完成后將菌液涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常規(guī) 方法篩選表達(dá)菌株。挑取PET-NP轉(zhuǎn)化的具有外源蛋白表達(dá)能力的單個(gè)菌落并接種入IOOmL LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。取出菌液后，按I :100接種于IOOmL含有SOyg/mL卡那霉 素的LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D6。。= 0. 6時(shí)，加入lmol/LIPTG至終濃度為lmmol/L，于 37°C搖菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4h后于8000r/min下離心10min收集菌體。將此 菌體用 20mL磷酸鹽緩沖液（8g/L NaCL，0.2g/L KCl，0.24g/L KH2P04，1.44g/L Na2HPO4PH = 7. 4)洗滌3次并用IOmL上樣緩沖液（20mM Na3PO4, 0. 5M NaCl ;30mM咪唑，pH7. 4)重懸后 進(jìn)行超聲破碎，操作條件為：50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲完成后，12000g 離心15min分別收集沉淀和上清后進(jìn)行電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)重組NP-His融合蛋白以包涵體方 式存在于菌體中。
[0086] 重組NP-His融合蛋白的純化步驟如下：
[0087] 將上述沉淀組分用洗滌緩沖液（20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;3M尿素，30mM咪唑， pH7. 4)洗滌兩次后，12000g離心15min收集沉淀。將沉淀用Binding buffer(20mM Na3P04,0.5M NaCl ;8M 尿素，30mM 咪唑，pH7.4)于室溫下溶解后，12000g 離心 15min，上 清用0.45 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。溶解液中的重組蛋白用His Trap affinity columns (GE healthcare公司產(chǎn)品），按照說(shuō)明書(shū)用同樣的方法進(jìn)行純化。具體方法如下：
[0088] 1)用5mL注射器吸滿(mǎn)蒸餾水，擰開(kāi)柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0089] 2)用 10mT, Binding buffer 平衡，lmL/min 流速。
[0090] 3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0091] 4)用 10mT, Binding buffer，以 lmL/min 流速洗柱。
[0092] 5)用 IOmL Elution buffer (20mM Na3PO4,0· 5M NaCl ;8M 尿素，500mM 咪唑， pH7. 4)，以lmL/min流速洗脫，分管收集，每管lml，12% SDS-PAGE檢測(cè)，合并洗脫組分中含 有目的蛋白的樣品。經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后，調(diào)整濃度為0. 2mg/mL。
[0093] (二）兔及鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0094] 1.兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0095] 用步驟（一）純化的重組NP-His融合蛋白按照200yg(lmL)與ImL弗氏完全 佐劑混勻乳化后免疫雄性新西蘭大白兔（由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供），于背部皮 下多點(diǎn)注射，間隔7d后再免疫一次，再過(guò)14d后用上述純化的重組NP-His融合蛋白按照 200 μ g (ImL)與ImL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫7d后再按上述同 樣方法再加強(qiáng)免疫一次。7d后取血分析抗體滴度。若不滿(mǎn)意，可重復(fù)進(jìn)行一到兩次加強(qiáng)免 疫，至抗體滴度滿(mǎn)意（用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)大于IX IO5)。若滿(mǎn)意則心臟采血，分離血 清，以Protein G親和層析柱（GE healthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)純化多克 隆抗體IgG,用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖液（8g/L NaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4PH = 7. 4)調(diào)整為 lmg/mL，-20°C保藏 備用，至此制得兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG。Westen blot試驗(yàn)表明，此 多克隆抗體IgG能特異性識(shí)別人呼吸道合胞病毒全長(zhǎng)NP蛋白。
[0096] 2.鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的制備
