專利名稱：對(duì)3,4-DGE來(lái)源的AGEs特異性反應(yīng)的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs : advanced glycation endproducts )的4元體以及Y吏用了 i亥4元體的AGEs才企測(cè)方 法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)(梅拉德反應(yīng))是氨基酸、肽、蛋白質(zhì) 的氨基與酮、醛(特別是還原糖)的非酶反應(yīng)，分為前期階段 和后期階段的2個(gè)反應(yīng)。前期階段的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，例如氨基 與還原糖發(fā)生反應(yīng)形成希夫堿，接著通過(guò)分子內(nèi)重排反應(yīng)形成 阿馬道里化合物為止的反應(yīng)。另一方面，后期階段的反應(yīng)是不 可逆反應(yīng)，前述阿馬道里化合物經(jīng)過(guò)重排、縮合等復(fù)雜的反應(yīng) 過(guò)程，形成稱為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的穩(wěn)定物質(zhì)。作 為前述AGEs，例如已知有羧甲賴氨酸(CML)、戊糖素、吡咯 素、交聯(lián)素等，但認(rèn)為生物體內(nèi)還存在多種結(jié)構(gòu)不明確的未知 AGEs。近年來(lái)，前述梅拉德反應(yīng)的產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注， 發(fā)表了其與各種疾病、疾患、老化的相關(guān)性。其中已知的是，公知的AGEs不僅降低蛋白質(zhì)的功能，而且還誘發(fā)細(xì)胞障礙性反 應(yīng)、炎癥反應(yīng)，而且，還認(rèn)為由于AGEs的形成，蛋白質(zhì)發(fā)生凝 集、不溶而在組織中異常地蓄積，由此使組織變性。另外，糖 尿病患者的血紅蛋白A1C (前期反應(yīng)的阿馬道里化合物)的上 升、AGEs在糖尿病性腎病、慢性腎功能不全的腎臟、動(dòng)脈硬化 病變部位的蓄積被認(rèn)為是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)的代表 例。
在測(cè)定上述梅拉德反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，除了高效液相色譜法、氣 相色譜法之外，還已知免疫學(xué)的測(cè)定方法。其中，由于簡(jiǎn)j更且 不需要特殊分析儀器等理由，免疫學(xué)檢測(cè)方法，具體為免疫組 織學(xué)方法、酶免疫學(xué)測(cè)定方法等在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究、臨床診斷中被廣泛使用。由此，制作了各種與糖基化蛋白質(zhì)、AGEs特異 性反應(yīng)的抗體。具體地，制備了抗CML、戊糖素、交聯(lián)素、吡 咯素的抗體，報(bào)道了對(duì)老化、糖尿病、腎病等患病動(dòng)物的組織 的免疫學(xué)研究(例如非專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3、 非專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)5)。另外，還報(bào)告了利用抗CML抗 體作為糖尿病標(biāo)記的方法(專利文獻(xiàn)l),還報(bào)告了作為AGEs 的N5-( 5-鞋基-4，6-二甲基嗜啶-2-基)鳥氨酸的單克隆抗體(專 利文獻(xiàn)2 )。另外，已確認(rèn)在前述梅拉德反應(yīng)的前期階段、生物體內(nèi)的 糖類代謝分解、還原糖的熱分解等過(guò)程中，還原糖發(fā)生分解并 生成3-脫氧葡糖醛酮(3-DG)、曱基乙二醛、乙二醛等羰基化 合物。報(bào)告指出這些3-DG、曱基乙二醛、乙二醛與蛋白質(zhì)的反 應(yīng)性強(qiáng)，是與前述AGEs生成密切相關(guān)的有效的中介體(以下也 稱為"AGEs前體")。而且，來(lái)自于這些羰基化合物的AGEs大量 地存在于血液透析患者的血液內(nèi)，因此推測(cè)其與透析并發(fā)癥有 關(guān)(非專利文獻(xiàn)6、非專利文獻(xiàn)7)。這樣，還原糖的分解產(chǎn)物作為產(chǎn)生AGEs的原因物質(zhì)備受關(guān) 注，正被進(jìn)行研究。