本發(fā)明涉及一種利用在磁編碼載體微球外面包覆金屬納米結構并產(chǎn)生局域表面等離子體，利用局域表面等離子共振效應增強熒光信號的編碼微球及其制備方法。

背景技術：

隨著生物醫(yī)學的迅速發(fā)展，在疾病檢測、藥物發(fā)現(xiàn)等領域都需要進行高通量的生物分析。雖然平面芯片技術被廣泛的應用在高通量分析中，他們在反應速度上有一定限制，在可重復性和可靠性上有一定局限性。懸浮陣列是另外一項替代策略，探針分子載體則可以自由散布到反應體系中，不受空間位置的限制。對于懸浮陣列，主要有兩個關鍵問題。一個是需要對流動載體進行編碼。近年來各種新型的編碼載體相繼出現(xiàn)并得到了廣泛應用。其中聚合物微球作為一種固相載體具有顯著的優(yōu)勢，比如比表面積大、可以通過攪拌等輔助手段加快反應速度、表面結合的分子在反應后可以從溶液分離出來等等。此外，目標分子的分析是懸浮載體技術中另一個重要部分,通常通過標記在生物分子上的標記物質來檢測。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題：本發(fā)明的目的是提供一種載體微球的熒光信號增強方式及其制備方法，這種聚合物編碼微球直徑在10μm～1000μm之間，可以作為高通量、高靈敏度生物分析的載體，制備方法簡單高效。

技術方案：一種金屬增強熒光信號的編碼微球，為殼核結構，內(nèi)核為磁性納米結構，外面包裹一層聚合物外殼，在聚合物外殼上分布顆粒狀或島狀的金屬納米結構；所述的金屬納米結構產(chǎn)生局域表面等離子體，且局域表面等離子體共振吸收峰的位置與待檢測熒光染料發(fā)射光譜的位置重疊，從而使熒光信號得到增強。

所述的金屬包括金、銀、鉑中任一種。

所述的金屬納米結構尺寸為30nm～300nm，金屬納米結構的間距為5nm～40nm。

所述的聚合物包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羥乙基酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇、聚(N-異丙基丙烯酰胺)中的一種或多種混合物。

所述的磁性納米結構包括四氧化三鐵、氧化鐵或其復合物。

所述的編碼微球直徑在10μm～1000μm之間，偏差在5％以內(nèi)；

制備所述的金屬增強熒光信號的編碼微球的方法，先采用協(xié)流式微控法制備聚合物包裹磁性納米結構得到磁編碼載體微球，再在載體微球上負載金屬納米結構，具體步驟為：

(1)用氨基硅烷修飾制備好的磁編碼載體微球；

(2)再接貴金屬納米種子：將第一步得到的修飾后的磁編碼載體微球放入貴金屬的酸性溶解液中，通過加熱或還原劑進行還原并吸附金種，在磁編碼載體微球表面得到貴金屬納米種子；

(3)最后將貴金屬的酸性溶解液與弱還原劑再次反應，最終在磁編碼載體微球表面生成相互之間有間隙的金屬納米結構并產(chǎn)生局域表面等離子體。

所述的還原劑包括氨水、硼氫化鈉、檸檬酸三鈉中的任意一種。

所述的弱還原劑包括羥胺、L-抗壞血酸、對苯二酚、臨苯三酚、1,2,4-苯三酚中的任意一種。

所述的金屬增強熒光信號的編碼微球在核酸、蛋白、細胞的檢測分析中的應用。

有益效果：本發(fā)明的金屬增強熒光編碼微球是通過表面的貴金屬納米結構產(chǎn)生局域表面等離子體，這些局域表面等離子體的共振吸收峰的位置與待檢測熒光染料的吸收光譜重疊，從而增強熒光的信號，提高檢測靈敏度。

