%時，進行傳代處理。
[00例 2、人脂肪干細胞(ADSCs)表面標記的鑒定
[0050] 取對數(shù)生長期第3代的細胞，吸出培養(yǎng)基后，加入0.25 %膜蛋白酶+0.02 %抓TA的 消化液進行消化，之后用適量血清終止消化1000巧m離屯、lOmin，棄上清，用4°C遇冷的PBS洗 涂細胞2次后重懸均勻，調(diào)整細胞濃度約為IO 5-IO6個/血。取2個上樣管，每管加入500化的單 細胞懸液，離屯、后1號管標為標準對照，2號各加入化L FITC或PE標記的小鼠抗人細胞表面 分子CD59、CD45、CD34、CD105抗體工作液。室溫，避光，解育20min;PBS洗兩遍，W去除未結(jié)合 的抗體，SOOiiL 1640培養(yǎng)基重懸后，上流式細胞儀鑒定表面標記。結(jié)果見圖2。
[0化1] 由圖2所示，擴增第3代的ADSCs CD73XD90呈陽性表達，而HLA-DRXD45呈陰性表 達，符合干細胞的特性。
[0化2] 3、富血小板血漿的制備
[0053] 加抗凝劑的靜脈血低溫高速離屯、，第一次離屯、3000轉(zhuǎn)4min，吸取上層血漿、白膜層 至另一抗凝劑采血管中。3000轉(zhuǎn)離屯、15min，吸去上層3/4貧血小板血漿(PPP)，余下1/4即為 富血小板血漿(PRP)。分裝后-80°C保存。
[0054] 4、脂肪干細胞成骨分化誘導 [0化5] 1)實驗分組：
[0056] 對照組1:脂肪干細胞普通培養(yǎng)基組；
[0057] 對照組2:商品化培養(yǎng)基誘導組；
[005引實驗組1:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+O.liig/mL Ca化erin-11組；
[0059] 實驗組2:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% (體積百分比)PRP組；
[0060] 實驗組3:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+O.liig/mL Ca化erin-ll+10%PRP組。
[0061 ] 2)取第3代的ADSCs，吸出培養(yǎng)基后，加入0.25 %膜蛋白酶+0.02 %抓TA的消化液進 行消化，之后用適量血清終止消化。120化pm離屯、5min，脂肪干細胞完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密 度為IxlO4AiL,接種于6孔板中，每孔2mL。
[0062] 當細胞達到40%-50%融合時，分別應(yīng)用實驗分組所示培養(yǎng)基，同樣環(huán)境下誘導培 養(yǎng)，每3天更換誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后，部分細胞采用茜素紅進行染色，觀察形成巧結(jié)節(jié)的 情況；部分細胞用于抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，W此CDNA為模板，W上游引物： TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物：TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP);上游引物： TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物：TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)為引物進行免疫 巧光定量PCR，其中be化-act in作為內(nèi)參，檢測成骨細胞標志蛋白ALP、;runx2的基因表達量。 最后根據(jù)根據(jù)得到的C(t)值，W誘導前細胞中基因的表達量為參照，計算誘導后細胞中目 的基因相對于誘導前的表達量。
[0063] 3)茜素紅染色結(jié)果如下：
[0064] 由圖3可知，對照組1和誘導前細胞形態(tài)并無差別，細胞未被茜素紅染色，說明脂肪 干細胞并未向成骨細胞誘導分化;對照組2、實驗組1、實驗組2和實驗組3中各有一部分細胞 被茜素紅染成紅色，說明細胞誘導分化過程中形成巧結(jié)節(jié);而形成巧結(jié)節(jié)的多少順序分別 為：實驗組3、實驗組1、對照組2、實驗組2，說明和商品誘導液相比較，加入Ca化er in-11和 PRP的誘導液更易使細胞誘導分化，但是PRP單獨的誘導分化能力較弱，兩者聯(lián)合使用既可 提高誘導分化能力，又代替動物血清，減少了其應(yīng)用的風險和免疫原性。
[0065] 4)巧光定量PCR分析結(jié)果如下：
[0066] 表1巧光定量PCR分析結(jié)果
[0067]
[006引
[0069] 其中：*表示和誘導前相比較，P<0.05 ;**表示和誘導前相比較，P<0.0 l。
[0070] 由表1可知，對照組1和誘導前相比ALP和runx2基因表達無明顯變化，而對照組2、 實驗組1、實驗組2和實驗組3中細胞的Ca化erin和runx2基因表達量均升高，說明脂肪干細 胞成功向成骨細胞分化;而ALP和runx2基因表達量升高的順序分別為：實驗組3、實驗組1、 對照組2、實驗組2，說明和商品誘導液相比較，加入Ca化erin-11和PRP的誘導液更易使細胞 誘導分化，但是PRP單獨的誘導分化能力較弱，兩者聯(lián)合使用既可提高誘導分化能力，又代 替動物血清，減少了其應(yīng)用的風險和免疫原性，和染色結(jié)果一致。