但是，還原糖的分解途徑很復(fù)雜，雖然已 知生成多種多樣的羰基化合物，而實(shí)際上何種羰基化合物與 AGEs的生成相關(guān)、并且來(lái)自于這些羰基化合物的AGEs還有很 多未被確認(rèn)。因此，以AGEs定量為代表的AGEs的研究中，通 常利用結(jié)構(gòu)明確的AGEs、特別是用CML代為使用。非專利文獻(xiàn)l: Schleicher, E. D. et al., J. Clin. Invest. 99, 457，1997非專利文南大2: Sanaka， T. et al" Nephron 91， 64, 2002 非專利文南史3: Obayashi, H. et al.， Biochem. Biophys. ResComm亂226， 37， 1996非專利文獻(xiàn)4: Miyata, S. and Monnier， V.， J. Clin. Invest. 891102， 1992非專利文獻(xiàn)5: Hayase, F. et al.， J. Biol. Chem. 263, 3758，1989非專利文獻(xiàn)6:竹內(nèi)正義等，日本臨床60巻、增刊號(hào)8、 2002 年、日本臨床社非專利文獻(xiàn)7: Takeuchi， M. et al" Molecular Medicine 7， 783， 2001專利文獻(xiàn)l:日本特開平9-178740號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)2:日本特開平ll-246599號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明需要解決的技術(shù)問題因此，在醫(yī)療領(lǐng)域中尋求對(duì)蓄積在生物體內(nèi)并具有生物活 性的能夠成為各種疾病、疾患原因的新型AGEs進(jìn)行分析和測(cè)定 的方法。因此，本發(fā)明的目的在于特別指定與蛋白質(zhì)、肽的反應(yīng)性 強(qiáng)、即AGEs產(chǎn)生能力高的羰基化合物，并提供來(lái)自于前述羰基 化合物的AGEs的抗體，以及提供使用了前述抗體的前述AGEs 的檢測(cè)方法。用于解決技術(shù)問題的方法本發(fā)明的抗體的特征在于，其為抗晚期糖基化終末產(chǎn)物 (AGEs )的抗體，所述AGEs是3,4-二脫氧葡糖醛酮-3-烯(3,4-DGE)與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物。 發(fā)明的效果本發(fā)明人等反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與公知的AGEs 前體(即，成為蛋白質(zhì)等的AGEs化原因物質(zhì)的羰基化合物等) 相比，由葡萄糖產(chǎn)生的羰基化合物(3，4-DGE)與蛋白質(zhì)的反 應(yīng)性極高，對(duì)生物體機(jī)能產(chǎn)生很大影響。而且，基于該見解， 制造了抗前述3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物的抗體，從而 完成了本發(fā)明。這樣，由于本發(fā)明的抗體為特異性地識(shí)別 3，4-DGE和蛋白質(zhì)等的反應(yīng)產(chǎn)物的抗體，因此能夠高效地檢測(cè) 被認(rèn)為對(duì)生物體機(jī)能具有很大影響的3 ，4-DGE來(lái)源的AGEs 。因 而，認(rèn)為對(duì)被推測(cè)為與前述3，4-DGE來(lái)源的AGEs相關(guān)的后述各 種疾患的診斷、治療有用。


圖l為本發(fā)明的實(shí)施例中用于求出抗3,4-DGE-RSA抗體的 結(jié)合常數(shù)的曲線圖。圖2( A)和(B )為顯示本發(fā)明另 一實(shí)施例的抗3，4-DGE-RSA 抗體的反應(yīng)特異性的曲線圖。圖3為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例的抗3，4-DGE-RSA抗體的 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片。圖4為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例中將人腹膜間皮細(xì)胞暴露 于3，4-DGE后，與抗3,4-DGE-RSA抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的結(jié) 果的照片，(a)為對(duì)照組的結(jié)果，(b)和(c)為實(shí)施例的結(jié)果。圖5為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例中將大鼠腹腔暴露于透析 液后，與抗3,4-DGE-RSA抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果的照 片，(A)為對(duì)照組的結(jié)果，(B)為使用含2pM 3,4-DGE透析液 的結(jié)果，(C)為使用含58pM 3,4-DGE透析液的結(jié)果。
