本發(fā)明屬于微生物鑒定培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是常見霉菌黃曲霉和寄生曲中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。主要毒素是B1、B2、G1和G2,其中B1是毒性和危害最大的一種,B2和G2是B1和G1的雙羥基衍生物。黃曲霉毒素是目前所知致癌性最強的化合物,廣泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕點等糧油食品和動物飼料中,嚴重影響人們的健康,甚至威脅著人們的生命安全。更重要的是,黃曲霉毒素與環(huán)境因素密切相關(guān),是一種天然的毒素,普通的食物處理方法不會減少黃曲霉毒素的含量,因此,國際上對黃曲霉毒素尤其是B1的限量要求日益嚴格,世界各國都對食品中的黃曲霉毒素的含量制定出了嚴格的限量標準。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法，本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測定花生糖中黃曲霉素的含量，降低了檢測成本，提高了檢測效率，滿足了檢疫標準確定量分析的需要。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種花生糖中黃曲霉毒素潛在污染的鑒定方法，包括如下具體步驟：
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，調(diào)節(jié)pH為6-8的范圍，之后倒入均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)5-10min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機溶液靜置一段時間，用濾紙吸去上層石油醚層，過濾后得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理20-30min，超聲功率800-1200w；
S5、將S3中得到的濾液稀釋，離心取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標準品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，培養(yǎng)一段時間后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液用酶標儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，黃曲霉素B1標準品的光密度值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取并計算花生糖中黃曲霉素B1含量。
進一步地，所述S1中過10-30目篩。
進一步地，S2中所述石油醚-甲醇混合溶液中石油醚和甲醇的體積比為1:6。
進一步地，所述S2中用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH。
進一步地，所述S3中靜置時間為30-60min。
進一步地，所述S5中加入等體積蒸餾水稀釋。
進一步地，所述S5中離心速率為1000-2000r/min，離心時間為5-10min。
進一步地，所述S6中培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)環(huán)境為避光環(huán)境，培養(yǎng)時間為20-40min。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測定花生糖中黃曲霉素的含量，超聲波的輻射壓強可以增大花生糖樣品中物質(zhì)分子運動頻率和速度，提高提取效率，本發(fā)明降低了檢測成本，提高了檢測效率，滿足了檢疫標準確定量分析的需要。
當然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。
具體實施方式
本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過10目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6，之后倒入均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)5min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機溶液靜置30min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾2次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理20min，超聲功率800w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于1000r/min離心機中離心5min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標準品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液用酶標儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，黃曲霉素B1標準品的光密度值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取并計算花生糖中黃曲霉素B1含量。
實施例2
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過30目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8，之后倒入均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)10min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機溶液靜置60min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾3次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理30min，超聲功率1200w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于2000r/min離心機中離心10min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標準品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液用酶標儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，黃曲霉素B1標準品的光密度值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取并計算花生糖中黃曲霉素B1含量。
實施例3
S1、稱取一定量的花生糖磨碎后過20目篩；
S2、將S1中磨碎的花生糖粉末加入石油醚-甲醇混合溶液中，其中，石油醚和甲醇的體積比為1:6，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為7，之后倒入均質(zhì)機內(nèi)均質(zhì)7min；
S3、將S2均質(zhì)后的花生糖有機溶液靜置45min，用濾紙吸去上層石油醚層后用濾紙過濾2次，得到花生糖甲醇提取液；
S4、將S3中得到的花生糖甲醇提取液于25℃條件下超聲處理25min，超聲功率1000w；
S5、將S3中得到的濾液加入等體積蒸餾水稀釋后，置于1500r/min離心機中離心7min，取上清液備用，得到黃曲霉素樣品；
S6、用移液槍分別移取100μL所述黃曲霉素樣品與等量黃曲霉素B1標準品至微孔條中，先分別加入200μL酶聯(lián)偶合物，之后在微孔條底部分別加入200μL抗體，于25℃避光條件下放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，加入100μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液；
S7、將S7中得到黃曲霉素待測液和黃曲霉素B1標準品待測液用酶標儀于450nm濾鏡與630nm示差濾鏡下讀取光密度值；
S8、根據(jù)S7中得到的光密度值，以黃曲霉素B1標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，黃曲霉素B1標準品的光密度值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取并計算花生糖中黃曲霉素B1含量。
本發(fā)明通過結(jié)合甲醇提取與酶聯(lián)免疫法測定花生糖中黃曲霉素的含量，超聲波的輻射壓強可以增大花生糖樣品中物質(zhì)分子運動頻率和速度，提高提取效率，本發(fā)明降低了檢測成本，提高了檢測效率，滿足了檢疫標準確定量分析的需要。
以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。