專利名稱：：一種造血干祖細胞的培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明屬生物
技術領域：
，涉及一種造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統體外擴增人臍血造血干祖細胞的方法。
背景技術：
：目前體外擴增人造血干祖細胞的常規(guī)培養(yǎng)體系是將取自骨髓、外周血或臍血的單個核細胞或純化的CD34+細胞以單個細胞懸浮培養(yǎng)的形式培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。造血干細胞通常處于相對休眠的惰性狀態(tài)，常規(guī)培養(yǎng)體系細胞培養(yǎng)液中需加入較大劑量的多種細胞因子的組合來刺激造血干細胞進入增殖周期，以誘導細胞分裂擴增。研究顯示，大劑量的細胞因子對造血干細胞是過于強烈的刺激信號，由此導致的結果是擴增后的細胞被誘導分化成熟，喪失了造血干細胞自我更新和重建造血的潛能，導致擴增以后的細胞無法維持長期造血(Rice,A.，Flemraing,C.，Case,J.,eta丄[J].BoneMarrowTransplant,1999，23(3):211-20)。臨床實踐需要，體外擴增人臍血造血干祖細胞的方法應是簡單、經濟、安全而有效的。已報道的用于造血干祖細胞擴增的細胞因子有很多種，最為多見的是SCF、TP0、FL、GM-CSF、EP0、IL-3和IL-6等，在多種的細胞因子中，SCF、TPO和FL是對造血干祖細胞擴增最為關鍵的細胞因子(Hofmeister，C.C.,Zhang，J.，Knight,K.L.,a7.[J].BoneMarrowTransplant,2007，39(1):11-23.Bhatia,M.，Wang,J.C.，Kapp,U.,"a丄[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997，94(10):5320-5.Murray,L.J.,Young,J.C.,Osborne,L.J.,eta丄[J].ExpHeraatol,1999,27(6):1019—28.Gammaitoni,L.,Bruno,S.，Sanavio，F.,a丄[J].ExpHematol,2003，31(3):261—70.)。常規(guī)二維培養(yǎng)系統中，此三種細胞因子用于造血干祖細胞擴增時的使用濃度在5(T300ng/ml(Luens，K.M.,Travis,M.A.,Chen,B.P,,"a丄[J].Blood,1998，491(4):1206—15.Piacibello,W.，Sanavio,F.,Garetto，L.,eta丄[J].Leukemia,1998,12(5):718-27.Fietz,T.,erdel，W.E.，Rieder，H.,"a丄[J].BoneMarrowTransplant,1999，23(11):1109-15.Drouet，M.，Herodin,F,，Norol,F.,a7.[J].StemCells,2001，19(5):436-42.Ryu，K.H.,Shin,H.Y.，Ahn，H.S.,a丄Haematologica,2004，89(5):606—7.Levac,K.,Karanu,F.,andBhatia,M.[J].Haematologica,2005,90(2):166-72.)。在實驗研究中，常需要多種細胞因子聯合應用，稱為細胞因子雞尾酒(cytokinescocktail)。由于細胞因子非常昂貴，用于擴增造血干祖細胞培養(yǎng)的細胞因子種類使用的越多，劑量使用的越高，則擴增的成本就越高。改變體外培養(yǎng)方式是擴增造血干祖細胞的效率的策略之一。在成體體內，造血干細胞生存于骨髓微環(huán)境中。在骨髓微環(huán)境里，造血干細胞與造血干細胞之間，造血干細胞與基質細胞之間，造血干細胞與細胞外基質之間都有相互的接觸并互相作用。這種互相作用，是維持造血干細胞自我更新和重建造血能力的因素之一(Verfaillie,CM.[J].NatImmunol,2002,3(4):314-7.)。因此，將單個核細胞或純化CD34+細胞培養(yǎng)于模擬骨髓微環(huán)境的培養(yǎng)體系中有可能提高擴增造血干祖細胞的效率。三維(3dimentional，3D)培養(yǎng)體系由此被設計用于擴增造血干祖細胞。三維培養(yǎng)體系是應用各種材質為基質，建立三維微網絡結構的培養(yǎng)基質，而細胞就被培養(yǎng)在三維微網絡結構中生長。有報道將純化CD34+細胞放置入預先制造的膠原或"Cytomatrix"三維培養(yǎng)體系中(Ehring，B.,Biber，K.,Upton,T.M.,efa7,[J].Cytother鄰y,2003,5(6):490-9.Kim,H.S.,Lim,J.B.,Min，Y.H.,eta,[J].IntJHematol，2003，78(2):126-32.)培養(yǎng)，取得一定的擴增造血干祖細胞的效果。但是現有技術所述的預制的三維培養(yǎng)體系無法保證足夠的孔徑和間隙讓所有所加入的細胞都能進入三維培養(yǎng)基質內。藻酸鹽成分來自于褐藻，是線性單鏈多聚體，含有4)-D-甘露糖醛酸(ma畫ronicacid，M)殘基和a-(1—4)-L-古羅糖醛酸(guluronicacid,G)殘基。藻酸鹽凝膠微球形成的微網架結構的孔徑為5-200納米，可以允許大分子蛋白質和其他成分以及氣體滲透和交換，從而為包裝在其內的細胞提供培養(yǎng)液內的所有營養(yǎng)成分、各種細胞因子，并保證氧氣和二氧化碳的交換。當鈣離子被螯合劑螯合(如枸櫞酸鹽)，藻酸鹽微球即能從固體狀態(tài)重新回復到液態(tài)狀態(tài)，釋放并回收包裝在內的細胞?；谝陨咸匦?，相當長一段時間以來，被用作食品工業(yè)凝膠基質和口服藥物外包膜，是一種對人體十分安全的材料。藻酸鹽三維系統此前被用于其他多種細胞的培養(yǎng)，但是主要著眼于貼壁生長方式的細胞，尚未有用于擴增人造血干細胞的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，提供一種造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種藻酸鹽三維培養(yǎng)系統體外擴增人臍血造血干祖細胞的方法。