eplantpathogens.''JournalofVirological Methods，2008, 154(1-2) :48-55 ;·ZhangZ.，Peng，S.，Jiang，D.，etal·，Developmentofa polyprobeforthesimultaneousdetectionoffourgrapevineviroidsingrapevine plants.EuropeanJournalofPlantPathology，2012, 132:9-16.)和植物總RNA提取米用 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（操作方法按說明書）。
[0063] 2用于探針合成的PCR反應(yīng)特異性引物的設(shè)計(jì)
[0064] PLMVd引物參照已發(fā)表文獻(xiàn)（Ambros，S.，Herna'ndez，C.，Desvign es,J.C.etal. ,Genomicstructureofthreephenotypicallydifferent isolatesofPeachlatentmosaicviroid:implicationsoftheexistenceof constraintslimitingtheheterogeneityofviroidquasispecies.Journalof Virology，1998, 72 (9) : 7397-7406.)，為便于合成探針，我們在正向引物Y端加上了EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。CGRMV引物根據(jù)GenBank上已發(fā)表的相關(guān)序列的保守區(qū)CP基因， 用Primer3.0在線設(shè)計(jì)，為便于合成探針，正向和反向引物5'端均加上酶切位點(diǎn)和保護(hù) 堿基（表1)。
[0065] 表1用于探針合成的PCR反應(yīng)所用的特異性引物
[0066]
[0067] *序列中加下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶序列。
[0068] 引物CGRMV-F的序列如序列表中序列1所示；引物CGRMV-R的序列如序列表中序 列2所示；引物PLMVd-F的序列如序列表中序列3所示；引物PLMVd-R的序列如序列表中序 列4所示。
[0069] 3cDNA的克隆和地高辛標(biāo)記cRNA探針的制備 [0070]反轉(zhuǎn)錄體系
[0071]
[0073] 混勻混合液，室溫放置lOmin，42°C溫育lh，然后進(jìn)行PCR或_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0074]
[0075]PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 40sec，循環(huán)35次；最后72°C延伸lOmin。4°C保存。PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 分析，在DYY-6B型穩(wěn)壓電泳儀，100V下電泳30min左右，電泳膠于KCBI0-2800凝膠成像分 析儀中照相，分析電泳結(jié)果。
[0076]PCR產(chǎn)物使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收和克隆到 pGEM-T載體上。第一步，分別將CGRMV和PLMVd的PCR純化產(chǎn)物連接至帶有T7/SP6啟動 子pGEM-T克隆載體（PROMEGA公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為A3600)，轉(zhuǎn)化大腸感菌DH5α感 受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為9057)，篩選白色單菌落置于lmlLB(含氨芐 青霉素Amp)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過對菌液進(jìn)行PCR檢測來鑒定CGRMV和PLMVd的重組質(zhì)粒 (pG-CGRMV，pG-PLMVd)，經(jīng)菌液PCR，篩選陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn) 行序列測定。對所得序列通過131^1'(111^ ://?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/)與相關(guān)序列進(jìn)行比 對分析，鑒定檢測的目的片段。第二步，以合成的重組質(zhì)粒為模板，按照地高辛標(biāo)記試劑盒 (DIGRNALabelingKit(SP6/T7))說明書通過體外轉(zhuǎn)錄完成CGRMV-cRNA和PLMVd-cRNA單 聚探針（CG-probe和PL-probe)制備。第三步，對第一步克隆獲得的重組質(zhì)粒pG-CGRMV， pG-PLMVd進(jìn)行再次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增片斷分別用限制性內(nèi)切酶Ecol(表1)進(jìn)行酶切和串 聯(lián)，亞克隆到新的pGEM-T載體形成CGRMV+PLMVd重組質(zhì)粒（pG-CGRMV+PLMVd)并進(jìn)行序列 測定。同樣，以合成的重組質(zhì)粒pG-CGRMV+PLMVd為模板，按照地高辛標(biāo)記試劑盒說明書通 過體外轉(zhuǎn)錄完成CGRMV+PLMVd-cRNA二聚探針[(CG+PL)-poly2probe]的制備（圖1)。
