一種條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的 豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 滋養(yǎng)層干細(xì)胞（Trophoblastic stem cells，TSCs)和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cellS，ESCS)是從哺乳動(dòng)物早期囊胚建立的兩類干細(xì)胞，但是兩種干細(xì)胞具有很大的 差異，TSCs來源于囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞，位于囊胚的外周，體內(nèi)/體外只能分化為胎盤細(xì)胞;而 ESCs則來源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，在體內(nèi)可以發(fā)育成個(gè)體胎兒，而在體外可以無限增殖 和分化成為任何類型細(xì)胞的多功能干細(xì)胞。
[0003] 在人、大鼠、家兔上，利用BMP4可以將ESCs誘導(dǎo)分化成TSCs。最新研究表明，TSCs也 可誘導(dǎo)分化為類ESCs的多能干細(xì)胞，Wu等(2011)利用轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)表達(dá)0CT4轉(zhuǎn)錄因子的方法將 小鼠 TSCs誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞;這些研究都顯示了滋養(yǎng)層細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上的研究?jī)r(jià)值；同 時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤形成的干細(xì)胞，是研究早期胚胎發(fā)育和妊娠機(jī)制的重要材料，因此也 舉足輕重。
[0004] 然而哺乳動(dòng)物TSCs的研究起步較晚。哺乳動(dòng)物TSCs成功建系的報(bào)道最早見于1998 年，Tanaka等首次利用條件培養(yǎng)基和FGF4從小鼠囊胚中分離建立了 TSCs，另外，從附植后的 胚外外胚層也能夠建立小鼠 TSCs。之后利用類似的方法，建立了小鼠克隆囊胚NT-TSCs和恒 河猴囊胚TSCs等，但是在其他物種上報(bào)道還并不多。
[0005] 胎盤是由滋養(yǎng)層細(xì)胞分化而建立起來的器官，是胎兒和母體間水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等 交換的重要樞紐。水通道蛋白（Aquaporin，AQP)是指一類可以高效選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的細(xì) 胞膜通道蛋白，其功能是介導(dǎo)水、甘油、尿素、氣體等分子的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)水轉(zhuǎn) 運(yùn)具有非常重要作用。Zhu等2015證明豬滋養(yǎng)層細(xì)胞中大量表達(dá)水離子通道蛋白（其中亞型 包括六〇?1^〇?3^〇?4、六〇?5、六〇?6、六〇?7、六〇?9和八〇?11)，和25(1母豬子宮內(nèi)膜和胎盤內(nèi)的表 達(dá)一致。成為滋養(yǎng)層細(xì)胞一個(gè)重要生物學(xué)特征。
[0006] Tet-on系統(tǒng)因具有極為嚴(yán)密的開/關(guān)調(diào)控的功能，在制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面得到了 廣泛的應(yīng)用。該系統(tǒng)可以在體外對(duì)轉(zhuǎn)入的外源基因進(jìn)行時(shí)間上和組織特異性的調(diào)控表達(dá)。 在動(dòng)物的胚胎期，不需要目的基因表達(dá)時(shí)，添加 Dox會(huì)對(duì)胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育帶來負(fù)面影響。 而Tet-on系統(tǒng)在不添加誘導(dǎo)劑的情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，避免了添加誘導(dǎo)劑對(duì)胎兒發(fā)育的影 響。Tet-on系統(tǒng)對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行時(shí)間和組織特異性的精確調(diào)控，已經(jīng)被越來越多的科學(xué) 家用作制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工具。當(dāng)在細(xì)胞模型上研究一些關(guān)鍵基因時(shí)，需 要基因破壞時(shí)，添加誘導(dǎo)劑，不需要破壞時(shí)，停止添加誘導(dǎo)劑，條件性的掌控，防止細(xì)胞敲除 以后發(fā)生凋亡，因此避免種子細(xì)胞枯竭，而喪失種子細(xì)胞;對(duì)于后期研究具有重要的作用。
[0007] CRISPR-Cas9系統(tǒng)最早在細(xì)菌基因組上發(fā)現(xiàn)，隨后CRISPR-Cas9系統(tǒng)被廣發(fā)應(yīng)用于 建立各種動(dòng)物模型上，成為功能基因組學(xué)研究的有力工具。將CRISPR-Cas9系統(tǒng)與Tet-on誘 導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了 CRI SPR-Cas9對(duì)各種模型動(dòng)物和細(xì)胞模型進(jìn)行基因的時(shí)空敲除、 敲入及基因修飾作用，真正按照人們意愿及需求建立各種動(dòng)物模型及探索研究全基因組基 因功能分析提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá) 的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0010] 一種條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟：
[0011] (1)、將Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與CRISPR_Cas9技術(shù)相結(jié)合，獲得條件性表達(dá)的Cas9 基因，將所述條件性表達(dá)的Cas9基因進(jìn)行慢病毒包裝，濃縮、純化，獲得滴度為10 8TU/mL的 慢病毒液；
[0012] (2)、在添加有5 · 5~6 · 5yg/mL polybrene的完全培養(yǎng)基中加入80~120yL步驟（1) 的慢病毒液與1〇4個(gè)特征的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系，孵育5~8小時(shí)后換液，每24小時(shí)全量換液，2~ 3天后，每lmL培養(yǎng)基中添加 lyg嘌呤霉素(Puro)進(jìn)行藥物篩選，7~8天后得到Tet-on調(diào)控 Cas9表達(dá)的滋養(yǎng)層細(xì)胞系；