本發(fā)明釆用三維靜止培養(yǎng)系統、三維旋轉培養(yǎng)系統擴增人臍血單個核細胞內造血干祖細胞,并與傳統二維培養(yǎng)系統的擴增效果作比較，為體外擴增人臍血造血干祖細胞提高造血干祖細胞的移植效率提供一種新的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現本發(fā)明中，選取對造血干祖細胞最為關鍵的SCF、TPO和FL這三種細胞因子聯合應用來支持臍血單個核細胞中造血干祖細胞的擴增，不加用其他細胞因子，以盡可能減少培養(yǎng)系統的成本，與傳統二維培養(yǎng)體系所使用細胞因子濃度相比，本方法采用更為低的濃度。本發(fā)明中，采用包裝在藻酸鹽微球內的人臍血單個核細胞培養(yǎng)于傳統的培養(yǎng)皿中(三維靜止培養(yǎng)系統)和旋轉的生物反應器容器(美國Synthecon公司)內(三維旋轉培養(yǎng)系統)，觀察臍血單個核細胞包裝于藻酸鹽微球內后在旋轉培養(yǎng)系統的擴增效果。結果表明，常規(guī)二維培養(yǎng)系統中，在低濃度細胞因子水平，人臍血單個核細胞無法得到數量上的擴增，而CD34+細胞更是明顯的減少；而本發(fā)明在低濃度細胞因子水平的支持下，培養(yǎng)在三維藻酸鹽靜止系統的人臍血單個核細胞卻已得到擴增，而在旋轉培養(yǎng)的三維藻酸鹽微球內的臍血單個核細胞在更低濃度的細胞因子支持下能取得程度相仿的擴增；在細胞總數擴增的同時，CD34+細胞的比例增長的更為明顯。本發(fā)明中，采用評價造血干細胞最為可靠的N0D/SCID小鼠移植模型評價經過培養(yǎng)后的人臍血單個核細胞中的造血干細胞，結果顯示三維培養(yǎng)系統擴增的臍血單個核細胞在移植細胞總數更低時卻得到了更好的重建造血能力，提示經三維系統培養(yǎng)擴增后的人臍血單個核細胞內的干細胞數量更多。本發(fā)明所述的藻酸鹽三維培養(yǎng)系統，將細胞包裝在三維微球內，能拉近細胞與細胞之間的距離，加強細胞之間的相互作用，使得在低濃度和更低濃度的支持下，反而取得了更好的體外擴增體內重建造血的效果。顯現出藻酸鹽三維微球培養(yǎng)系統在擴增人臍血單個核細胞和其中的造血干祖細胞的明顯優(yōu)勢。本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統中，用藻酸鹽溶液包裝細胞以及釋放回收細胞的操作過程簡單快捷。本發(fā)明中，通過造血克隆形成實驗評價造血干細胞在體外培養(yǎng)過程中向不同系列分化的造血能力。實驗結果顯示，經三維靜止培養(yǎng)系統和三維旋轉培養(yǎng)系統培養(yǎng)后的人臍血單個核細胞的粒巨系造血克隆數均較培養(yǎng)前明顯增加，與二維培養(yǎng)系統比較亦明顯增加。同樣的，移植了擴增后人臍血單個核細胞的小鼠的脾細胞和骨髓細胞的人源性粒巨系克隆的形成能力，顯示三維培養(yǎng)組在移植的細胞數明顯低于二維培養(yǎng)組，而三維組的人源性粒巨系克隆形成能力亦明顯增加。本發(fā)明所述的藻酸鹽三維微球培養(yǎng)體系擴增人臍血單個核細胞的方法具備簡單、經濟、安全而有效的特點。通過改變人臍血單個核細胞體外培養(yǎng)的環(huán)境，運用三維藻酸鹽包裝細胞進行靜止或旋轉狀態(tài)的培養(yǎng)，能達到理想的擴增人臍血造血干祖細胞的效果，具有臨床應用的前景。圖1是培養(yǎng)于60mra培養(yǎng)皿中的藻酸鹽微球，顯示了通過27-g針頭滴入lOOmMCaCl2溶液中形成的藻酸鹽-細胞微球直徑為1.5~2.5mra，右下方為標尺標示。圖2是三維靜止培養(yǎng)體系擴增人臍血單個核細胞數量的不同細胞因子濃度下細胞擴增倍數，圖中細胞數量增長曲線顯示低濃度細胞因子組和中濃度細胞因子組的細胞數隨培養(yǎng)時間增加而增加，無細胞因子組和極低劑量細胞因子組的細胞總數與培養(yǎng)前相比無明顯增加，低濃度細胞因子組細胞總數增加最為理想。圖3是三維靜止培養(yǎng)系統，低濃度細胞因子組藻酸鹽微球內造血細胞克隆，圖中顯示，自第6天起，藻酸鹽微球內出現可見的造血細胞小克隆，造血克隆隨著培養(yǎng)時間達到第9天、第12天而逐漸增多并增大，白色箭頭指示微球中的造血克隆，圖中左下角示顯微鏡放大倍數，右下角標示標尺。圖4是三維旋轉培養(yǎng)體系擴增人臍血單個核細胞數量的不同細胞因子濃度下細胞擴增倍數，圖中細胞數量增長倍數曲線顯示無細胞因子組的細胞總數與培養(yǎng)前相比無明顯增加，低濃度細胞因子組的細胞數隨培養(yǎng)時間增加而增加，極低濃度細胞因子組細胞平均擴增在第6天時達到最高峰，至培養(yǎng)第9天、第12天，低濃度細胞因子組和極低濃度細胞因子組細胞總數增加已無明顯差異。圖5是三維旋轉培養(yǎng)系統，極低濃度細胞因子組藻酸鹽微球內造血細胞克隆，圖中顯示，與三維靜止培養(yǎng)系統低濃度細胞因子組相仿，自第6天起，藻酸鹽微球內出現可見的造血細胞小克隆，造血克隆隨著培養(yǎng)時間達到第9天、第12天而逐漸增多并增大，白色箭頭指示微球中的造血克隆，圖中左下角示顯微鏡放大倍數，右下角標示標尺。圖6是三維藻酸鹽微球內包裝細胞密度對人臍血單個核細胞擴增的影響，單個微球內包裝有20000~25000個細胞的在三維靜止培養(yǎng)系統低濃度細胞因子培養(yǎng)下，細胞數隨培養(yǎng)時間而明顯增長，其余各組細胞數增長不明顯。圖7是包裝細胞加入明膠對人臍血單個核細胞擴增的影響，包裝細胞時加入明膠與不加入明膠細胞增殖倍數無明顯差異。圖8是不同培養(yǎng)系統擴增人臍血單個核細胞。圖9是流式細胞儀檢測臍血單個核細胞中CD34+細胞比例，Day0:細胞培養(yǎng)以前的臍血單個核細胞；Day12-2D:常規(guī)二維培養(yǎng)系統培養(yǎng)12天回收的細胞；Day12-3Dstatic:三維靜止培養(yǎng)系統培養(yǎng)12天回收的細胞；Day12-3DRWV:三維旋轉培養(yǎng)系統培養(yǎng)12天回收的細胞圖10是二維與三維培養(yǎng)系統培養(yǎng)人臍血單個核細胞前后造血克隆形成細胞數。