本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用高效液相測(cè)定沸石分子篩抗菌劑抗菌機(jī)理的方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)今在抗菌技術(shù)發(fā)展速度非常之快，對(duì)于層出不窮的抗菌物質(zhì)，我們需要逐一對(duì)其的抗菌機(jī)理進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的抗菌機(jī)理分析速度慢，對(duì)于材料的消耗也比較多，亟待優(yōu)化。所以在抗菌劑抗菌機(jī)理的研究方面，我們針對(duì)細(xì)菌代謝所需蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，建立結(jié)合高效液相法分析蛋白質(zhì)含量的方法，從側(cè)面研究抗菌劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用高效液相法檢測(cè)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的粗酶液，研究不同濃度沸石分子篩抗菌劑對(duì)細(xì)菌菌體蛋白含量的影響。

具體步驟為：

(1)沸石分子篩抗菌劑為自制，p型分子篩：殼聚糖：二甲酸鉀：＝3：1：2合成沸石分子篩抗菌劑，主要是二甲酸鉀起到抗菌作用。

(2)配制含二甲酸鉀濃度為0～96mg/ml的沸石分子篩抗菌劑溶液。

(3)根據(jù)(2)，每種菌增加3個(gè)空白對(duì)照組后，配制普通液體的培養(yǎng)基，并滅菌。再加入處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌按每100ml培養(yǎng)基接種2ml菌懸液，然后分別加入抗菌劑5ml并做好標(biāo)記后轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

(4)取(3)培養(yǎng)液用普通液體培養(yǎng)基稀釋100倍，再放入37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～18h，測(cè)od600為3.6左右，停止培養(yǎng)。

(5)取(4)培養(yǎng)液，5000r/min離心15min，取沉淀加入0.05mol/lph7.0的磷酸鉀緩沖液，超聲(120w15min)處理。菌體溶液于4℃、10000r/min離心30min，棄去上清液，以0.05mol/lph7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌沉淀物兩次后，再將沉淀重新混入同樣的溶液中，反復(fù)凍融破壞細(xì)菌菌體，然后4℃、10000r/min、60min離心3次，獲得上清液即為粗酶液，過膜處理后進(jìn)行hplc檢測(cè)。

(6)根據(jù)(2)，在增加3個(gè)空白對(duì)照組后，共需配制21個(gè)100ml普通液體培養(yǎng)基，并滅菌。再將大腸桿菌菌懸液按每個(gè)培養(yǎng)基2ml量接種，并加入頭孢西丁100mg誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生，轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)共12小時(shí)后，取出將培養(yǎng)基擴(kuò)充到200ml再加入(2)沸石分子篩抗菌劑不同濃度，并做好標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。

(7)β內(nèi)酰胺酶粗酶液的提?。悍椒ㄍ?5)獲得的粗酶液。將粗酶液冷凍濃縮后用nitrocefin試紙檢測(cè)粗酶液中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。

(8)大腸桿菌色譜條件：色譜柱：agilenttc-c18(150mm×4.6mm)或supelcosillc-18-db(250mm×4.6mm)；流動(dòng)相為：a為0.05mol/l磷酸二氫鉀溶液；b為甲醇；梯度洗脫：0～5min，b：10％～15％；5～12min，b：15％～25％；12～25min，b：25％～55％。檢測(cè)uv：220nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：25μl；柱溫：30℃。

(9)金黃色葡萄球菌色譜條件：色譜柱：agilenttc-c18(150mm×4.6mm)或supelcosillc-18-db(250mm×4.6mm)，粒徑3.5μm；流動(dòng)相為水：乙腈＝1:3；流速：1.0ml/min。檢測(cè)uv：254nm；進(jìn)樣量：20μl，檢測(cè)時(shí)間：20min；柱溫：30℃。

(10)分別對(duì)0～96mg/ml沸石抗菌劑和二甲酸鉀溶液作用的大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶和金黃色葡萄球菌粗酶液進(jìn)行高效液相檢測(cè)，得到每組高效液相峰面積。

本發(fā)明操作簡單，靈敏度高，樣品用量少，速度快。隨著抗菌劑濃度的增加，hplc峰面積減少，蛋白含量降低，說明細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化甚至是結(jié)構(gòu)完全被破壞，細(xì)胞代謝和生長受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌無法正常生存，從而達(dá)到抑菌殺菌的目的。

附圖說明

圖1粗酶液在nitrocefin試紙顯色。

圖2二甲酸鉀對(duì)β-內(nèi)酰胺酶影響hplc峰面積柱狀圖。

圖3抗菌劑對(duì)β-內(nèi)酰胺酶影響hplc峰面積柱狀圖。

圖4二甲酸鉀對(duì)金葡菌菌體蛋白影響hplc峰面積柱狀圖。

圖5抗菌劑對(duì)金葡菌菌體蛋白影響hplc峰面積柱狀圖。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1：沸石分子篩抗菌劑對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)理