圖6 ( A )和(B )為顯示本發(fā)明的另 一 實(shí)施例中抗 3，4-DGE-RSA抗體的反應(yīng)特異性的曲線圖。圖7為用于求出前述實(shí)施例中抗3,4-DGE-RSA抗體的結(jié)合常數(shù)的曲線圖。圖8為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例中抗3，4-DGE-RSA抗體與 3，4-DGE以及蛋白質(zhì)的反應(yīng)時(shí)間不同的AGEs化蛋白質(zhì)的反應(yīng) 性的曲線圖。圖9為顯示本發(fā)明的參考例中3，4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)液 的呈色的照片。圖IO為顯示前述參考例中3，4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)中熒光 強(qiáng)度隨時(shí)間的變化的曲線圖。圖ll為顯示前述參考例中，3，4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物 中Arg殘基和Lys殘基殘存率的隨時(shí)間變化的曲線圖，(A )為Arg 殘基的殘存率、(B)為L(zhǎng)ys殘基的殘存率。圖12為顯示前述參考例中，3，4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物 的等電點(diǎn)隨時(shí)間變化的曲線圖。圖13為顯示前述參考例中，3,4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物 的SDS-PAGE隨時(shí)間變化的曲線圖，(A )為3,4-DGE的結(jié)果，(B ) 為MGO的結(jié)果。圖14為顯示本發(fā)明的另 一參考例中各種羰基化合物對(duì)蛋白 質(zhì)的反應(yīng)性的曲線圖。圖15為顯示本發(fā)明的另 一 參考例中各種羰基化合物和蛋白 質(zhì)的產(chǎn)物的細(xì)胞毒性的曲線圖。圖16為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例的抗3,4-DGE-RSA抗體 的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片。圖17為顯示本發(fā)明的另 一實(shí)施例的抗3,4-DGE-RSA抗體 的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片。
具體實(shí)施方式
如上所述，本發(fā)明的抗AGEs抗體為抗3，4-DGE與蛋白質(zhì)或 肽的反應(yīng)產(chǎn)物AGEs的抗體。本發(fā)明的抗AGEs抗體優(yōu)選不與如下物質(zhì)反應(yīng)為作為7>知 的AGEs前體的曱基乙二醛(MGO )、乙二醛(GO)、 3-脫氧葡 糖醛酮(3-DG)、 5-羥甲基糠醛(5-HMF )、糠醛(Fur)、甲趁 (FA)、葡萄糖(Glu)、乙醛(AA)等羰基化合物來(lái)源的AGEs， 特別是前述羰基化合物與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物。而且，本發(fā) 明的抗AGEs抗體優(yōu)選不與作為公知AGEs的具有戊糖素殘基和 羧曱賴氨酸(CML)殘基中至少一種殘基的蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)。以下說(shuō)明本發(fā)明的抗AGEs抗體的制備方法之一例。 (1 )作為抗原(免疫原)的AGEs的制備通過(guò)使3,4-DGE和蛋白質(zhì)(或肽，以下相同)發(fā)生梅拉德 反應(yīng)，從而制備AGEs。如在后述的參考例1中所示，相比于參 與AGEs化的甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)、 3-脫氧葡糖 醛酮(3-DG)等公知的AGEs前體，3，4-DGE對(duì)蛋白質(zhì)的反應(yīng) 性極高。因此如果混合3，4-DGE和蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育，則3，4-DGE 導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生AGEs化，獲得反應(yīng)產(chǎn)物AGEs。