本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖加工技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種銅藻中巖藻黃質(zhì)的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

銅藻，褐藻屬，主要分布在北太平洋西部海域，在我國(guó)資源十分豐富。自古以來(lái)，銅藻就一直作為中藥被利用，但目前關(guān)于其具有生物活性的化學(xué)成分的研究還比較少。最近幾年，由于氣候等綜合原因，銅藻已經(jīng)出現(xiàn)了爆發(fā)性增殖，怎么將他們“廢物利用”，成為我們研究它們最好的契機(jī)。

巖藻黃質(zhì)，又稱巖藻黃素或褐藻素，是胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類，是一種對(duì)人類十分有利的活性物質(zhì)。在自然界中，巖藻黃質(zhì)廣泛存在于藻類和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，尤其是褐藻綱和硅藻綱的藻類含量更為豐富，褐藻中巖藻黃質(zhì)的含有量占自然界中類胡蘿卜素總產(chǎn)量的10%以上。

現(xiàn)有的海藻中巖藻黃質(zhì)檢測(cè)方法多為分光光度法，前處理?xiàng)l件相對(duì)復(fù)雜、繁瑣，且干擾因素多，結(jié)果準(zhǔn)確度不夠，針對(duì)的基質(zhì)為海帶、裙帶菜等藻類，目前尚無(wú)一種針對(duì)銅藻中巖藻黃質(zhì)的快速、高效的測(cè)定方法。并且對(duì)于銅藻的預(yù)處理，通常使用冷凍干燥的方式處理，在經(jīng)過破碎，將粉末分散于有機(jī)溶劑中浸取巖藻黃質(zhì)，但是這種方法在溫度較低、時(shí)間較短以及浸取液的量較少的情況下，都會(huì)使浸出量較少，極大的影響了測(cè)定值的精確度，并且干燥過程，以及后續(xù)升溫浸出的工藝，均會(huì)使自身穩(wěn)定性較差的巖藻黃質(zhì)變性及分解。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中前處理?xiàng)l件繁瑣，測(cè)定結(jié)果不精確的缺點(diǎn)，提供一種快速有效并且精確的銅藻中巖藻黃質(zhì)的測(cè)定方法。

本發(fā)明的方案是一種銅藻中巖藻黃質(zhì)的測(cè)定方法，其特征在于：使用高效液相色譜法測(cè)定，包括如下操作步驟：

（1）銅藻預(yù)處理：將新鮮的銅藻用清水洗凈，低溫冷凍后，使用超高轉(zhuǎn)速破碎機(jī)破碎，過篩網(wǎng)，密封避光儲(chǔ)存于-20℃冰箱中；

（2）配制巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取0.01g巖藻黃質(zhì)，精確至0.0001g，用丙酮定容至100ml，配置為100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；

（3）配制巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：取上步巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度范圍為0.02~10μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（4）樣品處理：稱取粉碎后的樣品0.5g置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取10-40min，放入離心機(jī)中離心提取5-20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液；

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取若干份濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行進(jìn)樣分析，繪制出進(jìn)樣濃度與峰面積的線性曲線；

（6）濃度測(cè)試：對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度；

（7）計(jì)算：試樣中巖藻黃質(zhì)的含量按下式計(jì)算，結(jié)果保留三位有效數(shù)字：

x=（c*v）/m

式中：x——試樣中巖藻黃質(zhì)的含量，單位為毫克每克（mg/g）；

c——由線性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的巖藻黃質(zhì)濃度，單位為毫克每毫升（mg/ml）；

v——試樣提取液最終定容體積，單位為毫升（ml）；

m——稱取的試樣質(zhì)量，單位為克（g）。

進(jìn)一步的，所述的低溫冷凍為-20℃以下溫度冷凍或直接浸泡于液氮中，將銅藻冷凍至脆硬狀態(tài)，更有利于研磨破碎，并且，有利于抑制破碎時(shí)的摩擦升溫，但浸泡時(shí)間不超過30s。

進(jìn)一步的，所述的超高轉(zhuǎn)速破碎機(jī)的轉(zhuǎn)速為16000~30000轉(zhuǎn)/分鐘，破碎后的銅藻過325目或以上目數(shù)的篩網(wǎng)。超高轉(zhuǎn)速的破碎機(jī)，更有利于銅藻細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)充分逸出。過篩，保證銅藻被粉碎至足夠的細(xì)度。

進(jìn)一步的，銅藻預(yù)處理、標(biāo)準(zhǔn)貯備液、標(biāo)準(zhǔn)工作液、試樣提取液的制備與貯存為避光條件。

進(jìn)一步的，色譜條件為色譜柱：develosilc30-ug-5,250mm×4.6mm（i.d.），5μm；流動(dòng)相：甲醇-乙腈溶液（49∶51，v∶v）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μl。

