一種關(guān)于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種關(guān)于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶，廣泛分布于人體心、肺、肝等組織細(xì)胞漿內(nèi)。黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸，并產(chǎn)生超氧陰離子。尿酸和超氧陰離子都是對(duì)人體有危害的物質(zhì)，尿酸是痛風(fēng)的一個(gè)重要生物指標(biāo)，并且與心血管疾病、腎臟疾病等相關(guān)；而超氧陰離子則與癌變、衰老等相關(guān)，若不能及時(shí)清除，將會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。目前廣泛使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑主要是別嘌呤醇、非布索坦，超氧陰離子清除劑則主要為BHT，BHA等化學(xué)合成類藥物，在臨床實(shí)踐中出現(xiàn)很多不良反應(yīng)和副作用。所以，有效、低毒、價(jià)廉的黃嘌呤氧化酶抑制劑/超氧陰離子清除劑的尋找是目前研究的一大熱點(diǎn)。因而，建立一種方便、快捷、穩(wěn)定、可靠的活性測(cè)定方法，就具有顯著的必要性。
[0003]黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選一般采用經(jīng)典試管法，這種方法反應(yīng)體積較大，需要的待測(cè)物量相對(duì)也較大，并且一次只能檢測(cè)一個(gè)樣本。因此，現(xiàn)在也發(fā)展出了其他的篩選方法，如薄層生物自顯影法，該方法能夠快速對(duì)天然產(chǎn)物中的活性成分進(jìn)行定位與測(cè)定，但是由于IC50無法測(cè)得，限制了其運(yùn)用；也曾有報(bào)道用液相色譜法進(jìn)行活性物質(zhì)的篩選，雖然該方法能減少復(fù)雜樣本中其它化合物的干擾，但運(yùn)用此方法時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將涉及樣品處理等繁瑣步驟，檢測(cè)環(huán)節(jié)耗時(shí)也相對(duì)較長(zhǎng)；雖然質(zhì)譜方法能通過檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物來間接測(cè)定活性，但操作的復(fù)雜及過程的耗時(shí)同樣不適宜進(jìn)行大量樣本的篩選。而且，并不是所有執(zhí)行活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室都具備能進(jìn)行液相色譜分析或質(zhì)譜分析的硬件條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題和需求，本發(fā)明的目的是提供一種關(guān)于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單操作、高靈敏度及高通量篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的目的。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0006]一種關(guān)于黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑的高通量篩選方法，是以黃嘌呤氧化酶-NBT為反應(yīng)體系，以96孔板為反應(yīng)載體，以酶標(biāo)儀為檢測(cè)器，檢測(cè)計(jì)算待測(cè)物在相應(yīng)濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率。
[0007]作為一種優(yōu)選方案，上述的高通量篩選方法包括如下具體步驟:
[0008]a)分別配制待測(cè)物溶液、混合底物反應(yīng)液、黃嘌呤氧化酶液以及空白緩沖液；
[0009]b)在96孔板中設(shè)置對(duì)照孔、空白孔、檢測(cè)孔和校準(zhǔn)孔，在對(duì)照孔和空白孔中分別加入200 μ L由溶劑與混合底物反應(yīng)液按體積比1:10?1:40形成的混合液，在檢測(cè)孔和校準(zhǔn)孔中分別加入200 μ L由待測(cè)物溶液與混合底物反應(yīng)液按體積比1:10?1:40形成的混合液；再向?qū)φ湛缀蜋z測(cè)孔中加入20 μ L黃嘌呤氧化酶液，向空白孔和校準(zhǔn)孔中加入20 μ L空白緩沖液，然后將96孔板放入酶標(biāo)儀內(nèi)，振搖96孔板使孔內(nèi)的溶液混合均勻；開始計(jì)時(shí)，在25?44°C下反應(yīng)15?30分鐘；向上述每孔中加入反應(yīng)終止劑使終止反應(yīng)；在400?700nm的紫外光下對(duì)上述各孔進(jìn)行OD值檢測(cè)；
[0010]c)計(jì)算待測(cè)物在各濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率:
[0011 ] I= [ (0D 對(duì)照—OD 空白)_ (0D 檢測(cè)—OD 校準(zhǔn))]/ (0D 對(duì)照—OD 空白)X 100% ；
[0012]其中=ODwm為對(duì)照孔的OD值；0Dse為空白孔的OD值；0D_為檢測(cè)孔的OD值；0D??為校準(zhǔn)孔的OD值。
[0013]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述的混合底物反應(yīng)液包括黃嘌呤、氮藍(lán)四唑(NBT)和pH為6.0?9.0的PBS，其中:黃嘌呤的摩爾濃度為0.100?0.166mmol/L、氮藍(lán)四唑的摩爾濃度為 0.200 ?0.334mmol/L、PBS 的摩爾濃度為 50mmol/L。