圖11是NOD-SICD小鼠移植人臍血單個核細胞模型，小鼠外周血人源性CD45+細胞比例，圖中第一排為移植后第4周，第二排為移植后第6周，第三排為移植后第8周。實驗以Y射線照射對照組數據設零。圖12是NOD-SCID小鼠移植經培養(yǎng)人臍血單個核細胞后8周，脾細胞和骨髓細胞中人源性造血克隆形成細胞數。為了便于理解，以下將通過具體的實施方式對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。具體實施方式實施例l①實驗材料(1)人臍血單個核細胞分離單個核細胞分離液Ficoll-PaquePLUS,Amersh柳BiosciencesAB，SwedenPBSsGibco,InvitrogenO.歸CD(A)-PBS:枸櫞酸鈉2g,枸櫞酸0.8g，葡萄糖2.23g溶于1LPBS中，Ph調至7.2,0.22ixm過濾除菌。一次性集血袋上海輸血科技公司(2)藻酸鹽三維系統包裝與細胞回收藻酸鈉(alginatesodium):Sigma-Aldrich,USA明膠(gelatin):Sigma-Aldrich，USA溶解緩沖液(Dissolutionbuffer):50mM枸櫞酸鈉,0.45%NaCl,lOmMHEPES，pH調至7.2，0.22ixm過濾除菌。培養(yǎng)液IMDM(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)，GibcoIrwitrogen，月臺牛血清(fetalbovineserum,FBS):GibcoInvitrogen細胞因子SCF(stemcellfactor):重組人SCF，R&DsystemTP0(thro油opoietin):重組人TPO，R&DsystemsFL(Fit-3-ligand):重組人FL，R&Dsystems(4)流式細胞儀檢測PE標記鼠抗人CD34單克隆抗體BDBiosciencesPE標記鼠同型抗體BDBiosciencesPerCP標記鼠抗人CD45單克隆抗體BDBiosciencesACK緩沖液KHC031.0g/L，EDTA-二鈉0.0168g/L，NH4C14.415g/L(5)克隆形成實驗(Colonyformingcellassay,CFCassay)人源性克隆形成實驗半固體培養(yǎng)基MethocultGFH4435,StemCellTechnologies;Vancouver,Canada。該培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，含1%甲基纖維素(4000cps)，30%FBS，1%牛血清白蛋白，10—4M2-巰基乙醇，2raML-谷氨酰胺，以及下列人源性細胞因子50ng/mlvSCF，20ng/mLgranulocyte/macrophage-colonystimulatorfactor(GM-CSF),20ng/mLinterleukin-3(IL-3)，20ng/mLIL-6,20ng/mLgranulocyte-colonystimulatorfactor(G-CSF),and3U/mLErythropoietin(EP0)。②主要實驗儀器細胞培養(yǎng)箱PrecisionScientificC02Incubator旋轉培養(yǎng)儀Synthecon，Boston,TX，USAY射線輻照儀Gammacell1000Elite,MDSNordion，Canada離心機sEppendorfcentrifuge5804③實驗步驟與方法(1)人臍血單個核細胞分離收集人臍血樣本采集取離體胎盤置高，臍靜脈采集臍血。臍血依重力流入含ACD(B)或CPD2B抗凝劑的一次性使用血液采集袋(上海輸血技術公司)中。所有供者捐贈前簽署知情同意書。分離單個核細胞前，臍血樣本始終保存于4'C的環(huán)境中。人臍血單個核細胞分離新鮮臍血在采集后6個小時之內進行單個核細胞的分離。分離臍血單個核細胞采取Fico11-PaquePLUS密度梯度離心法。新鮮抗凝臍血與0.6%ACD(A)-PBS以1:l稀釋，2800g離心15分鐘，緩慢加速緩慢減速，棄上清，收集富白細胞層。富白細胞層混勾，再以0.6%ACD(A)-PBS1:1稀釋，仔細鋪于Fico11-PaquePLUS細胞分離液上，注意不破壞交界層。20'C溫度下700g離心20分鐘，緩慢加速緩慢減速，仔細吸取單個核細胞層，以0.6WACD(A)-PBS洗滌細胞兩次(200g，5分鐘)，IMDM洗細胞一次(200g，5分鐘)，計數有核細胞數量。采集后的臍血單個核細胞直接用于培養(yǎng)，或重懸于1(^DMS0-40%FBS-IMDM凍存液，冷凍保存于液氮中以備后續(xù)培養(yǎng)。(2)藻酸鹽三維微球臍血單個核細胞包裝及回收臍血單個核細胞包裝于藻酸鹽三維微球新鮮或解凍后的臍血單個核細胞重懸于1.1%藻酸鹽溶液或1.1%藻酸鹽-0.1%明膠溶液，混勻。單個核細胞-藻酸鹽溶液混合物通過27-g針頭逐滴滴入100mM氯化鈣溶液中，固態(tài)微球即刻形成，于氯化鈣溶液中旋轉6至10分鐘以使微球硬化成型。PBS洗微球三次，然后轉移至培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)皿中(三維靜止培養(yǎng)體系)或RWV容器中(三維旋轉培養(yǎng)體系)培養(yǎng)。臍血單個核細胞釋放與回收包裝于藻酸鹽微球內的細胞可以通過使用溶解緩沖液釋放和回收。藻酸鹽微球置于溶解緩沖液中緩速旋轉10分鐘后即可充分溶均為200g離心5分鐘，加入培養(yǎng)液重懸細胞，進行后續(xù)實驗。(3)細胞培養(yǎng)三維靜止培養(yǎng)系統其中，包裝后的三維藻酸鹽人臍血單個核細胞微球培養(yǎng)于靜止的培養(yǎng)皿中。細胞培養(yǎng)液為15%FBS-IMDM，加入下列細胞因子組合stemcellfactor(SCF,10-50ng/ml，R&Dsystems),flt-3-ligand(FL,5-20ng/ml，R&Dsystems),和thrombopoietin(TPO，5-20ng/ml,R&Dsystems)，置37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對三維靜止培養(yǎng)系統細胞因子組合合適的濃度進行選擇，培養(yǎng)過程中每三天半量換液，加入全量細胞因子。