為一個(gè)酶活單位。
[006引實(shí)施例5 :脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)
[0066] 5. 1水解不同長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酪醋
[0067] 按照4. 3的測(cè)定條件，比較脂肪酶作用不同酷基長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酪醋，結(jié)果如 圖1，可見脂肪酶L-I不能作用C16,說明對(duì)長(zhǎng)鏈對(duì)硝基苯酪醋特異性差；而對(duì)于中等長(zhǎng)度的 對(duì)硝基苯酪醋的作用效果較好，最佳的底物是C6,即對(duì)硝基苯酪己酸醋。
[0068] 5. 2最適抑和抑穩(wěn)定性
[0069] 配制不同的緩沖溶液，運(yùn)些緩沖溶液具有不同的抑，如表2所示，其濃度均為 SOmM：
[0070] 表2不同緩沖體系的抑
[0071]
[0072] 將4. 3中測(cè)定條件（W對(duì)硝基苯酪己酸醋作為底物）所述的緩沖液燈ris-HCl buffer)按照表2中的緩沖溶液替換，測(cè)定不同PH的緩沖溶液對(duì)脂肪酶的酶活力的影 響，結(jié)果說明脂肪酶L-I酶活在中性至弱堿性范圍內(nèi)最高，最適抑為8. 0,W化is-HCl為 佳；抑高于8. 0、小于7. 0酶活性都會(huì)急劇下降（圖2A)。
[0073] 脂肪酶L-I先置于不同PH的緩沖液中處理地，按4. 3中測(cè)定條件（W對(duì)硝基苯酪 己酸醋作為底物）測(cè)定脂肪酶L-I酶活，脂肪酶L-I酶活在抑為8. 5緩沖液中穩(wěn)定性最高 (圖2B)。5. 3最適溫度和溫度穩(wěn)走性
[0074] 使用P冊(cè).0,Tris-HCl作為緩沖溶液，將4. 3中的反應(yīng)混合液（W對(duì)硝基苯酪己酸 醋作為底物）置于不同的溫度下處理30min，然后加入脂肪酶kl，測(cè)定酶活，脂肪酶L-I最 適反應(yīng)溫度在40°C左右，高于45°C酶活緩慢降低，60°C酶活基本為40°C的60% (圖3A)。
[0075] 將酶于不同溫度（25~70°C)預(yù)處理比，于40°C下，P冊(cè).0，Tris-HCl的緩沖溶液 中，按4. 3測(cè)定方法（W對(duì)硝基苯酪己酸醋作為底物）測(cè)定脂肪酶L-I的酶活，結(jié)果說明脂 肪酶在20°C的穩(wěn)定性最好，隨著溫度升高，穩(wěn)定性急劇降低，40°C處理比后酶活基本為 0 (圖 3B)。
[0076] 5. 4金屬離子抑制
[OOW]W50mMpH7. 0的化is-HCl為溶劑配制不同金屬離子溶液，每種金屬離子濃度均 為2mM，將脂肪酶L-I酶液在各種金屬離子溶液中37°C下處理Ih;W不加金屬離子的50mM、 pH7. 0的化is-肥1溶液為對(duì)照（control。測(cè)定酶活，結(jié)果見表3,可見僅有Li2\M護(hù)對(duì)酶 活有促進(jìn)作用，對(duì)Ca2+的耐受性也相對(duì)較好，其它金屬離子對(duì)脂肪酶L-I均表現(xiàn)出抑制作 用。
[007引表3金屬離子對(duì)脂肪酶L-I酶活力的影響

[0081] 5. 5有機(jī)溶劑和馨合劑對(duì)脂肪酶活性的影響
[0082] 將純化后得到脂肪酶L-I加入到表4中的幾種有機(jī)溶劑中處理比（對(duì)照為蒸饋 水，其他溶液的濃度為體積分?jǐn)?shù)），按照4. 3的測(cè)定方法（W對(duì)硝基苯酪己酸醋作為底物） 測(cè)定剩余酶活。結(jié)果如表4所示，說明脂肪酶對(duì)短鏈醇、控類和Tween-20有較好的耐受 性，10%TritonX-IOO能提高酶活至119. 48 + 25. 39%，而對(duì)SDS耐受性不高，具體為脂肪 酶L-I對(duì)甲醇、乙醇、異丙醇、叔下醇、異下醇、正戊醇、正己醇、TritonX-100、甲苯、1，4-二 氧六環(huán)、環(huán)己燒、正庚燒、正辛燒、正癸燒、Tween-20和丙酬有較好的耐受性，且其能夠提高 脂肪酶L-I酶活。
[0083] 表4有機(jī)溶劑和馨合劑對(duì)脂肪酶L-I活性的影響


[0087] 實(shí)施例6:脂肪酶L-I在合成乙酸肉桂醋中的應(yīng)用
[0088] 本法采用有機(jī)相中的轉(zhuǎn)醋反應(yīng)來合成乙酸肉桂醋。
[0089] 乙酸肉桂醋是一種重要的香料，酶法合成乙酸肉桂醋受到酷基供體、反應(yīng)有機(jī)溶 劑種類、底物比例、反應(yīng)溫度等等諸多條件的影響。本發(fā)明優(yōu)化了上述參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了乙酸肉 桂醋的合成。在優(yōu)化的條件下，在5mL1，4-二氧六環(huán)的反應(yīng)介質(zhì)中，加入終濃度為300mM的 乙酸乙締醋作為酷基供體和50mM肉桂醇，再加入50mg脂肪酶L-I粗酶粉，于25°C，500巧m 條件下，反應(yīng)9化后使肉桂醇轉(zhuǎn)化成乙酸肉桂醋，轉(zhuǎn)化率達(dá)到48. 3% (圖4)。