[0014]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述的黃嘌呤氧化酶液包括黃嘌呤氧化酶、EDTA和pH為
6.0?9.0的PBS，其中:酶活力為20?120mU/mL，EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L, PBS的摩爾濃度為50mmol/L。
[0015]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述的空白緩沖液包括EDTA和pH為6.0?9.0的PBS，其中:EDTA的摩爾濃度為0.5mmol/L, PBS的摩爾濃度為50mmol/L。
[0016]作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述的反應(yīng)終止劑為摩爾濃度為0.1?0.4mol/L的鹽酸水溶液。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0018]反應(yīng)體積小、可多樣本同時(shí)檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合高通量篩選，為篩選有效、低毒、價(jià)廉的黃嘌呤氧化酶抑制劑及自由基清除劑提供了一種便捷途徑和手段，具有顯著性進(jìn)步和實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0019]圖1為別嘌呤醇的濃度-抑制率曲線；
[0020]圖2為迷迭香酸的濃度-抑制率曲線；
[0021]圖3為沒食子酸的濃度-抑制率曲線；
[0022]圖4為兒茶素的濃度-抑制率曲線；
[0023]圖5為槲皮苷的濃度-抑制率曲線；
[0024]圖6為木犀草素的濃度-抑制率曲線；
[0025]圖7為綠茶提取物的濃度-抑制率曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所使用試劑和材料除特別說明外，均可通過商業(yè)途徑市購得到。
[0027]待測(cè)物各濃度下的黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率由下式計(jì)算:
[0028]I = [ (0D 對(duì)照—OD 空白)_ (0D 檢測(cè)—OD 校準(zhǔn))]/ (0D 對(duì)照—OD 空白)X 100% ；
[0029]其中=ODwm為對(duì)照孔的OD值；0Dse為空白孔的OD值；0D_為檢測(cè)孔的OD值；0D??為校準(zhǔn)孔的OD值。
[0030]實(shí)施例1
[0031]I)黃嘌呤氧化酶液的配制
[0032]黃嘌呤氧化酶液包括50mM PBS (pH=6.5),0.5mM EDTA,酶活力校準(zhǔn)為50mU/mL ；
[0033]2)混合底物反應(yīng)液的配制
[0034]混合底物反應(yīng)液包括0.133mM 黃嘌呤，0.267mM NBT, 50mM PBS (pH=6.5)；
[0035]3)別嘌呤醇溶液的配制
[0036]別嘌呤醇溶于乙醇中，配成0.3mM的待測(cè)液，用乙醇繼續(xù)稀釋得0.25mM、0.2mM、0.15mM、0.125mM、0.lmM、0.075mM、0.05mM 各濃度的待測(cè)液；
[0037]4)對(duì)照孔及其空白孔、檢測(cè)孔及其校準(zhǔn)孔的設(shè)置法
[0038]對(duì)照孔及其空白孔的設(shè)置:每次檢測(cè)，對(duì)照孔及其空白孔各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，乙醇與混合底物反應(yīng)液按體積比1:30混合均勻后，每孔加入200 μ L，然后每個(gè)對(duì)照孔中各加入50mU/mL的黃嘌呤氧化酶液20 μ L，每個(gè)空白孔中各加入空白緩沖液20 μ L ;所述空白緩沖液包括50mM PBS (Ph=6.5),0.5mM EDTA ;振搖5s后，開始計(jì)時(shí)，在44 °C下反應(yīng)15min后，每孔加入20 μ L0.5Μ鹽酸終止反應(yīng)，在580nm下檢測(cè)各孔的OD值；
[0039]檢測(cè)孔及其校準(zhǔn)孔的設(shè)置:不同濃度的別嘌呤醇溶液與混合底物反應(yīng)液均按體積比1:30混合均勻，檢測(cè)孔及其校準(zhǔn)孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μ L，然后每個(gè)檢測(cè)孔中各加入50mU/mL的黃嘌呤氧化酶液20 μ L，每個(gè)校準(zhǔn)孔中各加入空白緩沖液20 μ L ;所述空白緩沖液包括50mM PBS (pH=6.5)、0.5mM EDTA ;振搖5s后，開始計(jì)時(shí)，在44°C下反應(yīng)15min后，每孔加入20 μ L0.5Μ鹽酸終止反應(yīng)，在580nm下檢測(cè)各孔的OD值；
[0040]5)計(jì)算黃嘌呤氧化酶抑制率/超氧陰離子清除率
[0041 ] 經(jīng)計(jì)算:0.3mM的別嘌呤醇的抑制率為70.87%，0.25mM的別嘌呤醇的抑制率為67.85%，0.2mM的別嘌呤醇的抑制率為64.58%，0.15mM的別嘌呤醇的抑制率為54.07%,
0.125mM的別嘌呤醇的抑制率為46.97%, 0.1mM的別嘌呤醇的抑制率為42.39%, 0.075mM的別嘌呤醇的抑制率為33.60%，0.05mM的別嘌呤醇的抑制率為16.05%，根據(jù)結(jié)果所繪別嘌呤醇濃度-抑制率曲線如圖1所示。
[0042]實(shí)施例2
[0043]I)黃嘌呤氧化酶液的配制
[0044]黃嘌呤氧化酶液包括50mM PBS (pH=7.0)，0.5mM EDTA,酶活力校準(zhǔn)至80mU/mL ；
[0045]2)混合底物反應(yīng)液的配制
[0046]混合底物反應(yīng)液包括0.1OOmM 黃嘌呤，0.200mM NB