(1)大腸桿菌菌種的擴(kuò)增：配制200ml液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)ph至7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌。后按照每100ml接種一環(huán)的量接種細(xì)菌搖勻。轉(zhuǎn)移至37℃震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。

(2)配濃度為0mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml、48mg/ml、96mg/ml的含二甲酸鉀濃度為以上的沸石分子篩抗菌劑和二甲酸鉀溶液，各3組。

(3)擴(kuò)大培養(yǎng)及抑菌實(shí)驗(yàn)：根據(jù)(2)，在增加3個(gè)空白對(duì)照組后，共需配制21個(gè)100ml普通液體培養(yǎng)基，并滅菌。再將(1)菌懸液按每瓶2ml量接種，并加入頭孢西丁100mg，轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)共12小時(shí)后，取出將培養(yǎng)基擴(kuò)充到200ml再加入(2)沸石分子篩抗菌劑不同濃度5ml，并做好標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。

(4)β內(nèi)酰胺酶粗酶液的提取：將(3)5000r/min離心15min，取沉淀加入0.05mol/lph7.0的磷酸鉀緩沖液，超聲(120w15min)處理。菌體溶液液于4℃、10000r/min離心30min，棄去上清液，以0.05mol/lph7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌沉淀物兩次后，再將沉淀重新混入同樣的溶液中，反復(fù)凍融破壞細(xì)菌菌體，然后4℃、10000r/min、60min離心3次，獲得上清液即為粗酶液。將粗酶液冷凍濃縮后用nitrocefin試紙檢測(cè)粗酶液中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。

(5)nitrocefin試紙檢測(cè)β內(nèi)酰胺酶方法：將頭胞硝噻吩(nitrocefin)試紙片置于干凈的平皿內(nèi)，將濃縮后的粗酶液少量滴在試紙表面，觀察紙片有無顏色變化。紙片顏色由無色變?yōu)榉奂t色則表示粗酶液中含有β-內(nèi)酰胺酶，見圖1。

(6)取純的β內(nèi)酰胺酶，配制10mg/ml的純酶標(biāo)準(zhǔn)液20ml，然后按照1ml每樣的規(guī)格取樣18份，再按每組3個(gè)進(jìn)樣小瓶，分成6組，待用。取(2)中二甲酸鉀溶液，按照200μl的量加入到對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣小瓶中，于4℃靜置20分鐘，然后進(jìn)行高效液相檢測(cè)。

(7)色譜條件：色譜柱：agilenttc-c18色譜柱(150mm×4.6mm)；流動(dòng)相為：a為0.05mol/l磷酸二氫鉀溶液；b為甲醇；梯度洗脫：0～5min，b：10％～15％；5～12min，b：15％～25％；12～25min，b：25％～55％。檢測(cè)uv：220nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：25μl；柱溫：30℃。結(jié)果見圖2和圖3。隨著抗菌劑和二甲酸鉀濃度的增加hplc峰面積減少，蛋白質(zhì)含量降低，說明菌體蛋白結(jié)構(gòu)變化甚至是結(jié)構(gòu)完全被破壞，細(xì)胞代謝和生長受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌無法正常生存，從而達(dá)到抑菌殺菌的目的。

實(shí)施例2：沸石分子篩抗菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理

(1)配制濃度為0mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml、48mg/ml、96mg/ml的二甲酸鉀溶液，各3組。

(2)根據(jù)(1)的分組數(shù)量，增加3個(gè)空白對(duì)照組，配制普通液體培養(yǎng)基各100ml，并滅菌。再分別接入處于對(duì)數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌菌懸液2ml，后加入(1)抗菌劑5ml并做好標(biāo)記后轉(zhuǎn)移至37℃振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)。取培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌懸液用液體培養(yǎng)基稀釋100倍，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)12～18h，生長至od600為3.6左右，取出5000r/min離心15min。沉淀加入0.05mol/lph7.0磷酸鉀鹽緩沖液，再超聲(120w15min)處理。菌懸液于4℃10000r/min離心30min，棄去上清液，以0.05mol/lph7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌沉淀物兩次后，再將沉淀重新混入同樣的溶液中，反復(fù)凍融破壞細(xì)菌菌體，然后4℃10000r/min離心60min3次，獲得的上清液即為粗酶液，過膜處理后進(jìn)行hplc檢測(cè)。

(3)色譜條件：色譜柱：supelcosillc-18-db，250mm×4.6mm，粒徑3.5μm；流動(dòng)相：水：乙腈＝1:3；流速：1.0ml/min。檢測(cè)uv：254nm；進(jìn)樣量：20μl，檢測(cè)時(shí)間：20min；柱溫：30℃。結(jié)果見圖4、圖5。隨著抗菌劑和二甲酸鉀濃度的增加hplc峰面積減少，蛋白質(zhì)含量降低，說明菌體蛋白結(jié)構(gòu)變化甚至是結(jié)構(gòu)完全被破壞，細(xì)胞代謝和生長受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌無法正常生存，從而達(dá)到抑菌殺菌的目的。