被抗體，包被抗體加入量為100yL/孔，4°C過(guò)夜后，使包被抗體 包被酶標(biāo)板，洗板后洗去未與酶標(biāo)板結(jié)合的包被抗體，該包被抗體為SEM單克隆抗體； (2) 加入封閉液在37°C下封閉1~2h，使封閉液對(duì)酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，封 閉液加入量為200yL/孔，洗板后洗去酶標(biāo)板上多余封閉液； (3) 在酶標(biāo)板上加入樣品，解育后洗板；本實(shí)施例中分別一共采用了 10種樣品進(jìn)行檢 巧。，該9種樣品分別為1種檢測(cè)樣品和8種濃度分別為0.5ng/mL、lng/mL、2.5ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL的SEM標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。該檢測(cè)樣品為PBS空白對(duì)照 樣品； (4) WSEM兔抗血清為一抗加入酶標(biāo)板，一抗的加入量為100uL/孔，在37°C下反應(yīng) 1h后洗板；再W辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗的加入量為100 yL/孔，在37 °C下反應(yīng)30~45min后洗板； (5) 加入顯色液使酶標(biāo)板顯色，加入量為100yL/孔，加入后在37°C避光顯色7~10 min;然后加入濃度為2mol/L的硫酸，進(jìn)行終止反應(yīng)，硫酸加入量為100UL/孔；用酶標(biāo)儀 檢測(cè)〇〇4日。； 上述步驟中洗板的具體操作過(guò)程為；倒去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，用含 0. 05%Tween-20的PBST加滿孔，靜置3min，反復(fù)洗漆3~5次； 根據(jù)檢測(cè)出的10種樣品的〇〇45。值，并根據(jù)10種樣品中的沈M濃度，即可對(duì)應(yīng)繪制出SEM的標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示； 其次，采用上述相同的步驟，只需將樣品替換成待檢測(cè)物品，即可檢測(cè)出待檢測(cè)物品的 〇〇4。。值，并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該待檢測(cè)物品的SEM含量。
[0020] S、檢測(cè)階段 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)。
[0021] 通過(guò)圖1可知，本試驗(yàn)抗原在0. 5~20ng/mL線性良好，R2=0. 9985,最低檢測(cè)限為 0. 5ng/mL。目P，當(dāng)樣品中沈M濃度> 0. 5ng/mL，樣品中沈M被配對(duì)抗體捕獲與酶標(biāo)二抗結(jié) 合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值時(shí)，被判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣品中SEM濃度<0. 511肖/111以樣 品中SEM不被配對(duì)抗體捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足W引起足夠的信號(hào)時(shí)，被判定為陰性。
[0022] 2、精密度檢測(cè)。
[002引①批內(nèi)變異將陽(yáng)性對(duì)照組（20ng/ml、10ng/ml、5ng/mL)，陰性對(duì)照組分別作5 個(gè)復(fù)孔于同一板上，同時(shí)檢測(cè)其0045。值；②批間變異連續(xù)5次檢測(cè)上述相同標(biāo)本的0D45。值； 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0024] 表1DAS-ELISA檢測(cè)樣品變異系數(shù)。
[00巧]通過(guò)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W看出，本發(fā)明方法的批內(nèi)變異< 10%，批間變異< 15%， 說(shuō)明該方法具有較高的精密度。
[0026] 3、特異性檢測(cè)。
[0027] 用上述建立的方法檢測(cè)3株醫(yī)院食物中毒患者源金黃色葡萄球菌化、&、吊)和17 株食品源金黃色葡萄球菌化、Fs、Fg、Fe、Fy、Fg、Fi5、Fie、Fi9、F24、F29、F37、F39、F"、F42、F44、Fsi)， 并與PCR法進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定方法的特異性，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。
[0028] 表2DAS-ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果。
[002引注；" + "代表陽(yáng)'生；代表陰性。
[0030] 通過(guò)表2可W看出，利用建立的DAS-ELISA方法檢測(cè)20株金黃色葡萄球菌上清 液，其檢測(cè)結(jié)果與PCR-致，表明該方法具有良好特異性。
[0031] 4、測(cè)定人工污染樣品中沈M的回收率。
[0032]SEM人工污染食物的制備：用沈M溶液直接加入生理鹽水和食用鮮牛奶混勻作為 污染水和牛奶。稱取巧牛肉、大米飯各1.0g，加不同濃度的沈M生理鹽水，攬拌均勻，然后 離屯、8000r/min，20min,取上清液待檢。W本文建立的快速化ISA法測(cè)0〇4日。值，計(jì)算 樣品回收率；回收率=測(cè)量濃度/實(shí)際濃度X100%。
[0033] 陽(yáng)性判斷；P/N〉2為陽(yáng)性結(jié)果；P:樣品0〇4日。值；N:陰性對(duì)照0D4日。值。
[0034] 配制不同濃度沈M污染樣品，采用本發(fā)明方法法測(cè)定污染樣品0〇45。值，并計(jì)算沈M 濃度，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3所示。
[003引表3DAS-ELISA檢測(cè)污染樣品的回收率。
[0036] 注表示未檢出。
