本發(fā)明涉及醫(yī)藥分析檢測領域，更具體地涉及一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法。
背景技術：
：替諾福韋艾拉酚胺，其結構式如下：替諾福韋艾拉酚胺，英文名字為tenofoviralafenamide，為吉利德(gilead)公司推出的一個抗艾滋病毒和乙肝病毒的替諾福韋的前藥(代號gs-7340)。替諾福韋艾拉酚胺是一個含有3個手性中心化合物，其理論上應該有7個光學異構體(其中3對非對映異構體，1個對映異構體)，均為雜質。在現(xiàn)有的合成工藝中，如wo2002008241a2公開的路線中，替諾福韋艾拉酚胺的對映異構體是通過在2個引入手性的起始物料pmpa(替諾福韋)和l-丙氨酸分別進行了控制，因此在替諾福韋艾拉酚胺中存在對映異構體的含量在制備過程中就得到了有效控制。然而，替諾福韋艾拉酚胺的其他6個非對映異構體及其雜質則沒有得到有效的控制。在醫(yī)藥領域中，對化學藥品的雜質的控制關乎到藥品的質量和使用安全，因此對化學藥品的有關物質進行準確地分析檢測，控制其含量是非常有意義的。cn01813161a1核苷酸膦酸酯類似物前藥及其篩選和制備方法中公開了一種采用反相hplc分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其一個非對映異構體的分析方法。該分析方法采用phenomenexlunac185μm，100a°(或等效色譜柱)；保護柱是pellicularc18(或等效色譜柱)；流動相是，a相含有0.02％磷酸(85％)的水-乙腈(95:5)溶液，b相是含有0.02％磷酸(85％)的水-乙腈(50:50)溶液；梯度洗脫如下：操作時間：50min；平衡延遲：在100％流動相a的條件下為10min；流速：1.2ml/min；溫度：室溫；檢測：uv260nm；樣品溶液：20mmol/l磷酸鈉緩沖溶液，ph6。所述方法能夠有效地分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其中之一的非對映異構體，但是其未能同時有效地分離檢測其他的非對映異構體，以及存在的其他有關物質。在目前的替諾福韋艾拉酚胺分析檢測方法中，沒有提供一種簡便的，準確的，可靠的，能同時檢測替諾福韋艾拉酚胺及其3對非對映異構體以及其它有關物質的方法。因此開發(fā)一種能解決以上技術問題的分析方法，有效控制替諾福韋艾拉酚胺的藥品質量是非常有意義和必要的。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明概述本發(fā)明提供一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的分析方法，該方法能夠同時分離檢測替諾福韋艾拉酚胺、3對非對映異構體以及其他有關物質。本發(fā)明中所述的3對非對映異構體分別表示為異構體1、異構體2和異構體3。本發(fā)明所述的異構體1、異構體2和異構體3可能包含分別如下：即，異構體1、異構體2或異構體3分別如上表格中所表示。另外本發(fā)明所述的其他有關物質至少包含以下所示的雜質a、雜質b、雜質c和/或雜質d，本發(fā)明人經(jīng)過長期的實驗研究和嘗試，意外地發(fā)現(xiàn)采用特定填料的色譜柱，十八烷基鍵合亞乙基橋雜化硅膠色譜柱(如xbridgebehc18)，對替諾福韋艾拉酚胺樣品進行檢測，能夠有效地分離檢測替諾福韋艾拉酚胺、異構體1、異構體2、異構體3以及其他有關物質(如雜質a、雜質b、雜質c和雜質d等)。術語定義本發(fā)明中，除另有說明外，“％”均指質量百分比。本發(fā)明中，除另有說明外，所用到的水或所指的水溶液是指分析領域通常所使用分析用水，包括但不限于純化水、超純水、去離子水等。本發(fā)明中，無論在具體數(shù)值之前是否有“約”表示，都是指該具體數(shù)值的可以在本領域認可的范圍內波動，具體地可以是具體數(shù)值的絕對值±10％內波動。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法，所述方法采用十八烷基鍵合亞乙基橋雜化硅膠色譜柱，a相可以是ph值1.0～7.0的緩沖鹽溶液或緩沖鹽溶液與一定比例的有機溶液(如，甲醇、乙醇或異丙醇等)的混合液，b相是甲醇、乙醇或異丙醇，進行梯度洗脫樣品，采用紫外檢測器進行檢測。本發(fā)明提供的分析方法中，所述的十八烷基鍵合亞乙基橋雜化硅膠色譜柱可以是xbridgebehc18。具體地，所述的xbridgebehc18具體規(guī)格可以是直徑1mm～4.6mm，柱長30mm～250mm，粒徑1.7～10μm，如xbridgebehc18，4.6×75mm，2.5μm。根據(jù)本領域公知常識，本領域普通技術人員可以根據(jù)需要，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，為了獲得更好的實驗效果，或根據(jù)實驗檢測環(huán)境的變化等因數(shù)選用其他具體規(guī)格的xbridgebehc18色譜柱，以實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。僅是xbridgebehc18色譜柱在規(guī)格上的變化，屬于等同的色譜柱，不會影響本發(fā)明技術方案的實現(xiàn)所要解決的技術問題。