[0013] (3)、采用限性稀釋法將步驟(2)的滋養(yǎng)層細(xì)胞系稀釋至單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)25~35 天，經(jīng)檢測(cè)得到單個(gè)細(xì)胞來源的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系，即為條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì) 胞系。
[0014] 在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中所述特征的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系來自12d豬胚胎外胚 層分離建立的TSCs，該TSCs在體外穩(wěn)定增殖，表達(dá)多種水離子通道蛋白，具有特征的滋養(yǎng)層 細(xì)胞性質(zhì)，是目前研究豬胎盤發(fā)育和妊娠機(jī)制的重要材料。
[0015] 在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中所述慢病毒與特征的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系孵育6小時(shí) 后換液，2天后進(jìn)行藥物篩選。
[0016] 在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)中所述完全培養(yǎng)基為含10%FBS，55yMf3-巰基乙醇， 1 %L_ 谷氨酰胺和 1 %Penicilin_Stretomycin 的 DMEM 培養(yǎng)基。
[0017]在其中一些實(shí)施例中，步驟⑶中培養(yǎng)30天。
[0018] 在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)所述檢測(cè)為Cas9蛋白表達(dá)、Cas9mRNA表達(dá)檢測(cè)、基 因組整合分析以及Tet-on系統(tǒng)分析。
[0019]本發(fā)明還提供了上述建立方法建立的條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系。 [0020]本發(fā)明還提供了上述條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系在建立特征的基因 編輯細(xì)胞系方面的應(yīng)用。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] 1)本發(fā)明是采用慢病毒技術(shù)與CRISPR_Cas9和Tet-on相結(jié)合的系統(tǒng)所建立體外條 件性誘導(dǎo)表達(dá)Cas9基因的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞模型，是通過大量篩選后建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)單細(xì)胞系，進(jìn) 行基因組整合、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)分析，證明成功建立細(xì)胞系；在體外培養(yǎng)時(shí)，添加 Dox (強(qiáng)力霉素)誘導(dǎo)，細(xì)胞系開始大量表達(dá)Cas9,停止添加誘導(dǎo)劑時(shí)，Cas9也停止表達(dá)，證明獲 得了條件性誘導(dǎo)表達(dá)Cas9的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系；此外，利用豬Sohlhl基因進(jìn)行驗(yàn)證，在轉(zhuǎn)入 Sohlhl基因靶向的SgRNA以后，添加 Do X誘導(dǎo)時(shí)，破壞基因組中Soh 1 h 1基因結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞系啟 動(dòng)了基因編輯，達(dá)到了條件性敲除的目的，進(jìn)一步說明建立一種有效的細(xì)胞系；
[0023] 2)本發(fā)明條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系操作簡(jiǎn)單，使用方便，對(duì)于研究 一些滋養(yǎng)層細(xì)胞的關(guān)鍵功能基因和豬基因靶點(diǎn)的篩選具有潛在的使用價(jià)值，這個(gè)細(xì)胞系優(yōu) 勢(shì)在于條件性表達(dá)Cas9，防止細(xì)胞敲除以后發(fā)生凋亡，而喪失種子細(xì)胞，將成為研究豬胎盤 發(fā)育的一個(gè)重要的細(xì)胞材料，可應(yīng)用于豬早期胎盤發(fā)育和子宮妊娠機(jī)制的相關(guān)研究，同時(shí) 對(duì)于人類早期胚胎發(fā)育的研究也具有很大的參考價(jià)值。
【附圖說明】
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系的建立方法的路 線圖；
[0025]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的建立條件性誘導(dǎo)Cas9表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系的過程 圖；其中A:條件性Cas9表達(dá)的慢病毒穿梭質(zhì)粒;B:獲得了豬滋養(yǎng)層細(xì)胞陽(yáng)性克隆團(tuán)；C:細(xì)胞 擴(kuò)大培養(yǎng)的結(jié)果;D: Cas9基因在細(xì)胞基因組整合的檢測(cè)結(jié)果;E: Cas9基因 mRNA表達(dá)分析;F: CAS9蛋白表達(dá)檢測(cè)。
[0026]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的CAS9蛋白活性檢測(cè)圖；其中A: SgRNA序列;B: PCR擴(kuò)增的HU6 啟動(dòng)子(266bp)+SgRNA(85bp)片段;C:Sohlhl基因組編輯的分析結(jié)果；
[0027]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中妊娠期不同階段母豬胎盤AQP1、AQP3、AQP5和AQP9的表達(dá) 結(jié)果；
[0028]圖5是本發(fā)明實(shí)施例4中AQP1、AQP3、AQP5和AQP9蛋白在妊娠母豬胎盤中的定位結(jié) 果;其中，A-B: AQP1蛋白分別在妊娠第25和60天母豬胎盤中的免疫定位;C-D: AQP3蛋白分別 在妊娠第25和60天母豬胎盤中的免疫定位;E-F:AQP5蛋白分別在妊娠第25和60天母豬胎盤 中的免疫定位;G-H:AQP9蛋白分別在妊娠第25和60天母豬胎盤中的免疫定位;I:兔IgG作為 陰性對(duì)照。
[0029] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例5中豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系水離子通道蛋白亞型的免疫熒光檢測(cè)結(jié) 果，其中A、D、H、K、N分別為4〇?1^〇?3^〇?5^〇?9和兔以6染色 ;83、1、1^、0均為04?1染色;(：、 F、J、Μ和P分別為AQP1、AQP3、AQP5、AQP9和兔I gG與其DAP I染色的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。