[0037] 由表3可W看出；3種污染樣品隨著SEM濃度增加，回收率增加，變異系數(shù)減小，準(zhǔn) 確度增高。巧牛肉、牛奶和米飯?jiān)谏騇濃度達(dá)到2. 5ng/mLW上時(shí)，回收率達(dá)均能達(dá)到90% W上，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)。
[0038] 上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，但凡采用 本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理，W及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行非創(chuàng)造性勞動(dòng)而作出的變化，均應(yīng)屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素M的雙抗夾心法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 用包被抗體包被酶標(biāo)板，洗板，用于洗去未與酶標(biāo)板結(jié)合的包被抗體，該包被抗體 為SEM單克隆抗體； (2) 加入封閉液對(duì)酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，洗板，用于洗去酶標(biāo)板上多余封閉 液； (3) 在酶標(biāo)板上加入樣品，孵育后洗板； (4) 以SEM兔抗血清為一抗加入酶標(biāo)板，反應(yīng)后洗板，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔IgG為酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗板； (5) 加入顯色液使酶標(biāo)板顯色，然后加入硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD45tl; (6) 將檢測(cè)得到的OD45tl值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得樣品中SEM的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（1)的具體過(guò)程如下：用I. 8~2. 7 y g/mL的SEM單克隆抗體包被酶標(biāo)板， 在4°C過(guò)夜。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（2)的具體過(guò)程如下：以5[20%脫脂奶粉為封閉液，在37°C下封閉1~2 h〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（3)中樣品孵育的溫度為37°C，孵育的時(shí)間為60~90 min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（1)中的包被抗體、步驟（2 )中的封閉液、以及步驟（4 )中的一抗和酶標(biāo)二 抗均采用pH=7. 4的IXPBS進(jìn)行稀釋，一抗的稀釋比例為1:2000~1:4000,酶標(biāo)二抗的稀釋 比例為 1:6000~1:8000。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（4)中一抗加入后在37°C下反應(yīng)I h ;所述酶標(biāo)二抗加入后在37°C下反應(yīng) 30~45 min〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（1)~步驟（4)中洗板的操作過(guò)程如下：倒去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，在吸水紙 上拍干，用含〇. 〇5%Tween-20的PBST加滿孔，靜置3 min，反復(fù)洗滌3~5次。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述步驟（5)中顯色液加入后在37°C避光顯色7~10min ;所述硫酸濃度為2 mol/L。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素I的雙抗夾心法，其特 征在于，所述顯色液由10 mL顯色液A、125 yL顯色液B、15 yL 3% H2O2配置而成；其中顯 色液A由3.5 g的Na2HPO4.12H20、LI g的檸檬酸混合后加水至200 ml，并調(diào)節(jié)pH值至5.0 后制得；顯色液B由6 mg的3. 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺加入ImL二甲基亞砜混合制得。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM的雙抗夾心法。本發(fā)明包括（1）用包被抗體包被酶標(biāo)板，洗板，用于洗去未與酶標(biāo)板結(jié)合的包被抗體，該包被抗體為SEM單克隆抗體；（2）加入封閉液對(duì)酶標(biāo)板上多余結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，洗板，用于洗去酶標(biāo)板上多余封閉液；（3）在酶標(biāo)板上加入樣品，孵育后洗板；（4）以SEM兔抗血清為一抗加入酶標(biāo)板，反應(yīng)后洗板，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，反應(yīng)后洗板；（5）加入顯色液使酶標(biāo)板顯色，然后加入硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450；（6）將檢測(cè)得到的OD450值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得樣品中SEM的含量。本發(fā)明具有定性、定量檢測(cè)SEM，檢測(cè)準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/577
【公開(kāi)號(hào)】CN104977412
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510421148
【發(fā)明人】唐俊妮, 朱安妮, 趙燕英, 湯承, 劉驥, 陳娟, 蔡自建
【申請(qǐng)人】西南民族大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年7月17日