本發(fā)明提供的分析方法中，所述的緩沖鹽溶液是ph值為1.0～7.0的銨鹽水溶液或磷酸二氫鈉和高氯酸鈉的水溶液，所述的銨鹽包括但不限于磷酸氫二銨、磷酸銨、甲酸銨和醋酸銨中的一種或幾種。更具體地，本發(fā)明提供一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法，所述方法采用xbridgebehc18色譜柱，a相可以是ph值1.0～7.0的緩沖鹽溶液或緩沖鹽溶液與一定比例的有機溶液(如，甲醇、乙醇或異丙醇等)的混合液，b相是甲醇、乙醇或異丙醇，進行梯度洗脫樣品，采用紫外檢測器進行檢測；其中所述的緩沖鹽溶液可以是磷酸氫二銨、磷酸銨、甲酸銨和醋酸銨中的一種或幾種的水溶液或者是磷酸二氫鈉和高氯酸鈉的水溶液；其中色譜柱溫度可以是15℃～40℃；流動相流速是0.3ml/min～1.5ml/min；紫外檢測器檢測波長220nm～280nm。經(jīng)過多次的實驗研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當采用高濃度的緩沖鹽溶液時(銨鹽或磷酸氫二鈉與高氯酸鈉水溶液)，本發(fā)明所述的分析方法的待測樣品的色譜峰的峰型更好。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法采用xbridgebehc18，4.6×75mm，2.5μm。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法在方法運行時色譜柱溫度是24℃。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法的a相可以是ph值2.0～5.0的濃度為30mmol/l～300mmol/l或30mmol/l～100mmol/l的磷酸氫二銨水溶液；或者可以是所述磷酸氫二銨水溶液與有機溶液(如甲醇、乙醇或異丙醇等)的混合溶液，體積比可以是100:0～80:20。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法的a相可以是ph值2.0～5.0的濃度為5mmol/l～50mmol/l或5mmol/l～20mmol/l的磷酸氫二鈉和濃度為30mmol/l～500mmol/l或30mmol/l～150mmol/l高氯酸鈉水溶液；或者可以是所述磷酸二氫鈉和高氯酸鈉水溶液與有機溶液(如甲醇、乙醇或異丙醇等)的混合溶液，體積比可以是100:0～80:20。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法的流動相的流速是0.3ml/min～1.5ml/min。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法的梯度洗脫程序是：時間，mina相，％，體積比b相，％，體積比01000210008663429594131544642435750435755227855.11000601000在一些實施例中，本發(fā)明所述的一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法，其特征是：色譜柱：xbridgebehc18，4.6×75mm，2.5μm；檢測器：uv檢測器，檢測波長260nm；流速：0.6ml/min；柱溫：24℃；流動相：a相：磷酸氫二銨水溶液:甲醇＝97:3，體積比，其中所述的磷酸二氫銨水溶液的ph值是約2.5，濃度是約70mmol/l；b相：甲醇或乙醇；梯度程序如下：在一些實施例中，本發(fā)明所述的一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法，其特征是：色譜柱：xbridgebehc18，4.6×75mm，2.5μm；檢測器：uv檢測器，檢測波長260nm；流速：0.7ml/min；柱溫：24℃；流動相：a相：磷酸氫二鈉與高氯酸鈉水溶液:甲醇＝95:5，體積比；b相：甲醇或乙醇；梯度程序如下：時間，mina相，％，體積比b相，％，體積比01000210008663429594131554542445650445655227855.11000601000其中，磷酸氫二鈉與高氯酸鈉水溶液：取約1.36g磷酸二氫鈉，約10.5g高氯酸鈉，加入1000ml水，溶解并混合均勻，調節(jié)ph值到2.5。在一些實施例中，在本發(fā)明所述的方法，其中供試品溶液的配制是采用稀釋液溶解并稀釋樣品配制所得，供試品溶液的濃度可以是0.2mg/ml～5.0mg/ml或者是約0.7mg/ml。其中稀釋液可通過取約1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，調ph至5.5～7.5之間而制得。經(jīng)過多次試驗篩選，本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的分析檢測中，稀釋液的ph為5.5～7.5時所配置的供試品溶液具有更好的穩(wěn)定性，使得分析檢測的精密度、回收率以及耐用性更佳，分析檢測結果更加準確可靠。本發(fā)明所述的方法簡便、準確、靈敏度高，能夠同時分離檢測替諾福韋艾拉酚胺的3對非對映異構體及其他有關物質。