[0090] 具體分析條件為：反應(yīng)后的液體取出3血，12000巧m離屯、Imin除去脂肪酶 粗酶粉，加入0.ImM的十二燒作為內(nèi)標(biāo)物，混合均勻后，加入無水硫酸鋼除去水分，取出 100-1000yL用于GCMS檢測(cè)。色譜柱RXI-5MS，進(jìn)樣口溫度220°C，進(jìn)樣方式：分流，柱流 量：1. 20血/min,離子源溫度200°C，接口溫度280°C。柱箱溫度50°C，恒溫保持Imin,W 12°C/min的速率上升到150°C，再W20°C/min的速率上升到300°C，恒溫保持Imin。圖4 中3個(gè)峰分別為內(nèi)標(biāo)物十二燒、底物肉桂醇和產(chǎn)物乙酸肉桂醋，出峰時(shí)間分別為8. 385min、 9. 799min、11. 022min。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種脂肪酶L-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的脂肪酶L-1的脂肪酶基因1-1。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酶基因1-1，其特征在于，所述的脂肪酶基因1-1的核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示。4. 權(quán)利要求1所述的脂肪酶L-1在制備乙酸肉桂酯中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為：取脂肪酶L-1于反應(yīng)介質(zhì) 中，再加入肉桂醇和?；w，進(jìn)行反應(yīng)，制備得到乙酸肉桂酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的反應(yīng)介質(zhì)為1，4-二氧六環(huán)、四氫呋 喃、叔丁醇、異丙醇、二氯甲烷、甲苯、環(huán)己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的酰基供體為乙酸乙烯酯、乙酸異丙 烯酯、乙酸酐、乙酸、乙酸仲丁酯和乙酸乙酯中的一種。8. 權(quán)利要求1所述的脂肪酶L-1在耐受短鏈醇、經(jīng)類、丙酮、Tween-20或TritonX-100 環(huán)境下進(jìn)行催化的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的短鏈醇為甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁 醇、異丁醇、正戊醇或正己醇；所述的烴類為甲苯、1，4-二氧六環(huán)、環(huán)己烷、正庚烷、正辛烷 或正癸烷。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶L-1及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從放線菌(Streptomyces？sp.)SCSIO？13580中克隆得到脂肪酶基因l-1，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，全長(zhǎng)為1005bp，其編碼的脂肪酶L-1的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，共包含334個(gè)氨基酸；通過克隆脂肪酶基因l-1并將其連接表達(dá)載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組表達(dá)的脂肪酶L-1。脂肪酶L-1作為催化劑催化肉桂醇和?；w進(jìn)行反應(yīng)，制備得到乙酸肉桂酯，獲得的乙酸肉桂酯產(chǎn)率可達(dá)48.3％。脂肪酶L-1具有穩(wěn)定性高、催化效率高的優(yōu)點(diǎn)，可用于生物醫(yī)藥、化妝品和精細(xì)化工等領(lǐng)域。
【IPC分類】C12P7/62, C12N9/20, C12N15/55
【公開號(hào)】CN105296446
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510760314
【發(fā)明人】胡云峰, 王召賀, 張?jiān)? 孫愛君
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月9日