包裝后即刻(day0)與培養(yǎng)的第3、6、9、12天各回收30個微球內的細胞，臺盼藍染色計數活細胞數。以包裝后即刻回收的細胞為基數l，計算培養(yǎng)后第3、6、9、12天細胞擴增倍數。培養(yǎng)第12天回收其余所有微球內的細胞，檢測CD34陽性細胞比例，接種人克隆形成實驗培養(yǎng)基，并準備移植給N0D/SCID小鼠。三維旋轉培養(yǎng)系統在三維旋轉培養(yǎng)系統里，包裝后的藻酸鹽三維臍血單個核細胞微球培養(yǎng)于RWV10ml容器內，安裝于NASA旋轉培養(yǎng)生物反應器，置培養(yǎng)箱內，37°C，5%0)2培養(yǎng)。旋轉生物反應器設定轉速17rpm,可使微球懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液成分及細胞因子如上述。同上述，對三維旋轉培養(yǎng)系統擴增人臍血造血干祖細胞所需細胞因子組合的合適濃度進行選擇研究。細胞計數、CD34+細胞檢測、人克隆形成實驗接種和N0D/SCID小鼠移植同上。常規(guī)二維培養(yǎng)系統二維培養(yǎng)系統作為三維培養(yǎng)系統的對照，臍血單個核細胞直接培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，細胞呈懸浮生長模式，細胞培養(yǎng)液同上，本發(fā)明中，所用的細胞因子組合的濃度為三維培養(yǎng)系統優(yōu)化后的濃度。每三天半量換液，并加入全量細胞因子。細胞初始(第0天)培養(yǎng)密度為2X10Vral。培養(yǎng)后第3、6、9、12天臺盼藍染色計數活細胞數，細胞數超過lX107ml時重新接種細胞密度為2X107ml。以第0天細胞數為基數l，計算第3、6、9、12天細胞增殖倍數。培養(yǎng)第12天回收所有細胞，檢測CD34陽性細胞比例，接種人克隆形成實驗培養(yǎng)基，準備NOD/SCID小鼠移植。(4)造血干祖細胞檢測流式細胞儀檢測CD34+細胞取培養(yǎng)前(day0)臍血單個核細胞，于培養(yǎng)第12天(day12)收集三維培養(yǎng)系統釋放回收細胞及二維培養(yǎng)系統細胞各1~2X105，2%FBS-PBS洗一次，加入PE標記CD34單抗10u1，4。C避光放置30~40分鐘，2%FBS-PBS洗一次，加入200"12%FBS-PBS重懸細胞，加入4%多聚甲醛200p1(終濃度2%)，行流式細胞儀檢測。實驗設加入小鼠同型單克隆抗體，處理過程相同的同型對照?？寺⌒纬蓪嶒?Colonyformingcellassay,CFC):分別取培養(yǎng)前(day0)臍血單個核細胞和培養(yǎng)第12天三維及二維培養(yǎng)系統回收細胞，重懸于2%FBS-IMDM，調整細胞至12X10Vml。取分裝凍存Methocult培養(yǎng)基(3ral/支)37。C水浴鍋解凍，加入細胞懸液300ul，混勻，靜置5分鐘除去氣泡。3ml注射器16-g針頭吸取1.lml細胞-培養(yǎng)基混合物緩慢注入一個35mra培養(yǎng)皿中，每個樣本設2個重復培養(yǎng)皿，置飽和濕度、37'C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1214天。倒置顯微鏡下計數細胞數大于50個的細胞克隆(紅系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，計算每105細胞內紅系和粒巨系克隆數。(5)NOD/SCID小鼠異種移植模型NOD/SCID小鼠分組和移植NOD/SCID小鼠購自香港中文大學，飼養(yǎng)于獨立無菌籠內，飼以高溫消毒無菌飲食，所有對小鼠的操作于超凈臺內完成。移植模型設4組①y射線照射對照組3只小鼠，僅照射y射線，不移植任何細胞；②二維培養(yǎng)組(2D):6只小鼠，y射線照射后移植二維培養(yǎng)系統下培養(yǎng)第12天收集的細胞；③三維靜止培養(yǎng)組(3Dstatic):6只小鼠，y射線照射后移植三維靜止培養(yǎng)系統下培養(yǎng)第12天收集的細胞；轉培養(yǎng)組(3DRWV):5只小鼠，y射線照射后移植三維旋轉培養(yǎng)系統下培養(yǎng)第12天收集的細胞。實驗取6-8周雌性N0D/SCID小鼠，300-350cGy亞致死量全身照射一次。收集移植用人臍血單個核細胞，重懸于200iil5%FBS-IMDM。照射后24小時內經小鼠尾靜脈注射經培養(yǎng)的人臍血單個核細胞。移植后第4、6周，小鼠剪尾尖取血，流式細胞儀檢測小鼠外周血人源性CD45+細胞比例。移植后第8周，小鼠摘眼球取血，流式細胞儀檢測小鼠外周血人源性CD45+細胞比例，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠脾細胞及骨髓細胞，接種于人源性CFC培養(yǎng)基內，檢測人源性造血克隆形成能力。N0D/SCID小鼠外周血人源性CD45+細胞檢測第4、6、8周采集的小鼠外周血經EDTA抗凝，取50u1抗凝全血，加入鼠抗人CD45單抗1，4'C避光放置3040分鐘，加4mlACK緩沖液37。C水浴15分鐘，20(Jg離心5分鐘，2%FBS-PBS洗2次，加入200u12%FBS-PBS重懸細胞，加入4免多聚甲醛200ul(終濃度2%)，行流式細胞儀檢測。以Y射線照射組小鼠細胞為對照組計算人CD45+細胞數，以人源性CD45+細胞〉W為移植成功。N0D/SCID小鼠人源性造血克隆形成實驗取小鼠脾臟置于15%FBS-IMDM中研磨，70ym濾網濾出脾臟細胞，ACK緩沖液溶去混雜紅細胞，15%FBS-IMDM洗滌兩次。取小鼠雙側股骨，剪去頭端，lml15%FBS-IMDM沖洗出骨髓細胞，70ura濾網過濾，ACK緩沖液溶去混雜紅細胞，15%FBS-IMDM洗滌兩次。