特別地，但不限于，適用于分離檢測替諾福韋艾拉酚胺、異構體1、異構體2、異構體3、雜質a、雜質b、雜質c和/或雜質d。附圖說明圖1示實施例1中的空白溶液的色譜圖圖2示實施例1中的供試品溶液的色譜圖圖3示實施例2中的供試品加標溶液的色譜圖圖4示實施例3中的供試品加標溶液的色譜圖圖5示實施例4中的酸降解試驗溶液的色譜圖圖6示實施例5中的堿降解試驗溶液的色譜圖圖7示實施例6中的氧化降解試驗溶液的色譜圖圖8示實施例7中的光照降解試驗溶液的色譜圖圖中色譜峰的標號分別代表樣品中的組分如下：色譜峰標號代表的待測組分1富馬酸2雜質a3雜質d4雜質b5異構體1或異構體26異構體37替諾福韋艾拉酚胺8異構體1或異構體29雜質c其中，所述的色譜峰5或8不同時是異構體1或異構體2。具體實施方式為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面進一步披露一些非限制實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明所使用的試劑均可以從市場上購得或者可以通過本發(fā)明所描述的方法制備而得。以下實施例中所用的分析試劑均為分析純試劑，作為流動相的有機溶液采用色譜級純度的有機溶液，分析用水屬于純化水。實施例1色譜條件：美國agilent1260型高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；色譜柱：xbridgebehc18(75×4.6mm，2.5μm)；紫外檢測波長：260nm；流速：0.6ml/min；柱溫：24℃；進樣體積：10μl；流動相：磷酸二氫銨水溶液：取9.2g磷酸二氫銨，加入1000ml水，用磷酸調ph至2.5，搖勻，用0.22μm濾膜過濾，脫氣；a相：磷酸二氫銨水溶液:甲醇＝97:3，體積比；b相：甲醇；洗脫程序如下：時間，mina相，％，體積比b相，％，體積比01000210008663429594131544642435750435755227855.11000601000溶液配制：稀釋溶液或空白溶劑：取1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用氫氧化鉀溶液調ph至6.5。供試品溶液：取富馬酸替諾福韋艾拉酚胺供試品約35mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加入適量的稀釋溶液(約三分之二容量瓶體積)，超聲溶解，然后再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。分別取空白溶液和供試品溶液，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖1、圖2。圖1表明空白溶劑無干擾；圖2中保留時間約25min色譜峰是富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的色譜峰，可見，富馬酸替諾福韋艾拉酚胺色譜峰和周圍雜質分離情況良好，并且有較高的色譜純度，本法可以用于富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的質量監(jiān)測。實施例2色譜條件：儀器與條件同實施例1。溶液配制：非對映異構體溶液：取約5mg替諾福韋艾拉酚胺非對映異構體(含有3個替諾福韋艾拉酚胺非對映異構體)，置100ml容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度。供試品溶液：取樣品富馬酸替諾福韋艾拉酚胺約51.30mg樣品，精密稱定至50ml容量瓶中，加水溶解定容。供試品加標溶液：取約2ml富馬酸替諾福韋艾拉酚胺供試品溶液，加入約3滴上述非對映異構體溶液混合均勻，即得。取供試品加標溶液，照實施例1的色譜條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖3。圖3表明富馬酸替諾福韋艾拉酚胺及其非對映異構體雜質(共3個峰，標示為“5”，“6”，“8”)能有效分離，并且能和其他有關物質(如中間體雜質、工藝雜質和富馬酸)色譜峰有效分離。實施例3色譜條件：美國agilent1260型高效液相色譜系統(tǒng)及工作站；色譜柱：xbridgebehc18(75×4.6mm，2.5μm)；紫外檢測波長：260nm；流速：0.7ml/min柱溫：24℃；進樣體積：10μl。流動相：磷酸二氫鈉與高氯酸鈉水溶液：取1.36g磷酸二氫鈉，10.5g高氯酸鈉，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用磷酸調節(jié)ph值到2.5，搖勻，用0.22μm濾膜過濾，脫氣；a相：磷酸二氫鈉與高氯酸鈉水溶液:甲醇＝95:5，體積比；b相：甲醇；洗脫程序：時間，mina相，％，體積比b相，％，體積比01000210008663429594131554542445650445655227855.11000601000溶液配制：供試品加標溶液配制方法同實施例1。取供試品加標溶液，照實施例1的色譜條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖4。圖4表明富馬酸替諾福韋艾拉酚胺和其非對映異構體雜質(共3個峰，標示為“5”，“6”，“8”)能有效分離，并且能和其他有關物質(如中間體雜質、工藝雜質和富馬酸)色譜峰有效分離。