[0077] 其中，地高辛標(biāo)記cRNA探針的制備方法：以合成的重組質(zhì)粒為模板，按照地高辛 標(biāo)記試劑盒（DIGRNALabelingKit(SP6/T7))說明書通過體外轉(zhuǎn)錄完成cRNA探針制備。 由于CGRMV為單鏈正義RNA病毒，PLMVd為單鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀RNA分子，在寄主體內(nèi)多以正 義鏈存在，所以，我們必須制備與其互補(bǔ)的負(fù)義RNA探針（cRNA探針），即通過改變外源基因 的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向。首先，用質(zhì)粒DNA小提試劑盒 (AxyPrepTMPlasmidMiniprepKit250-prepAxyPrep)擴(kuò)大培養(yǎng)測序鑒定正確的菌液，測 定提取的重組質(zhì)粒的濃度。取重組質(zhì)粒3ug，單探針和多聚探針的制備依據(jù)序列方向分別 用Spel和Ncol酶切，使重組質(zhì)粒線性化，用WizardRSVGelandPCRClean-UpSystem 試劑盒純化酶切產(chǎn)物，分別用T7和SP6RNA聚合酶對線性化質(zhì)粒（lug)，通過體外轉(zhuǎn)錄完成 CG-probe，PL-probe單聚探針和（CG+PL)-polyprobe二聚探針的制備（圖1)。按試劑盒 的轉(zhuǎn)化效率，1μg模板產(chǎn)生10μg標(biāo)記的RNA探針。取1μ1標(biāo)記產(chǎn)物通過1. 5%的瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測合格后的探針放于_80°C長期保存。
[0078] 3. 1CGRMV和PLMVd負(fù)義RNA單聚探針的制備
[0079] 用設(shè)計(jì)的帶酶切位點(diǎn)的CGRMV和PLMVd引物對采自福建和山東果園的桃樹葉片 樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明：在福建3個(gè)樣品和山東2個(gè)樣品中均擴(kuò)增出354bp大小 的PLMVd;在福建1個(gè)樣品和山東2個(gè)樣品中擴(kuò)增出394bp大小的CGRMV(圖2)。CGRMV 和PLMVdPCR產(chǎn)物切膠回收，克隆測序，通過Blast序列比對分析表明，擴(kuò)增出的CGRMV和 PLMVd片段與GenBank中注冊相關(guān)病毒的核苷酸序列相應(yīng)片段均具有較高一致性，一致性 分別為81 %~98%和96%~99%。
[0080] 挑選序列為反向插入的CGRMV和PLMVd的重組質(zhì)粒的菌液，用質(zhì)粒DNA小提試劑 盒，我們提取到了足量的重組質(zhì)粒。Spel酶切結(jié)果顯示，CGRMV和PLMVd的重組質(zhì)粒被成功 線性化（圖3)，用T7RNA聚合酶對線性化質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)錄完成了CGRMV和PLMVd負(fù)義 RNA單探針的制備（CG-probe，PL-probe)。CGRMV負(fù)義RNA單探針的序列如序列表中序列5 所示；PLMVd負(fù)義RNA單探針的序列如序列表中序列6所示。
[0081] 3. 2CGRMV+PLMVd負(fù)義二聚RNA探針的制備
[0082] 對3. 1中獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行再次PCR擴(kuò)增，獲得帶EcoRI酶切位點(diǎn)的CGRMV和 PLMVd產(chǎn)物，切膠回收后，兩片段分別用EcoRI酶切，獲得CGRMV和PLMVd的酶切片段，通過 兩片段連接，亞克隆到pGEM-Τ載體，經(jīng)菌液PCR檢測和測序驗(yàn)證，獲得了CGRMV和PLMVd成 功串聯(lián)的陽性克隆。經(jīng)過測序分析，單菌落2, 3, 6, 7, 9, 13, 16菌液為CGRMV和PLMVd串聯(lián) 成功的陽性克?。▓D4)，基因片段大小為740bp(序列如序列表中序列7所示），與GenBank 中注冊相關(guān)病毒的核苷酸序列相應(yīng)片段均具有較高一致性。挑出連接成功的正向插入載 體的CGRMV+PLMVd串聯(lián)的重組質(zhì)粒的陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取了足量的重組質(zhì)粒。對重組 質(zhì)粒Ncol酶切結(jié)果顯示，CGRMV+PLMVd的重組質(zhì)粒被成功線性化（圖5)，用SP6RNA聚合 酶對線性化質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)錄完成CGRMV+PLMVd負(fù)義RNA二聚探針的制備（CG+PL-poly 2probe)，CGRMV+PLMVd負(fù)義RNA二聚探針的序列如序列表中序列8所示。
[0083] 4斑點(diǎn)雜交檢測探針的靈敏性和特異性
[0084]RNA提取物經(jīng)甲醛變性后，點(diǎn)到雜交膜上，隨后，利用地高辛標(biāo)記的CG-probe， PL-probe單聚探針和（CG+PL)-poly2probe二聚探針按照Roche公司地高辛探針標(biāo)記及檢 測試劑盒說明書進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
[0085] 實(shí)驗(yàn)中主要對不同RNA提取方法及變性方法的樣品，不同雜交溫度的雜交效果進(jìn) 行了研究，優(yōu)化雜交條件。RNA提取方法包括改進(jìn)的植物總RNACTAB提取法和多糖多酚植 物總RNA提取試劑盒法。RNA變性方法包括：
[0086] 變性方法一 ：1μ1的RNA加3μ1變性液（甲酰胺500μ1，37 %甲醛162μ1， 10XM0PS100μΙ)，混勻后于 65°C保溫 15min，置于冰上 5min，加入 4μ1 20XSSC。
[0087]變性方法二：4μ1的RNA加6μ1變性液（甲酰胺10μ1，37%甲醛10μ1，20XSSC 10μ1)，60°C保溫 20min，置于冰上 5min。
[0088] 變性方法三：3μ1的RNA加3μ1變性液（甲酰胺500μ1，37 %甲醛162μ1， 10XM0PS100μΙ)，混勻后于60°C保溫 20min，置于冰上 5min，加入 2μ1 20XSSC。
[0089] 變性方法四：：5ylRNA加3μ1 37%甲醛+2μ1 20XSSC，混勻后于60°C保溫 20min，置于冰上5min〇
[0090] 雜交溫度包括：60°C和68°C。
[0091] 經(jīng)過幾種方法的比較最終確定：植物總RNACTAB提取法，變性方法四及60°C雜交 溫度，雜交16h雜交效果較好，用于本實(shí)驗(yàn)檢測探針的靈敏性和特異性。
[009