AGEs化的有無(wú)通?？赏ㄟ^(guò)3，4-DGE與蛋白質(zhì)的反應(yīng)液是 否呈褐色來(lái)判斷，其發(fā)展可以通過(guò)褐色的濃度變化進(jìn)行判斷。 另外，對(duì)于前述反應(yīng)液的褐色化，在后面的參考例中說(shuō)明(參 照?qǐng)D9)。另外，通過(guò)3,4-DGE帶來(lái)的蛋白質(zhì)的AGEs化，反應(yīng)產(chǎn) 物呈現(xiàn)熒光，因此還可以通過(guò)例如熒光強(qiáng)度來(lái)判斷AGEs的有 無(wú)。熒光強(qiáng)度的測(cè)定條件沒有特別限定，例如激發(fā)波長(zhǎng)為320 370nm、熒光波長(zhǎng)為400 ~ 470nm,優(yōu)選激發(fā)波長(zhǎng)為345nm、熒 光波長(zhǎng)為425nm。使3,4-DGE發(fā)生梅拉德反應(yīng)的蛋白質(zhì)沒有任何限制，例如可以舉出血清白蛋白等白蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白、血藍(lán)蛋 白等，其來(lái)源也可以舉出例如兔子、牛、人等各種哺乳類，雞、鵪鶉等各種鳥類等。作為具體例子例如可以舉出RSA (兔血清 白蛋白)、BSA (牛血清白蛋白)、HSA (人血清白蛋白)、卵清 蛋白等。另外，肽可以是天然肽、合成肽的任一種，還可以是 寡肽和多肽。所制作的抗體可以與反應(yīng)程度(例如3，4-DGE的添加量) 無(wú)關(guān)地檢測(cè)出3 ，4-DGE來(lái)源的AGEs 。為了使制備抗原時(shí)的蛋白 質(zhì)完全AGEs化，例如必須添加相對(duì)于蛋白質(zhì)的NH2基為等量以 上的3,4-DGE，例如優(yōu)選以相對(duì)于蛋白質(zhì)的氨基達(dá)到O.l ~ 100 當(dāng)量、更優(yōu)選為1 10當(dāng)量、特別優(yōu)選為3 ~ 5當(dāng)量的量添加 3，4-DGE。另外，為了充分地進(jìn)行AGEs化，還可以進(jìn)行2次以 上對(duì)蛋白質(zhì)添加3，4-DGE。3,4-DGE和蛋白質(zhì)的孵育溫度沒有特別限制，例如為25 ~ 50°C、優(yōu)選為35 40。C，每次的孵育時(shí)間也沒有特別限制，例 如為3~14天、優(yōu)選為7~10天。3 ，4-DGE和蛋白質(zhì)的反應(yīng)通常優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，其pH 值例如為6~8、優(yōu)選為7~7.5。緩沖液的種類、濃度沒有特別 限制，可以根據(jù)所需的pH選擇，例如可以舉出磷酸緩沖液、馬 來(lái)酸氫鈉-NaOH緩沖液等，優(yōu)選其中不含氨基。反應(yīng)液的緩沖 液濃度也沒有特別限制，例如為10~ 500mM的范圍。前述反應(yīng)液中還可以添力。二亞乙基三胺五乙酸(DTPA )等 螯合劑，其濃度例如為1 ~ 100mM的范圍。如果蛋白質(zhì)通過(guò)3,4-DGE發(fā)生AGEs化時(shí)，則反應(yīng)產(chǎn)物 AGEs通常發(fā)出熒光或者產(chǎn)生褐色。因此，例如如上所述地通過(guò) 目測(cè)觀察反應(yīng)產(chǎn)物或者測(cè)定熒光強(qiáng)度可以確認(rèn)有無(wú)AGEs化。所得的反應(yīng)產(chǎn)物(AGEs)通常為了脫鹽、除去低分子化合
物(例如未反應(yīng)3，4-DGE等)，優(yōu)選進(jìn)行透析并過(guò)濾除菌后，用 作免疫原。(2)抗體的制備抗體的制備方法沒有任何限制，例如通過(guò)進(jìn)行對(duì)動(dòng)物的免 疫致敏而產(chǎn)生抗體的現(xiàn)有公知的方法，可以制備多克隆抗體和 單克隆抗體。使發(fā)生免疫致敏的宿主動(dòng)物的種類沒有特別限定， 例如可以使用人；兔子、大鼠、小鼠、山羊、綿羊、馬、豬、 豚鼠等人以外的哺乳動(dòng)物；雞、鴿子、鴨子、鵪鶉等鳥類等。 另外，抗原的給藥途徑也沒有特別限制，可以采用皮內(nèi)給藥、 皮下給藥、腹腔內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥等，優(yōu)選皮 下給藥、腹腔內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥，更優(yōu)選皮下給藥。例如，當(dāng)制備多克隆抗體時(shí)，可以將前述抗原(AGEs)給 藥到前述宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫，從回收的血清、腹水液等中分離 提純抗AGEs抗體。