實施例4色譜條件：色譜條件如實施例1。溶液配制：稀釋溶液或空白溶劑：取1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用氫氧化鉀溶液調ph至6.5。酸降解試驗溶液：取富馬酸替諾福韋艾拉酚胺供試品350mg，精密稱定至100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液10ml于50ml量瓶，加入25ml稀釋劑搖勻，再加入5ml0.1mol/l鹽酸溶液搖勻，放置4h，加5ml0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中和，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即進樣進行檢測；取酸降解試驗溶液，照實施例1的色譜條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖5。圖5表明富馬酸替諾福韋艾拉酚胺和酸降解雜質能有效分離，說明本法可以有效檢測出富馬酸替諾福韋艾拉酚胺酸降解雜質及其他潛在雜質，能有效控制富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的有關物質。實施例5色譜條件：色譜條件如同實施例1。溶液配制：稀釋溶液或空白溶劑：取1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用氫氧化鉀溶液調ph至6.5。堿降解試驗溶液：取富馬酸替諾福韋艾拉酚胺供試品350mg，精密稱定至100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液10ml于50ml量瓶，加入1ml0.2mol/l氫氧化鈉溶液搖勻，放置10h，加入等量的0.2mol/l的鹽酸中和后，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即進樣進行檢測；取堿降解試驗溶液，照實施例1的色譜條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖6。圖6表明，富馬酸替諾福韋艾拉酚胺和堿降解雜質能有效分離，說明本法可以有效檢測出富馬酸替諾福韋艾拉酚胺堿降解雜質及其他潛在雜質，能有效控制富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的有關物質。實施例6色譜條件：色譜條件如同實施例1。溶液配制：稀釋溶液或空白溶劑：取1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用氫氧化鉀溶液調ph至6.5。氧化降解試驗溶液：取供試品350mg，精密稱定至100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液10ml于50ml量瓶，加入1ml30％雙氧水(濃雙氧水)，搖勻，放置約24h后，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，立即進樣檢測；取氧化降解試驗溶液，照實例1的條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖7。圖7表明富馬酸替諾福韋艾拉酚胺和氧化降解雜質能有效分離，說明本法可以有效檢測出富馬酸替諾福韋艾拉酚胺氧化降解雜質及其他潛在雜質，能有效控制富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的有關物質。實施例7色譜條件：色譜條件如同實施例1。溶液配制：稀釋溶液或空白溶劑：取1.36g磷酸二氫鉀，加入1000ml水，溶解并混合均勻，用氫氧化鉀溶液調ph至6.5。光照降解試驗溶液：取供試品350mg，精密稱定至100ml容量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液10ml于50ml量瓶，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，置可見光4500lux±500lux、紫外光1.7w×h/m2條件下光照13天使可見光照強度總量達到1200000lux，紫外光強度達到200w/m2以上。取光照降解試驗溶液，照實施例1的色譜條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖8。圖8表明富馬酸替諾福韋艾拉酚胺和光照降解雜質能有效分離，說明本法可以有效檢測出富馬酸替諾福韋艾拉酚胺光照降解雜質及其他潛在雜質，能有效控制富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的有關物質。綜上實施例所述，根據(jù)實施例1-7的實驗結果，可見本發(fā)明所提供的一種分離檢測替諾福韋艾拉酚胺及其有關物質的方法能夠有效地分離檢測替諾福韋艾拉酚胺的非對映異構體及其他有關物質，該方法簡便、準確、可靠，適合于工業(yè)中控制替諾福韋艾拉酚胺的產(chǎn)品質量。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內。當前第1頁12