[0097] 用步驟（一）純化的重組NP-His融合蛋白作為完全抗原免疫豚鼠（由湖北省疾 病預(yù)防控制中心提供），肩胛下注射抗原200 μ g/只。基礎(chǔ)免疫為等體積的抗原與弗氏完全 佐劑進(jìn)行乳化，每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用等體積抗原與等體積弗氏不完全 佐劑進(jìn)行乳化，總共免疫4次。末次免疫IOd后取血分析抗體滴度。若不滿(mǎn)意，可重復(fù)進(jìn)行 一到兩次加強(qiáng)免疫，至抗體滴度滿(mǎn)意（用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)大于IX IO5)。若滿(mǎn)意則處 死豚鼠取血清，以Protein G親和層析柱（GE healthcare公司產(chǎn)品），嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū) 純化多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定抗體濃度并用磷酸鹽緩沖 液（8g/L NaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4PH = 7. 4)調(diào)整為 lmg/mL，備 用，至此制得鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG。Westen blot試驗(yàn)表明，此多 克隆抗體IgG能特異性識(shí)別人呼吸道合胞病毒全長(zhǎng)NP蛋白。
[0098] 實(shí)施例2抗人呼吸道合胞病毒免疫納米磁珠的制備
[0099] 1.抗人呼吸道合胞病毒多克隆抗體偶聯(lián)磁珠反應(yīng)條件的優(yōu)化：
[0100] 以偶聯(lián)了抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體的磁珠作為固相載體，量子點(diǎn) 標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，通過(guò)雙抗夾心法原理檢測(cè) 人呼吸道合胞病毒抗原，觀察磁珠與多抗的偶聯(lián)情況。分別對(duì)磁珠的粒徑，以及HXVNHS活 化劑濃度、偶聯(lián)抗體濃度、偶聯(lián)時(shí)間、封閉劑種類(lèi)等偶聯(lián)條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化選擇。
[0101] I. 1磁珠粒徑的選擇
[0102] 選擇粒徑為 50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m 的竣基磁珠，均加入含 4mg/ml EDC 及4mg/ml NHS的PBS緩沖液進(jìn)行活化反應(yīng)后，分別與實(shí)施例1所描述的兔抗人呼吸道合胞 病毒NP蛋白多克隆抗體IgG進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。分別將制備好的免疫納米磁珠檢測(cè)lOng/mL 的人呼吸道合胞病毒（ATCC編號(hào)VR26)，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，選擇熒光強(qiáng)度大，背景熒 光干擾少，以及在磁場(chǎng)作用下分離速度較快者為最適磁珠粒徑。結(jié)果表明粒徑1150nm的磁 珠最符合本發(fā)明的要求，確定最適磁性微球粒徑為1150nm。
[0103] I. 2EDC/NHS活化劑濃度的選擇
[0104] 將反應(yīng)體系中EDC和NHS濃度各自設(shè)為1~10mg/ml后進(jìn)行濃度梯度組合，分別 活化粒徑1150nm的羧基磁珠。將制備好的免疫納米磁珠檢測(cè)10ng/mL的人呼吸道合胞病 毒（ATCC編號(hào)VR26)，選擇熒光最強(qiáng)者為EDC和NHS溶液的最適活化濃度。結(jié)果表明當(dāng)EDC 濃度為5mg/ml、NHS濃度為4mg/ml時(shí)偶聯(lián)效果最好。
[0105] 1.3偶聯(lián)抗體濃度的選擇
[0106] 將 20 μ g、40 μ g、60 μ g、80 μ g、100 μ g、120 μ g、140 μ g 的兔抗人呼吸道合胞病毒 NP蛋白多克隆抗體IgG分別與Img按上述最優(yōu)方法活化的粒徑為1150nm的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)。 將制備好的免疫納米磁珠檢測(cè)l〇ng/mL的人呼吸道合胞病毒（ATCC編號(hào)VR26)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)抗體的投放量小于100 μ g/mg時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著抗體的濃度增加而增加，而當(dāng)抗體的質(zhì) 量濃度大于100 μ g/mg時(shí)，熒光強(qiáng)度基本不變甚至略有減小，因此本實(shí)施例選擇兔抗人呼 吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG的偶聯(lián)量為100 μ g/mg。
[0107] I. 4偶聯(lián)時(shí)間的選擇
[0108] 確定磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度及抗體偶聯(lián)量后，將抗體與磁珠的偶聯(lián)反應(yīng) 時(shí)間分別設(shè)為〇.511、111、211、311、411、511，將制備好的免疫納米磁珠檢測(cè)1〇1^/1111的人呼吸道 合胞病毒（ATCC編號(hào)VR26)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)偶聯(lián)時(shí)間>3h時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，此后再延長(zhǎng) 偶聯(lián)時(shí)間，熒光不再增強(qiáng)。因此，確定兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG與磁 珠的最適偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為3h。偶聯(lián)時(shí)間遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)ELISA法的24h。
