核酸分子雜交的CGRMV單一探針和同時(shí)檢測(cè)CGRMV與PLMVd二聚探針的研 究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)以上領(lǐng)域的不足，本發(fā)明提供了二聚探針同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和 桃潛隱花葉類病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的二聚探針同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑 點(diǎn)雜交試劑盒，包含如下用于合成cRNA二聚探針的特異性引物：
[0011] 本發(fā)明還提供了同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的CRNA二聚探 針。
[0012] 本發(fā)明所提供的同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的cRNA二聚探 針的序列如序列表中序列8所示
[0013] 本發(fā)明還提供了同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的cRNA二聚探 針的制備方法。
[0014] 本發(fā)明所提供的同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的cRNA二聚探 針的制備方法，包括如下步驟：
[0015] (1)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物CGRMV-F和CGRMV-R通過RT-PCR擴(kuò)增得到 所述櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后克隆到質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒I; 同時(shí)使用權(quán)利要求1所述的特異性引物PLMVd-F和PLMVd-R通過RT-PCR擴(kuò)增得到所述桃 潛隱花葉類病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后克隆到質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒Π;
[0016] (2)對(duì)所述步驟（1)得到的所述重組質(zhì)粒I和重組質(zhì)粒Π分別使用權(quán)利要求1 所述的特異性引物CGRMV-F和CGRMV-R及PLMVd-F和PLMVd-R通過RT-PCR進(jìn)行再次PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片段分別用限制性內(nèi)切酶Ecol進(jìn)行酶切和串聯(lián)，亞克隆到新的質(zhì)粒載體上 形成CGRMV和PLMVd串聯(lián)片段的重組質(zhì)粒III;
[0017] (3)以所述步驟（2)合成的重組質(zhì)粒III為模板，按照地高辛標(biāo)記試劑盒說明書通 過體外轉(zhuǎn)錄制備得到CGRMV+PLMVd-cRNA二聚探針。
[0018] 所述質(zhì)粒載體為pGEM-T載體；所述重組質(zhì)粒I為重組質(zhì)粒pG-CGRMV;所述重組 質(zhì)粒Π為重組質(zhì)粒pG-PLMVd;所述重組質(zhì)粒III為重組質(zhì)粒pG-CGRMV+PLMVd。
[0019] 本發(fā)明還提供了同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點(diǎn)雜交方 法。
[0020] 本發(fā)明所提供的同時(shí)檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點(diǎn)雜交方 法，包括如下步驟：
[0021] (1)提取待測(cè)樣品的總RNA，得到RNA提取物；
[0022] (2)將所述RNA提取物經(jīng)甲醛變性后，點(diǎn)到雜交膜上；
[0023] (3)使用所述的斑點(diǎn)雜交試劑盒進(jìn)行雜交檢測(cè)。
[0024] 所述步驟（1)中所述提取待測(cè)樣品的總RNA的方法為CTAB提取法；
[0025] 所述步驟（2)中所述經(jīng)甲醛變性的方法為：5μ1RNA加3μ1 37 %甲醛+2μ1 20XSSC，混勻后于60°C保溫20min，置于冰上5min。
[0026]所述步驟（3)中所述雜交的溫度為60°C，雜交時(shí)間16h。
[0027] 本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒。
[0028] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的斑點(diǎn)雜交試劑盒，包含如下用于合 成cRNA單聚探針的特異性引物：
[0029]CGRMV-F：AAGGCCTTTCGCCTCTGATGATACCGTC；
[0030]CGRMV-R:GGAATTCCACCCTTCTACTGGCTGCAAT。
[0031] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的cRNA單聚探針。
[0032] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的cRNA單聚探針的序列如序列表中序列 5所示。
[0033] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的cRNA單聚探針的制備方法，包括如下 步驟：
[0034] (1)使用所述特異性引物CGRMV-F和CGRMV-R通過RT-PCR擴(kuò)增得到所述櫻桃綠環(huán) 斑駁病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收后克隆到pGEM-T載體上，得到重組質(zhì)粒pG-CGRMV;
[0035] (2)以所述步驟⑵合成的重組質(zhì)粒pG-CGRMV為模板，按照地高辛標(biāo)記試劑盒說 明書通過體外轉(zhuǎn)錄制備得到CGRMV-cRNA單聚探針。
[0036] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的斑點(diǎn)雜交方法，包括如下步驟：
[0037] (1)提取待測(cè)樣品的總RNA，得到RNA提取物；
[0038] (2)將所述RNA提取物經(jīng)甲醛變性后，點(diǎn)到雜交膜上；
[0039] (3)使用所述斑點(diǎn)雜交試劑盒或所述cRNA單聚探針進(jìn)行雜交檢測(cè)；