本發(fā)明的編碼載體微球是將磁性納米結構包裹在聚合物微球內(nèi)部，通過包裹磁性納米結構的量的不同進而獲得以磁含量作為特征編碼的載體微球。

本發(fā)明的金屬增強熒光信號的編碼微球具有編碼、譯碼簡單、成本低、制作方便，檢測靈敏度高等優(yōu)點，可以應用于核酸、蛋白、細胞等多元生物分析領域。

附圖說明

圖1是本發(fā)明編碼載體微球的剖面示意圖。

其中，1代表顆粒或島狀金屬納米結構，2代表包裹有磁性納米結構的聚合物內(nèi)核。

圖2是本發(fā)明編碼載體微球的正面示意圖。

其中，1表顆粒或島狀金屬納米結構，3代表金屬納米結構的間隙。

圖3是編碼微球裝置示意圖。

其中，4代表液滴生成裝置的入口A，5代表液滴生成裝置的入口B，6代表液滴生成裝置的出口。

圖4是編碼微球檢測裝置示意圖

其中，7代表編碼微球的入口，8代表恒定均勻磁場的發(fā)生器，9代表磁含量較多的微球，10代表磁含量較少的微球，11代表磁含量更少的微球。

圖5是局域表面等離子體的共振吸收峰與熒光染料發(fā)射光譜關系示意圖(以熒光染料Cy5和IR800為例)。

其中，橫坐標代表波長，縱坐標代表吸光度，12代表局域表面等離子體的共振吸收峰，13代表Cy5的發(fā)射光譜，14代表IR800的發(fā)射光譜。

圖6是對于熒光染料IR800來說，以金納米結構作為表面等離子體，不同反應濃度情況下熒光增強效果的示意圖。

其中，橫坐標代表不同共振吸收的編碼載體，縱坐標代表熒光強度，15代表接金種濃度為300μM，長金濃度為400μM體的載體微球，16代表接金種濃度為200μM，長金濃度為400μM體的載體微球，17代表接金種濃度為300μM，長金濃度為300μM體的載體微球，18代表未修飾表面等離子體的載體微球。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。

本發(fā)明實施例提供如下技術方案：

如圖1所示，在一個實施例中，提供一種金屬增強熒光信號的編碼微球，編碼微球的內(nèi)核為包裹有磁性納米結構的聚合物微球，外殼為顆?；驆u狀的金屬納米結構。以磁性納米結構的含量作為載體的編碼，以局域表面等離子共振效應增強標記生物分子的熒光信號。

優(yōu)選的，所述的載體微球直徑在10μm～1000μm之間，偏差在5％以內(nèi)；

優(yōu)選的，所述的金屬增強熒光信號中金屬納米結構尺寸為30nm～300nm，金屬納米結構的間距為5nm～40nm

優(yōu)選的，所述的磁編碼載體微球為將磁性納米結構包裹在聚合物微球內(nèi)部，通過包裹磁性納米結構的量不同獲得以磁含量作為特征編碼的載體微球；

優(yōu)選的，所述載體微球表面金屬納米結構的局域表面等離子共振波長與熒光染料分子的吸收帶或發(fā)射帶一致時熒光得到增強；

優(yōu)選的，載體微球的金屬納米島結構長徑為100～300nm左右，寬度和間隙在10～30nm之間時，該載體對熒光染料IR800的熒光信號增強10倍以上。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的一個技術方案是：提供一種制備所述金屬增強熒光信號的編碼微球的方法，先采用協(xié)流式微控法制備聚合物包裹磁性納米結構得到磁編碼載體微球，再在載體微球上負載金屬納米結構，具體步驟為：

(1)用氨基硅烷修飾制備好的磁編碼微球；

(2)通過兩步法(①接貴金屬納米種子；②納米種子生長)，首先將貴金屬的酸性溶解液，如氯金酸(HAuCl₄)、氯鉑酸(H₂PtCl₆)、硝酸銀(AgNO₃)等通過加熱或還原劑如氨水(NH₃·H₂O)，硼氫化鈉(NaBH₄)，檸檬酸三鈉等進行還原并吸附金種；

(3)用硼氫化鈉(NaBH₄)還原金屬納米顆粒的種子；

(4)然后將貴金屬的酸性溶解液，如氯金酸(HAuCl₄)、氯鉑酸(H₂PtCl₆)、硝酸銀(AgNO₃)等與弱還原劑如羥胺(NH₂OH)、L-抗壞血酸、苯酚(如對苯二酚、臨苯三酚、1,2,4-苯三酚等)等再次反應，生成相互之間有間隙的金屬納米粒并產(chǎn)生局域表面等離子體。

采用協(xié)流式微控法制備聚合物包裹磁性納米結構得到磁編碼載體微球的方法參考申請?zhí)?016103480989，發(fā)明名稱為一種磁含量編碼的聚合物載體微球及其制備方法具體實施方式和實施例1中記載的方法，具體步驟為：