所取得小鼠脾細胞和骨髓細胞加5ml15%FBS-IMDM培養(yǎng)液，轉移至60mm培養(yǎng)皿中，37'C、5%002靜置4-8小時。吸取懸浮細胞并計數。細胞重懸于2%FBS-IMDM,調整細胞至廣2X107ml。取分裝凍存Methocult培養(yǎng)基(3ml/支)37'C水浴鍋解凍，加入細胞懸液300ul，混勻，靜置5分鐘除去氣泡，3ml注射器16-g針頭吸取1.lml細胞-培養(yǎng)基混合物緩慢注入一個35mm培養(yǎng)皿中，每個樣本設2個重復培養(yǎng)皿，置飽和濕度、37'C、5%Ca培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。倒置顯微鏡下計數細胞數大于50個的細胞克隆(紅系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，計算每106細胞內紅系和粒巨系克隆數。實驗數據以SD土SEM表示。兩組間比較采用t檢驗，組間差異采用方差分析。P<0.05認為有統計學差異。結果顯示,1.三維藻酸鹽微球內人臍血單個核細胞的包裝和釋放回收實驗中，人臍血單個核細胞重懸于1.1%藻酸鹽溶液或1.1%藻酸鹽-0.1%明膠溶液中，通過27-g的針頭逐滴滴入lOOmMCaCl2溶液中形成細胞-藻酸鹽微球。lml細胞-藻酸鹽溶液混合物平均可以形成176個微球(范圍135~200beads/ml)。微球呈圓球形和水滴形，直徑1.5~2.5咖(圖1)。包裝細胞單用藻酸鹽溶液可以形成的微球數為173±21beads/ml,包裝用藻酸鹽-明膠溶液可以形成的微球數為185±12beads/ml，兩組比較結果顯示是否加入明膠對形成的微球數無明顯影響(p〉0.05)。在一個微球內包裝的細胞數不同對形成的微球數無明顯影響(表1)。包裝完成的藻酸鹽微球在15%FBS-IMDM培養(yǎng)液中可以保持穩(wěn)定狀態(tài)超過3個月。使用溶解緩沖液可以溶解藻酸鹽微球，釋放包裝在其中的細胞。在這部分實驗中，經檢測lml溶解緩沖液10分鐘時間內最高可以溶解83個微球。表1.細胞包裝密度對形成藻酸鹽微球數的影響。(n=9)~單個藻酸鹽微球內包裝的細胞數形成的藻酸鹽微球數(beads/ml)各組間差異p>0.05。2.三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)條件優(yōu)化2.1.擴增人臍血單個核細胞所需細胞因子濃度本發(fā)明中，三種培養(yǎng)體系均應用了3種細胞因子的組合SCF、TPO和FL。根據現有技術的在擴增人造血干祖細胞時細胞因子使用的濃度，本實驗中，對下列四組細胞因子濃度做了評價1)中濃度細胞因子組(med-CKgroup):15%FBS-IMDM內加入SCF50ng/ml，TPO10000200002500030000450006000025ng/ml，FL20ng/ml;2)低濃度細胞因子組(low-CKgroup):15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，FLlOng/ml;3)極低濃度細胞因子組(xlow-CKgroup):15%FBS-IMDM內加入SCF10ng/ml，TPO5ng/ml，FL5ng/ml;4)無細胞因子組(no-CKgroup):僅使用15%FBS-IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)微臍血單個核細胞。在三維靜止培養(yǎng)系統中，檢測了以上4種不同濃度的細胞因子組合對包裝在藻酸鹽微球中的人臍血單個核細胞數量擴增的效果。結果顯示在三維靜止培養(yǎng)體系中，低濃度細胞因子組和中濃度細胞因子組的細胞總數均有明顯擴增，而以低濃度細胞因子組的細胞擴增的最為理想(圖2)。包裝在藻酸鹽微球中的臍血單個核細胞在低濃度細胞因子聯合支持下，于培養(yǎng)的第3天起表現出細胞數量的增加，第6天起顯微鏡檢可見細胞克隆出現，細胞克隆的數量及大小隨培養(yǎng)時間延長而增加增大(圖3)，回收到的細胞總數亦隨培養(yǎng)時間延長而增加(表2)。在無細胞因子組和極低細胞因子組未能觀察到微球內有細胞克隆出現。實驗結果提示在三維靜止培養(yǎng)系統內，低濃度細胞因子組為培養(yǎng)擴增人臍血單個核細胞的較適宜的細胞因子濃度。表2.不同細胞因子濃度組對藻酸鹽三維微球內包裝的人臍血單個核細胞總數擴增倍數的影響。(n=18)細胞因子濃度day0day3day6day9day12無細胞因子組12.050±0.5361.558±0.2041.406±0.2681.326±0.316極低濃度組11.804±0.251U23±0.2031.779±0.2901.500±0.186低濃度組13.603±0.389*4.551±0.333*5.478±0.516*5.887±0.723*中濃度組12.756±0.8973.259±U513.569±U42*3.357±1.119**與無細胞因子組比較，；^0.05;與常規(guī)傳統培養(yǎng)系統相比，三維靜止培養(yǎng)系統僅需要低濃度的SCF、TPO和FL組合支持就可獲得較好的臍血單個核細胞擴增的效果。在三維旋轉培養(yǎng)系統內，包裝在藻酸鹽微球內在旋轉培養(yǎng)容器內豎直旋轉，細胞培養(yǎng)液和培養(yǎng)液內的細胞因子可以得到充分的混合均勻分布，為培養(yǎng)在其內的細胞提供更有效的養(yǎng)分和氣體交換。因此，根據三維靜止培養(yǎng)系統的結果，在三維旋轉培養(yǎng)系統，測試了下述三個細胞因子濃度組對包裝在藻酸鹽三維微球中人臍血單個核細胞的擴增的影響1)低濃度細胞因子組(low-CKgroup):15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，FL10ng/ml:2)極低濃度細胞因子組(xlow-CKgroup):15%FBS-IMDM內加入SCFlOng/ml,TPO5ng/ml，FL5ng/ml;3)無細胞因子組(no-CKgroup):僅使用15%FBS-IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)微球內臍血單個核細胞。