另外，當(dāng)制備單克隆抗體時(shí)，例如將免疫的 宿主動(dòng)物的脾臟細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞等抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞融合制備雜交瘤，使前述雜交瘤增殖，將產(chǎn)生具有特異性的 抗體的雜交瘤細(xì)胞分離，從而可以獲得單克隆抗體。多克隆抗體和單克隆抗體的提純方法也沒有任何限制，例 如可以通過(guò)鹽析、透析、離子交換色i普法、親和色i普法、電泳 等現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行。另外，篩選產(chǎn)生的目標(biāo)抗體的方法沒有特別限制，可以采 用現(xiàn)有公知的放射免疫分析(RIA)法、酶免疫分析(EIA) 法等。如此獲得的抗體的免疫球蛋白通常為IgM或IgG。另外，所 得抗體分子可以將其本身用作抗體，還可以將進(jìn)一步通過(guò)酶處理獲得的Fab、 Fab，、 F ( ab， ) 2等抗體的活性片段用作本發(fā)明的抗體。
接著，說(shuō)明使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)3，4-DGE與蛋白質(zhì)(或 肽)的反應(yīng)產(chǎn)物AGEs的方法。本發(fā)明的特征在于，是使試樣和 抗AGEs的抗AGEs抗體反應(yīng)，通過(guò)前述試樣中的AGEs與抗 AGEs抗體的抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)前述試樣中的AGEs的方法，前 述AGEs是3,4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物，前述抗AGEs抗 體是前述本發(fā)明的抗AGEs抗體。如果使用這種才企測(cè)方法，可以4全測(cè)各種試樣中由3,4-DGE 產(chǎn)生的AGEs。如上所述，3，4-DGE對(duì)蛋白質(zhì)等的反應(yīng)性極高， 其自身和所生成的AGEs對(duì)細(xì)胞的毒性也強(qiáng)。因此認(rèn)為，如果將 檢測(cè)這種3，4-DGE來(lái)源AGEs的本發(fā)明方法利用在例如臨床醫(yī) 療等中，則對(duì)于診斷、預(yù)防被認(rèn)為受到3,4-DGE來(lái)源AGEs影響 的疾患有用。作為具體例子，通過(guò)檢測(cè)3，4-DGE來(lái)源AGEs,可 對(duì)與糖尿病、腎功能不全病癥相關(guān)的各種疾患；糖尿病、腎功 能不全的并發(fā)癥；伴隨老化的疾患；伴隨著腹膜透析的腹膜纖 維癥、腹膜硬化癥和硬化性包嚢性腹膜硬化癥等并發(fā)癥等的發(fā) 病可能性、發(fā)病程度、發(fā)展程度等進(jìn)行判斷。前述抗原抗體反應(yīng)例如可以通過(guò)免疫凝集法等檢測(cè)，如 EIA法(例如竟?fàn)幮訣IA法、間接EIA法)、RIA法、焚光免疫測(cè) 定法(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、 膠乳免疫比濁法(LTIA)、金溶膠顆粒法等。例如，使抗AGEs 抗體與試樣(含有抗原AGEs的試樣)反應(yīng)，將該反應(yīng)液添加到 預(yù)先固定有抗原AGEs的載體中。這里，在前述反應(yīng)液中未與試 樣中抗原反應(yīng)的抗體與前述固定化抗原AGEs相結(jié)合。接著，從 前述載體中除去前述反應(yīng)液，添加抗前述抗AGEs抗體的標(biāo)記化 抗體(二抗)。由此，z使前述二抗與結(jié)合在固定化抗原AGEs的 抗AGEs抗體相結(jié)合，4全測(cè)最終結(jié)合的前述二抗的標(biāo)記即可。前述載體沒有特別限制，例如可以舉出小球、板(例如免
疫板)、管等。另外，作為前述標(biāo)記，例如可以舉出過(guò)氧化物酶、 堿性磷酸酶等酶，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，放射性同位素等?？贵w的標(biāo)記化可以根據(jù)標(biāo)記的種類通過(guò)常^見方法進(jìn)行。前 述標(biāo)記例如為酶時(shí)，添加因酶反應(yīng)而顯色的底物，通過(guò)吸光度 等測(cè)定前述底物的顯色程度即可。另外，為放射性同位素時(shí)， 例如可以利用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性。