[0071] 實施例2
[0072] 1、脂肪干細胞原代分離
[0073] 待脂肪組織與腫脹液自然分層后吸棄下層液體，加入等體積的生理鹽水清洗脂肪 組織2次，吸棄下方溶液;將脂肪組織分裝至SOmL離屯、管中，每管20mL，每管中加入等體積的 0.5 % I型膠原酶(終濃度為0.25 % )，充分混勻，封口，轉(zhuǎn)移至恒溫空氣搖床中，37 °C、200R 消化50min;消化完成后離屯、，15(K)rpm離屯、lOmin;棄去離屯、后的脂肪和脂肪油，每管加入 40mL生理鹽水重懸細胞，ISOOrpm離屯、5min，棄去上清，用普通培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%FBS) 重懸細胞，并接種至培養(yǎng)皿中，待細胞匯合度達到80-90 %時，進行傳代處理。
[0074] 2、人脂肪干細胞(ADSCs)表面標記的鑒定
[0075] 取對數(shù)生長期第3代的細胞，吸出培養(yǎng)基后，加入0.25%膜蛋白酶+0.02%抓TA的 消化液進行消化，之后用適量血清終止消化1000巧m離屯、IOmin，棄上清，用4°C遇冷的PBS洗 涂細胞2次后重懸均勻，調(diào)整細胞濃度約為IO 5-IO6個/mL。取2個上樣管，每管加入5(K)化的單 細胞懸液，離屯、后1號管標為標準對照，2號各加入化L FITC或PE標記的小鼠抗人細胞表面 分子CD59、CD45、CD34、CD105抗體工作液。室溫，避光，解育20min;PBS洗兩遍，W去除未結(jié)合 的抗體，500化1640培養(yǎng)基重懸后，上流式細胞儀鑒定表面標記。結(jié)果與圖2相近?？梢?，擴 增第3代的ADSCs CD73、CD90呈陽性表達，而HLA-DR、CD45呈陰性表達，符合干細胞的特性。
[0076] 3、富血小板血漿的制備
[0077] 加抗凝劑的靜脈血低溫高速離屯、，第一次離屯、3000轉(zhuǎn)4min，吸取上層血漿、白膜層 至另一抗凝劑采血管中。3000轉(zhuǎn)離屯、15min，吸去上層3/4貧血小板血漿(PPP)，余下1/4即為 富血小板血漿。分裝后-80°C保存。
[0078] 4、脂肪干細胞成骨分化誘導 [00巧]1)實驗分組：
[0080]對照組I:脂肪干細胞普通培養(yǎng)基組；
[0081 ]對照組2:商品化培養(yǎng)基誘導組；
[0082] 實驗組1:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5iig/mL Ca化erin-11組；
[0083] 實驗組2:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8 % PRP組；
[0084] 實驗組3:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5iig/mL Ca化erin-ll+8%PRP組。
[0085] 2)取第3代的ADSCs，吸出培養(yǎng)基后，加入0.25 %膜蛋白酶+0.02 %抓TA的消化液進 行消化，之后用適量血清終止消化。120化pm離屯、5min，脂肪干細胞完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密 度為1 X lOVmL，接種于6孔板中，每孔2mL。
[0086] 當細胞達到40%-50%融合時，分別應(yīng)用實驗分組所示培養(yǎng)基，同樣環(huán)境下誘導培 養(yǎng)，每3天更換誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后，部分細胞采用茜素紅進行染色，觀察形成巧結(jié)節(jié)的 情況；部分細胞用于抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，W此CDNA為模板，W上游引物： TCATAGCCTTACCTGGCATAG、下游引物：TGGACTTCATGGTGAAGGCAG(ALP);上游引物： TGCTGCTGAAACAAACACAC、下游引物：TGCTTAGATAAATAAGCCACTTTTC(runx2)為引物進行免疫 巧光定量PCR，其中be化-act in作為內(nèi)參，檢測成骨細胞標志蛋白ALP、;runx2的基因表達量。 最后根據(jù)根據(jù)得到的C(t)值，W誘導前細胞中基因的表達量為參照，計算誘導后細胞中目 的基因相對于誘導前的表達量。
[0087] 3)茜素紅染色結(jié)果與圖3相似，對照組1和誘導前細胞形態(tài)并無差別，細胞未被茜 素紅染色，說明脂肪干細胞并未向成骨細胞誘導分化;對照組2、實驗組1、實驗組2和實驗組 3中各有一部分細胞被茜素紅染成紅色，說明細胞誘導分化過程中形成巧結(jié)節(jié);而形成巧結(jié) 節(jié)的多少順序分別為:實驗組3、實驗組1、對照組2、實驗組2,說明和商品誘導液相比較，加 入Ca化erin-11和PRP的誘導液更易使細胞誘導分化，但是PRP單獨的誘導分化能力較弱，兩 者聯(lián)合使用既可提高誘導分化能力，又代替動