實驗結果顯示，三維旋轉培養(yǎng)系統培養(yǎng)條件下，在極低濃度細胞因子組和低濃度細胞因子組，均可見到微球內有造血克隆生成(圖5)。臍血單個核細胞在極低濃度細胞因子組和低濃度細胞因子組均可以得到明顯擴增，與無細胞因子組相比有明顯差異，與第O天時相比均有明顯增加(p值均小于0.05)。極低濃度細胞因子組細胞擴增倍數于培養(yǎng)第3、6天較低濃度細胞因子培養(yǎng)組略高，至培養(yǎng)第9、12天與低濃度細胞因子培養(yǎng)組擴增倍數相似。經統計學檢驗，兩組在第3、6、9、12的細胞擴增倍數無明顯差異(p值均大于0.10)。實驗結果提示在三維旋轉培養(yǎng)系統內，極低濃度細胞因子組為培養(yǎng)擴增人臍血單個核細胞的較適宜的細胞因子濃度。表3不同細胞因子濃度組對三維旋轉培養(yǎng)系統培養(yǎng)藻酸鹽三維微球內包裝的人臍血單個核細胞總數擴增倍數的影響。(n=18)細胞因子濃度day0day3day6day9day12無細胞因子組10.卯5±0.1741.408±0.3111.838±0.8940.950±0.175極低濃度組13.924±U17*4.759±0.971*3.776±0.5084.032±0.707**低濃度組12.425±0.831#3.128±0.589*#3.761±0,341#4.413±0.936*#與無細胞因子組比較，*:/7<0.05:**:pO.01;#示與極低濃度組;>0.12.2.藻酸鹽微球中包裝細胞的適宜密度本發(fā)明中，使用藻酸鹽包裝細胞時，首先需用藻酸鹽溶液重懸需包裝的細胞。根據重懸的細胞數量可以調節(jié)包裝在藻酸鹽微球內的細胞密度。本發(fā)明測試了不同的細胞包裝密度對臍血單個核細胞擴增的影響，確定最合適的細胞包裝密度。實驗中檢測了以下各組細胞包裝密度單個藻酸鹽微球內包裝有5,000、10，000、20，000、25，000、30,000、45,000、60，000個臍血單個核細胞。包裝了細胞的微球培養(yǎng)在靜止系統內，所用細胞因子濃度為低濃度組細胞因子。實驗結果顯示20，000和25，000細胞組的細胞隨培養(yǎng)時間而增長，單個藻酸鹽微球內包裝的細胞多于30，000個或少于10，000個，細胞的增長均不明顯(圖6、表4)。lml1.1%藻酸鹽溶液內重懸的臍血單個核細胞數為4~5X106，則包裝出來的單個藻酸鹽三維微球里細胞數在20，000~25,000范圍內。表4.三維藻酸鹽微球內不同包裝細胞密度組培養(yǎng)后細胞增長倍數。(n-9)細胞密度(個/微球)day0day3day6day9day125,00010.663±0.0181.065±0.1150.473±0扁0.426±0.02310,00012.005±0.8551.519±0.3401.741±0.2681.525±0.41820,00013.397±0.3214.447±0.3975.259±0.5345.125±0.62325，13.182±0.7773.666±0.5864.630±0.8775.581±1.427>30，00011.906±0.3821.166±0.1861.384±0.1811.269±0.1432.3.包裝臍血單個核細胞的藻酸鹽溶液中加入明膠對細胞擴增的影響明膠(gelatin)常用于包被培養(yǎng)皿加強培養(yǎng)細胞貼壁，明膠用于藻酸鹽的包裝見于包裝貼壁細胞。本發(fā)明評價了在藻酸鹽溶液中加入0.1%明膠與否對臍血單個核細胞擴增的影響。人臍血單個核細胞分別被包裝于1.1%藻酸鹽和1.1%藻酸鹽-0.1%明膠，微球被培養(yǎng)于靜止培養(yǎng)皿中，所用細胞因子組濃度為低濃度組。實驗結果顯示包裝細胞時加入明膠對擴增臍血單個核細胞無明顯影響(見圖7、表5)。表S.包裝細胞藻酸鹽溶液加入與不加入O.P/。明膠細胞擴增倍數。(n=12)細胞包裝藻酸鹽溶液dayOday3day6day9day12不加入明膠(gelatin-)13.742±0.6874.458±0.5005.299±0.6846.027±1扁加入明膠(gelatin+)13.442±0.4194.658±0.5165.688±0.9065.723±U46各組間iX).05。18根據以上實驗結果，本發(fā)明確定了人臍血單個核細胞培養(yǎng)于三維藻酸鹽納米培養(yǎng)系統的適宜條件1)細胞因子濃度a)三維靜止培養(yǎng)系統15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，FL10ng/ml;b)三維旋轉培養(yǎng)系統15%FBS-IMDM內加入SCFlOng/ml,TPO5ng/ml,FL5ng/ml或15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，FL10ng/ral，如考慮到經濟學因素，則以15%FBS-IMDM內加入SCF10ng/ral，TP05ng/ml，FL5ng/ml為更適宜條件。2)細胞包裝密度4~5乂106人臍血單個核細胞重懸于1ml1.1%藻酸鹽溶液，包裝后單個微球含20,000~25，000個細胞。3)包裝細胞使用1.1%藻酸鹽溶液。3.常規(guī)二維培養(yǎng)系統與三維培養(yǎng)系統擴增人臍血單個核細胞數倍數按確定的人臍血單個核細胞包裝與藻酸鹽三維微球培養(yǎng)系統的適宜條件后，培養(yǎng)人臍血單個核細胞，比較三維靜止培養(yǎng)系統、三維旋轉培養(yǎng)系統和常規(guī)二維培養(yǎng)系統下人臍血單個核細胞體外培養(yǎng)12天，細胞總數擴增倍數，常規(guī)二維培養(yǎng)系統采用的細胞因子濃度為低濃度細胞因子組(SCF20ng/ml,TPO10ng/ml，FL10ng/ml)。實驗結果顯示，在低濃度細胞因子支持下，常規(guī)二維培養(yǎng)系統培養(yǎng)的人臍血單個核細胞總數在逐漸減少。三維培養(yǎng)系統下，培養(yǎng)第3天起，人臍血單個核細胞開始在藻酸鹽微球內擴增，細胞擴增最多可達5.887土0.723倍。三維旋轉培養(yǎng)系統下培養(yǎng)第3、6、12天細胞擴增倍數與三維靜止培養(yǎng)系統無明顯差異(見圖8、表6)。