進(jìn)一步的，離心提取時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000-5000r/min。

進(jìn)一步的，所述實(shí)驗(yàn)試劑，甲醇、乙腈、丙酮為色譜純，乙醇為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

由于采用了上述技術(shù)方案，提供的一種銅藻中巖藻黃質(zhì)的測(cè)定方法，不僅能夠使前處理?xiàng)l件簡(jiǎn)單快速，并且能夠準(zhǔn)確的通過液相色譜法測(cè)出銅藻中巖藻黃質(zhì)的含量，并且本發(fā)明提供的前處理方式測(cè)得的巖藻黃質(zhì)含量值不像其他方式那樣，受提取溫度，提取時(shí)間甚是提取液料液比產(chǎn)生較大影響，同時(shí)高效液相色譜法保證了測(cè)量的精準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

為了更好地闡明本發(fā)明，下面提供具體的實(shí)施例和對(duì)比例，但本發(fā)明的應(yīng)用不僅限于實(shí)施例所列舉的范圍。

下述對(duì)比例與實(shí)施使用通用的樣品以及標(biāo)準(zhǔn)貯備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液，因此首先進(jìn)行本發(fā)明的前三部操作。

（1）銅藻預(yù)處理：取一定量的新鮮銅藻，將新鮮的銅藻用清水洗凈，擦干表面殘水后，將銅藻浸入液氮中持續(xù)30秒，低溫冷凍后，將銅藻放入破碎機(jī)中，使用超高轉(zhuǎn)速破碎機(jī)破碎，破碎后的藻漿，完全通過325目篩網(wǎng)，過濾后的成品即為前處理后的樣品，將樣品密封避光儲(chǔ)存于-20℃冰箱中；

（2）配制巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取0.01g巖藻黃質(zhì)，精確至0.0001g，用丙酮定容至100ml，配置為100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；

（3）配制巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：取上步巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度范圍為0.02~10μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液,為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，可以配置盡可能多的標(biāo)準(zhǔn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)施例一、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例二、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫30℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例三、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫40℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例四、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫50℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例五、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫60℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

通過對(duì)實(shí)施例一到五的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得到下表：

由表格可以看出隨著提取溫度升高，同樣的樣品測(cè)得的巖藻黃質(zhì)含量并未出現(xiàn)明顯變化，由此可見，本發(fā)明提供的制樣方法，能夠克服溫度對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致。

實(shí)施例六、稱取粉碎后的樣品0.4g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例七、稱取粉碎后的樣品0.3g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例八、稱取粉碎后的樣品0.2g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例九、稱取粉碎后的樣品0.1g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十、稱取粉碎后的樣品0.05g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，精確至0.01g，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中離心提取4000r/min速度20min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例六到實(shí)施例十保證定容乙醇一定，減少樣品量，相當(dāng)于增加提取液料比，通過最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，隨著液料比的增加，并未出現(xiàn)巖藻黃質(zhì)測(cè)得量大幅變動(dòng)的狀況，由此可見，本發(fā)明提供的制樣方法，能夠克服提取液料比對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致。

實(shí)施例十一、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取40min，放入離心機(jī)中6000r/min離心20min，將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十二、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取30min，放入離心機(jī)中6000r/min離心20min，將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十三、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取20min，放入離心機(jī)中6000r/min離心10min將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十四、稱取粉碎后的樣品0.5g精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取10min，放入離心機(jī)中,6000r/min離心10min，將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十五、稱取粉碎后的樣品0.5精確至0.01g，置于50ml塑料離心管中，在恒溫20℃環(huán)境下，加入40ml60%的乙醇溶液，超聲提取10min，放入離心機(jī)中,6000r/min離心5min，將提取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶，定容至50ml，過0.45μm微孔濾膜制得試樣提取液，對(duì)試樣提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)得峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到試樣提取液巖藻黃質(zhì)濃度。

實(shí)施例十一到實(shí)施例十五在保證其他條件不變的條件下，減少超聲提取的時(shí)間和離心機(jī)離心的時(shí)間，通過最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，提取時(shí)間減少，并未出現(xiàn)巖藻黃質(zhì)測(cè)得量大幅變動(dòng)的狀況，由此可見，本發(fā)明提供的制樣方法，能夠克服提取時(shí)間對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，保證檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致。特別是實(shí)施例十五可見，即使超聲提取10min，離心提取5min，仍具有準(zhǔn)確的提取測(cè)量結(jié)果。更加能證明本方法的快捷準(zhǔn)確測(cè)量的效果。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。