[0109] 1.5封閉劑的選擇
[0110] 按照上述確定的最優(yōu)條件選擇磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度、抗體偶聯(lián)量及偶 聯(lián)時(shí)間后進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)結(jié)束后，選擇BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖鹽酸鹽作為 免疫納米磁珠封閉劑，制得成品免疫納米磁珠。將制備好的免疫納米磁珠檢測(cè)10ng/mL的 人呼吸道合胞病毒（ATCC編號(hào)VR26)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙醇胺作為封閉劑的免疫納米磁珠的 檢測(cè)熒光值最高。推測(cè)由于乙醇胺的分子較小，可以較好的消耗由于空間位阻未與抗體結(jié) 合的表面羧基，使封閉更為完全，并且有效減少空間位阻效應(yīng)對(duì)已連接抗體的結(jié)構(gòu)影響。
[0111] 2.偶聯(lián)過(guò)程：
[0112] 取5mg磁珠（以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠）于I. 5ml普 通離心管中，用Iml MES緩沖液（2g/L MES，pH6. 0)洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁 分離（0. 4T)后移除上清，依次加入用上述MES緩沖液配制的濃度為10mg/ml的EDC溶液 及用上述MES緩沖液配制的濃度為8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0. 5ml，以15rpm/min于旋 轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，磁分離后移除上清，用Iml上述的MES緩沖液重懸；取5個(gè)離心管，每 個(gè)離心管中加入200 μ L上述活化的磁珠，磁分離后吸出上清，向各管中加入用PBS緩沖液 (8g/L NaCL，0. 2g/L KCl，0· 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4, ρΗ7· 4)稀釋的濃度為 100 μ g/ ml的實(shí)施例1所制備的兔抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG溶液各lml，室溫下 以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h,磁分離移除上清后,各加入1ml含lmg/ml乙醇胺的 上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng) 的羧基。磁分離后移除各管上清，各用Iml洗滌緩沖液（8g/L NaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/L KH2PO4, L 44g/L Na2HPO4, (λ 5ml/L Tween-20, ρΗ7· 4)洗滌三遍，最后各用 Iml 保存緩沖液 (8g/L NaCL, 0. 2g/L KC1,0. 24g/LKH2P04,1. 44g/L Na2HPO4,0. 3g/L NaN3, 5g/L BSA, pH7. 4) 重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 實(shí)施例3量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人呼吸道合胞病毒納米探針的制備
[0114] 1.納米羧基量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG反應(yīng)條件 的優(yōu)化：
[0115] I. 1、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記pH的確定
[0116] 將標(biāo)記反應(yīng)中磷酸鹽緩沖液pH分別設(shè)為5,6, 7,8,9,對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn) 行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同PH值對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響，確定了量子點(diǎn)標(biāo)記多抗反應(yīng)的最佳pH 為7. 0-8.0。本實(shí)驗(yàn)選擇ρΗ7· 4。
[0117] 1. 2、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記量的確定
[0118] 將量子點(diǎn)摩爾濃度與多抗?jié)舛戎确謩e設(shè)置為I: I，1:2,1:3及1:4,進(jìn)行標(biāo)記反 應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察二者不同濃度比對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影 響，確定量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人呼吸道合胞病毒NP蛋白多克隆抗體IgG反應(yīng)的最佳摩爾濃度比 為量子點(diǎn)與抗體摩爾比為1:3。本實(shí)驗(yàn)選擇該最優(yōu)濃度比來(lái)確定標(biāo)記量。
[0119] 1. 3、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳封閉劑種類(lèi)的確定
[0120] 以乙醇胺、Tris、PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn) 物利用全光譜儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同的封閉劑對(duì)于標(biāo)