實驗結果表明，在低濃度的細胞因子培養(yǎng)支持下，常規(guī)二維培養(yǎng)體系無法使人臍血單個核細胞擴增，而在三維靜止培養(yǎng)系統下即可實現細胞的明顯擴增，而三維旋轉培養(yǎng)系統在實現相仿的細胞擴增時所需的細胞因子濃度則更低。表6.不同培養(yǎng)系統培養(yǎng)人臍血單個核細胞，細胞擴增倍數(n=18)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與二維低濃度細胞因子組比較，p<0.05*S與三維靜止低濃度細胞因子組比較，p<0.054.常規(guī)二維培養(yǎng)系統與三維培養(yǎng)系統下人臍血單個核細胞中CD34+細胞的擴增臨床實踐中常以CD34+細胞來評價移植物的造血干祖細胞比例。本發(fā)明中，經流式細胞儀檢測，從臍血分離(新鮮和解凍后)的單個核細胞中平均有2.60±0.52%的CD34+細胞。培養(yǎng)后，常規(guī)二維培養(yǎng)系統下培養(yǎng)第12天的回收的細胞中CD34+細胞比例下降到0.45±0.17%。三維靜止培養(yǎng)系統下第12天回收的細胞中CD34+細胞比例明顯增加，達到13.27±2.65%，三維旋轉培養(yǎng)系統下第12天回收的細胞中CD34+細胞比例亦明顯增加至18.08±1.49%,與二維培養(yǎng)系統比較，p值均小于0.001。5.常規(guī)二維培養(yǎng)系統與三維培養(yǎng)系統下人臍血單個核細胞造血克隆形成實驗分離獲得的人臍血單個核細胞(新鮮和解凍后)的紅系克隆形成細胞(BFU-E)為(1213.93±183.76)/105cell，粒巨系克隆形成細胞(CFU-G/GM)為(363.34±34,47)/105cell。經過12天的培養(yǎng)后，二維與三維培養(yǎng)系統培養(yǎng)的細胞其紅系克隆形成細胞均較培養(yǎng)以前明顯下降，二維與三維各培養(yǎng)系統培養(yǎng)后細胞的紅系克隆形成細胞數之間無明顯差異。經過12天培養(yǎng)后，二維培養(yǎng)系統培養(yǎng)后的細胞其粒巨系克隆形成細胞數與培養(yǎng)以前相比無明顯差異，而三維培養(yǎng)系統培養(yǎng)的細胞其粒巨系克隆形成細胞數均較培養(yǎng)以前明顯增加，其中以三維靜止培養(yǎng)系統的增加更為明顯。見圖10、表7。表7.二維與三維培養(yǎng)系統培養(yǎng)人臍血單個核細胞前后造血克隆形成細胞數。(11=8)培養(yǎng)以前常規(guī)二維培養(yǎng)系統三維靜止培養(yǎng)系統(低濃度CK組)三維旋轉培養(yǎng)系統(極低濃度CK組)三維旋轉培養(yǎng)系統(低濃度CK組)BFU-E(/105ceH)CFU-G/GM(/10scell)1213.93±183.76363.34±34.47211.18±100.75*532.92±82.97186.2U80.il*3423.33±645.14**#121.76±38.43*1262.64±332.04**#62.50±42.50*1943.95±48.18**#*:與培養(yǎng)以前相比，/K0.05;**:與培養(yǎng)以前相比，/K0.01;#:與常規(guī)二維培養(yǎng)系統相比，"0.056.NOD-SCID小鼠移植模型6.1.NOD-SCID小鼠移植培養(yǎng)后人臍血單個核細胞NOD-SCID小鼠用于移植共分為4組，如前所述。移植人臍血單個核細胞數1)二維培養(yǎng)組移植二維培養(yǎng)系統低濃度細胞因子培養(yǎng)12天的細胞，平均每只小鼠移植單個核細胞數21.92士6.42X102)三維靜止培養(yǎng)組移植三維靜止培養(yǎng)系統低濃度細胞因子培養(yǎng)12天的細胞，平均每只小鼠移植單個核細胞數6.59土1.00X10、3)三維旋轉培養(yǎng)組移植三維旋轉培養(yǎng)系統極低濃度細胞因子培養(yǎng)12天的細胞，平均每只小鼠移植單個核細胞數4.17±0.27X106。移植第8周，各組小鼠存活率1)Y射線照射對照組2/3;2)二維培養(yǎng)組2/6;3)三維靜止培養(yǎng)組3/6;4)三維旋轉培養(yǎng)組3/5。6.2.NOD-SCID小鼠移植后外周血人源性CD45+細胞比例由于流式細胞儀檢測小鼠外周血人源性CD45+細胞比例所用的單克隆抗體為小鼠源性，為去除鼠源性抗體和小鼠血細胞的非特異性結合導致的假陽性，流式細胞儀檢測以Y射線照射對照組小鼠外周血為對照，計算各實驗組的人源性CD45+細胞比例。結果顯示二維和三維靜止、三維旋轉培養(yǎng)組的小鼠外周血人源性CD45+細胞比例呈現統一的趨勢:移植后第4周人源性CD45+細胞均大于1%，移植后第6周人源性CD45+細胞比例均較第4周時降低，移植后第8周人源性CD45+細胞比例再次升高，二維培養(yǎng)組平均2.94±0.49%，三維靜止培養(yǎng)組平均8.30±1.13%，三維旋轉培養(yǎng)組平均11.35±2.06%。三維培養(yǎng)組小鼠外周血人源性CD45+細胞比例均較二維培養(yǎng)組明顯增高。而移植所用細胞數三維培養(yǎng)組遠遠低于二維培養(yǎng)組(p<0.05)。6.3.NOD-SCID小鼠移植后脾細胞、骨髓細胞人源性造血克隆形成數N0D-SCID移植后第8周處死取脾細胞和骨髓細胞，所取得細胞經前述貼壁過程去除貼壁細胞，將懸浮細胞接種于人源性克隆形成實驗培養(yǎng)基，含人源性造血細胞因子。經過兩周的培養(yǎng)，y射線照射對照組均未見任何造血集落集簇形成，顯微鏡下僅見單個細胞存在于半固體培養(yǎng)基中。這一結果說明經過貼壁過程可以去除分泌鼠源性造血細胞因子的細胞(如骨髓基質細胞)，排除鼠源性造血干祖細胞在人源性造血克隆形成實驗中生長而導致的假陽性結果。實驗結果顯示，二維培養(yǎng)組和三維靜止培養(yǎng)組、三維旋轉培養(yǎng)組小鼠的脾細胞和骨髓細胞于人源性克隆形成實驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，均可見到有造血克隆形成。粒巨系克隆形成細胞數均表現為三維靜止培養(yǎng)組最高，三維旋轉培養(yǎng)組與二維培養(yǎng)組相仿。