[0040] 所述步驟⑴中所述提取待測(cè)樣品的總RNA的方法為CTAB提取法；
[0041] 所述步驟⑵中所述經(jīng)甲醛變性的方法為：5μ1RNA加3μ1 37 %甲醛+2μ1 20XSSC，混勻后于60°C保溫20min，置于冰上5min;
[0042]所述步驟（3)中所述雜交的溫度為60°C，雜交時(shí)間16h。
[0043] 基于桃樹中CGRMV與PLMVd發(fā)生普遍和復(fù)合侵染率較高的原因，本發(fā)明制備能檢 測(cè)侵染桃樹的CGRMV病毒和PLMVd類病毒的單聚和同時(shí)檢測(cè)兩病原的二聚探針，目的是從 大量樣品中快速篩選出被這兩種病原侵染的桃樹樣品，為復(fù)合侵染的表型變化與病原的關(guān) 系分析，類病毒與病毒間互作機(jī)制的深入研究提供基礎(chǔ)，為果樹CGRMV和PLMVd的防治提供 理論依據(jù)。
[0044]目前，單聚探針和多聚探針已被用于植物病毒和類病毒的檢測(cè)，是快速大量檢測(cè) 植物病毒的一個(gè)好方法。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性引物，加上特異的酶切位點(diǎn)，利用基因片 段的串聯(lián)和亞克隆方法，利用地高辛標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)錄，制備了檢測(cè)果樹病毒和類病毒cRNA 單聚探針及病毒和類病毒串聯(lián)的cRNA二聚探針。利用制備的3種探針的斑點(diǎn)雜交對(duì)果 樹病毒和類病毒進(jìn)行了檢測(cè)，比較研究了幾種雜交條件，建立了敏感性和特異性強(qiáng)的果樹CGRMV和PLMVd的常規(guī)核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù)。制備的cRNA二聚探針，能同時(shí)檢測(cè)CGRMV 和PLMVd，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間和大大節(jié)約了成本，同時(shí)能快速篩選出這兩種病原侵染的樣 品，可以一次檢測(cè)大量樣本，有較大的應(yīng)用潛力和實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0045] 圖1為cDNA的克隆和cRNA探針的制備流程圖。
[0046] 圖2為RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果（左：PLMVd，右：CGRMV);其中M:DNAMarker D2000,N:陰性對(duì)照，1-3 :福建葉片樣品，4和5 :山東桃樹葉片樣品。
[0047] 圖3為CGRMV和PLMVd的酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。其中，1 :線性化PLMVd質(zhì)粒；2 :線 性化CGRMV質(zhì)粒；3 :未線性化PLMVd質(zhì)粒。
[0048] 圖4為CGRMV+PLMVd的亞克隆產(chǎn)物的菌液PCR。
[0049] 圖5為CGRMV+PLMVd的酶切產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。其中，1 :線性化CGRMV+PLMVd重組質(zhì) 粒；2 :未線性化CGRMV+PLMVd重組質(zhì)粒。
[0050] 圖6為CGRMV探針在不同雜交溫度下的雜交敏感性比較結(jié)果。
[0051] 圖7為不同RNA提取方法和變性方法的CGRMV探針雜交比較結(jié)果。
[0052] 圖8為CGRMV、PLMVd單聚探針和CGRMV+PLMVd二聚探針的雜交敏感性結(jié)果；其中， 1 :PLMVd陽性樣品，2 :CGRMV陽性樣品。
[0053] 圖9為二聚探針和單聚探針對(duì)田間38個(gè)樣品的斑點(diǎn)雜交結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 供試植物：
[0055] 帶毒和健康桃樹和櫻桃葉片樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存。樣品于2014年4~10月采自 山東煙臺(tái)，遼寧大連和福建福州果園。
[0056] 主要試劑和儀器：
[0057] 主要試劑：多糖多酸植物總RNA提取試劑盒（Polysaccharides&Polyphenolic s-richRNAprepPure)購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）公司）；限制性內(nèi)切酶主要來自寶生 物公司（TaKaRa)，RT-PCR擴(kuò)增所需的試劑主要來自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司 (PROMEGA)，WizardRSVGelandPCRClean-UpSystemDNA純化回收試劑盒為PR0MEGA 公司產(chǎn)品；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，AxyPrep質(zhì)粒DNA小提試劑盒，購(gòu)自Axygen試劑 公司；DIGRNALabelingKit(SP6/T7)，DIGEasyHybGranules(Hybridizationsolution fornucleicacidblotswithdigoxigenin-labeledprobes)，核酉愛分子雜交所需試劑， 主要來自美國(guó)羅氏（Roche)公司，尼龍膜為Hybond產(chǎn)品。
[0058] 主要儀器：Bio-RadPCR儀；KCBI0-2800凝膠成像系統(tǒng)；中國(guó)DYY-6B型穩(wěn)壓電泳 儀。恒溫水浴鍋、CL-1000紫外交聯(lián)儀（America);分子雜交爐、雜交瓶（America);微量紫 外分光光度計(jì)NanoDropKND-2000,America) 〇
[0059] 引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司（Huadagene，China)。測(cè)序由 金唯智生物科技有限公司完成（GENEWINZ，China)
[0060] 實(shí)施例1、制備CGRMV和PLMVd負(fù)義RNA單聚探針及CGRMV+PLMVd負(fù)義二聚RNA探 針
[0061] 1植物總RNA提取
[0062]植物總RNA提取采用改進(jìn)的CTAB法（Li,R.，Mock,R.，Huang,Q.etal.，A reliableandinexpensivemethodofnucleicacidextractionforthe PCR-baseddetectionofdivers