(1)將磁性納米結構均勻分散到聚合物溶液中或聚合物的前聚體中，其中的含量為聚合物的0.01～100％wt；

(2)通過注射泵向微球生成裝置的入口A中注入3％wt～10％wt的聚乙烯醇溶液或者甲基硅油或正十六烷；

(3)把含有磁性納米結構的聚合物溶液注入到生成裝置的入口B，使通過生成裝置的出口在聚乙烯醇溶液或者甲基硅油或正十六烷中分散成一個個微球，然后通過紫外光固化或熱固化得到大小均一的磁性微球；通過調(diào)節(jié)入口兩相的流速來控制磁編碼微球的大??；

優(yōu)選的，所述的磁編碼載體微球中聚合物的組成材料為聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)、聚甲基丙烯酸羥乙基酯(HEMA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇(PEG)、聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)中的一種或多種混合物，磁性納米結構為四氧化三鐵、氧化鐵及其復合物；

優(yōu)選的，所述液滴生成裝置為協(xié)流式微流控裝置，材料選用二氧化過硅、玻璃、特氟龍、聚二甲基硅氧烷的一種或多種。

采用磁含量計檢測的方法對不同編碼微球的磁含量進行檢測，達到解碼的目的，具體步驟為：

(1)在不同磁含量的編碼微球上接上不同抗體；

(2)通過雙抗夾心免疫熒光法，利用抗原，血清或組織液等進行反應；

(3)將反應結束后的編碼微球放入裝置內(nèi)；

(4)將裝置水平放置；

(5)通過注射泵將反應后混合在一起的編碼微球以恒定的速度注入通道內(nèi)；

(6)使編碼微球逐個流過磁含量計，磁含量計會根據(jù)微球磁含量的不同產(chǎn)生不同強度的響應信號，從而測出磁性納米粒子的量進行解碼。

實施例1三種不同編碼的載體微球的制備：

1.將平均粒徑為170nm的四氧化三鐵粒子分別按質量分數(shù)0.1％、0.5％、0.9％的比例加入到ETPTA中，并分散均勻，配置成三種不同磁性納米結構含量的ETPTA溶液；

2.通過注射泵向微球生成裝置的入口A中注入質量分數(shù)為4％的聚乙烯醇水溶液，入口B注入磁性納米結構含量為0.1％的ETPTA溶液，使通過生成裝置的出口在4％聚乙烯醇中分散成一個個微球，通過入口兩相的流速調(diào)節(jié)微球的大??；

3.通過紫外光照使微球聚合，得到磁含量為0.1％wt的聚合物載體微球；

4.重復步驟2，3，以同樣方法制備磁含量為0.5％wt和0.9％wt的聚合物載體微球。

實施例2三種不同共振吸收的載體微球的制備：

1.將平均粒徑為170nm的四氧化三鐵粒子分別按質量分數(shù)0.5％wt的比例加入到ETPTA中，并分散均勻，配置成三種不同磁性納米結構含量的ETPTA溶液；

2.通過注射泵向微球生成裝置的入口A中注入4％聚乙烯醇，入口B注入磁性納米結構含量為0.5％的ETPTA溶液，使通過生成裝置的出口在4％聚乙烯醇中分散成一個個微球，通過入口兩相的流速調(diào)節(jié)微球的大?。?/p>

3.通過紫外光照使微球聚合，得到磁含量為0.5％的聚合物載體微球；

4.用氨基硅烷修飾制備好的磁編碼微球；

5.將氨基修飾后的微球分別加入到200μM，300μM，400μM的氯金酸溶液中，加入一定量的氨水，劇烈反應，通過調(diào)節(jié)氯金酸濃度可以改變金納米結構的間隙；

6.將在200μM氯金酸中反應的磁性載體微球取出，用NaBH₄還原；

7.將步驟6中還原后的磁性載體微球取出，加入到400μM的氯金酸溶液中，加入等量的NH₂OH促使金納米結構生長，形成局域表面等離子體。通過調(diào)節(jié)氯金酸的濃度和反應時間可以控制金納米結構的尺寸及形貌；

8.重復步驟6，7，以同樣方法制備得到接金種濃度為300μM和400μM、磁含量為0.5％的聚合物載體微球。

實施例3三種不同編碼的載體微球的解碼與檢測：

1.將磁含量為0.5％、1％、1.5％的編碼微球通過免疫熒光反應接上相應的抗原(待測物)，抗體(熒光標簽為IR800)；

2.將反應后的編碼微球通過注射泵以恒定的速度注入毛細管內(nèi)；

3.編碼微球逐個流過磁含量計，測出磁性納米粒子的量進行解碼；

4.同時對編碼微球的熒光強度進行檢測，從而檢測出待測抗原的濃度。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。