三維旋轉培養(yǎng)組和二維培養(yǎng)組的脾細胞均未見紅系克隆形成。骨髓細胞的紅系克隆形成細胞以二維培養(yǎng)組為最多。三維培養(yǎng)兩組間相仿。表8,NOD-SCID小鼠移植人臍血單個核細胞后人源性造血克隆形成實驗造血克隆數脾細胞骨髓細胞(/106cell)BFU-ECFU-G/GMBFU誦ECFU-G/GMY射線照射對照組(control)常規(guī)二維培養(yǎng)系統(2D)三維靜止培養(yǎng)系統(3Dstatic)三維旋轉培養(yǎng)系統(3DRWV)007.3±4.3*0013.9±6.7*52.7±39.7*13.1±9.5*0342.1±192.7*20.4±12.6*29.2±9.7*092.1±47.7*295.8±173.9*96.8±30.7**-與Y射線照射對照組相比，；^o.05;N0D-SCID小鼠移植模型結果顯示，經培養(yǎng)后的人臍血單個核細胞可以在N0D-SCID小鼠體內移植成活，并重建人源性的造血。三維靜止培養(yǎng)系統和三維旋轉培養(yǎng)系統擴增的人臍血單個核細胞移植細胞數量為106級別，常規(guī)二維培養(yǎng)系統移植的細胞數為107級別，相比較而言，移植后第8周，三維培養(yǎng)系統擴增的細胞在小鼠體內重建粒巨系集落能力強于二維系統，小鼠外周血人源性細胞比例亦明顯高于二維系統。2權利要求1、一種造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統體外擴增人臍血造血干祖細胞。2、按權利要求1所述的造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)方法是通過改變人臍血單個核細胞體外培養(yǎng)的環(huán)境，用三維藻酸鹽包裝細胞進行靜止或旋轉狀態(tài)的培養(yǎng)，擴增人臍血造血干祖細胞，包括下述步驟1)選取SCF、TPO和FL三種細胞因子聯合應用支持臍血單個核細胞中造血干祖細胞的擴增，不加用其他細胞因子；2)將人臍血單個核細胞包裝在藻酸鹽微球內分別培養(yǎng)于三維靜止培養(yǎng)系統或三維旋轉培養(yǎng)系統，確定培養(yǎng)條件，觀察臍血單個核細胞的擴增效果；3)采用NOD/SCID小鼠移植模型評價經培養(yǎng)后的人臍血單個核細胞；4)通過造血克隆形成實驗評價造血干細胞在體外培養(yǎng)過程中向不同系列分化的造血能力。3、按權利要求2所述的造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的人臍血單個核細胞培養(yǎng)于三維藻酸鹽納米培養(yǎng)系統的條件是細胞因子濃度a)三維靜止培養(yǎng)系統15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TP010ng/ml,FL10ng/ml;b)三維旋轉培養(yǎng)系統15%FBS-IMDM內加入SCF10ng/ml，TP05ng/ml,FL5ng/tnl或15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，FLlOng/ml;細胞包裝密度45xl(^人臍血單個核細胞重懸于lml1.1%藻酸鹽溶液，包裝后單個微球含20，000~25,000個細胞。4、按權利要求2所述的造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟l)的細胞因子使用濃度，以15%FBS-IMDM內加入SCF20ng/ml，TP010ng/ml，FL10ng/ml為低濃度細胞因子組；以15%FBS-IMDM內加入SCF10ng/ml，TP05ng/ml，FL5ng/ml為極低濃度細胞因子組。5、按權利要求2所述的造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟2)的三維旋轉培養(yǎng)系統采用旋轉的生物反應器容器。6、按權利要求2所述的造血千祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟3)的NOD/SCID小鼠異種移植模型評價造血干細胞的方法是，采用亞致死量照射，尾靜脈注射以移植培養(yǎng)后人源性臍血單個核細胞，移植后第8周評價小鼠外周血人源性血細胞、骨髓細胞和脾細胞人源性造血克隆形成能力，評價移植物中造血千細胞。7、按權利要求2所述的造血干祖細胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟4)的造血克隆形成實驗是，采用培養(yǎng)后的人臍血單個核細胞接種于半固體含各系列血細胞生長因子的培養(yǎng)基，經14天培養(yǎng)評價形成的克隆，評價經培養(yǎng)后人臍血造血干細胞繼續(xù)分化的能力。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術領域：
，涉及一種采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統體外擴增人臍血造血干祖細胞的方法。本發(fā)明聯合應用SCF、TPO和FL細胞因子支持臍血單個核細胞中造血干祖細胞的擴增，不加用其他細胞因子，采用包裝在藻酸鹽微球內的人臍血單個核細胞培養(yǎng)于三維靜止培養(yǎng)系統和三維旋轉培養(yǎng)系統，觀察臍血單個核細胞包裝于藻酸鹽微球內后在旋轉培養(yǎng)系統的擴增效果。與常規(guī)二維系統比較，本發(fā)明在低濃度細胞因子培養(yǎng)條件下，細胞總數上升，CD34+細胞明顯增加；在三維培養(yǎng)體系擴增的細胞其粒巨系克隆形成細胞亦明顯增多，移植NOD/SCID小鼠可在移植細胞總數少的情況下，在小鼠體內更好植活，重建造血。文檔編號C12N5/08GK101597594SQ20091015102公開日2009年12月9日申請日期2009年6月26日優(yōu)先權日2009年2月3日發(fā)明者燕袁,毅謝申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院