這種吸光度、放射活 性、熒光強(qiáng)度等與結(jié)合在固定化抗原上的抗體量有相對(duì)關(guān)系， 因此，例如可以使用預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)曲線等對(duì)抗體量進(jìn)行定量。 另外，結(jié)合在固定化抗原上的抗體量是不與試樣中的抗原反應(yīng) 的游離抗體。因此，可以從游離的抗體量求出與試樣中的與抗 原相結(jié)合的抗體，由于其與試樣中所含抗原相等，因此還能夠定量前述試樣中的抗原AGEs。另外，抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法 不受這些方法任何限定，可以采用現(xiàn)有公知的方法。該檢測(cè)方法的被檢試樣沒有特別限制，可以舉出各種試樣， 例如血清、血漿、血液、尿、脊髓液等體液，生物細(xì)胞的提取 液，菌體等培養(yǎng)液等。另外，本發(fā)明的檢測(cè)方法還可以直接對(duì) 生物組織進(jìn)4亍。接著，說(shuō)明使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)生成AGEs的羰基化合物 的方法。本發(fā)明的羰基化合物的檢測(cè)方法的特征在于，是使用 抗AGEs的抗AGEs抗體，檢測(cè)生成所述AGEs的試樣中的羰基化 合物的方法，所述羰基化合物為3，4-DGE,所述AGEs是3,4-DGE 與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物，所述抗AGEs抗體為所述本發(fā)明的抗 AGEs抗體，該#r測(cè)方法包含以下工序 <吏所述試樣中的 3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的工序；使所述反應(yīng)生成的產(chǎn)物與 所述抗AGEs抗體反應(yīng)的工序；通過(guò)所述產(chǎn)物與所述抗AGEs抗 體的抗原抗體反應(yīng)^f全測(cè)所生成的AGEs的工序；由所述AGEs的 有無(wú)或量，對(duì)試樣中的3,4-DGE進(jìn)行定性或定量的工序。
如上所述，3，4-DGE本身或者由此生成的AGEs對(duì)于細(xì)胞的 毒性強(qiáng)。因此，例如，透析液等中含有3,4-DGE時(shí)，則在給藥 了這些物質(zhì)的生物體中產(chǎn)生3,4-DGE來(lái)源的AGEs、有可能對(duì)生 物體產(chǎn)生影響。通過(guò)本發(fā)明的3，4-DGE的檢測(cè)方法，例如可以 確認(rèn)(定性)前述透析液等試樣中的3，4-DGE存在，或?qū)ζ浜?量進(jìn)行定量，因此可以評(píng)價(jià)其是否是危險(xiǎn)性低的透析液，可以 說(shuō)是在醫(yī)療方面極為有用的品質(zhì)的判斷方法。作為適用本發(fā)明的羰基化合物檢測(cè)方法的被檢試樣，沒有 特別限制，例如可以舉出前述的透一斤液、點(diǎn)滴液、注射液、々欠 料等食品類等。特別是透析液、點(diǎn)滴液通常含有糖類，通過(guò)用 于滅菌的加熱處理，其成分有時(shí)會(huì)變?yōu)榕cAGEs化相關(guān)的物質(zhì) (AGEs前體)。因而，通過(guò)預(yù)先利用本發(fā)明的檢測(cè)方法確認(rèn)作 為AGEs前體的3,4-DGE的存在，可以將安全性更高的透析液、 點(diǎn)滴液等提供給患者。本發(fā)明的方法除了預(yù)先使試樣與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)，并使本 發(fā)明的抗體與該反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)之外，可以與前述本發(fā)明的AGEs 檢測(cè)方法同樣地進(jìn)行。即，當(dāng)使試樣與蛋白質(zhì)等反應(yīng)并確認(rèn)了 該反應(yīng)產(chǎn)物與本發(fā)明抗體的抗原抗體反應(yīng)時(shí)，因?yàn)槭钱a(chǎn)生了 3，4-DGE來(lái)源的AGEs ,因此可以判斷在前述試樣中存在 3，4-DGE。另夕卜，還可以通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的禾呈度對(duì)3，4-DGE 的含量進(jìn)行定量。前述與試樣反應(yīng)的蛋白質(zhì)沒有特別限定，可以舉出血清白 蛋白、血紅蛋白等，例如當(dāng)給藥作為試樣的點(diǎn)滴液等時(shí)，還優(yōu)選使用與前述點(diǎn)滴液接觸的可能性高的組織的蛋白質(zhì)。由此， 進(jìn)一步可以充分地預(yù)測(cè)對(duì)生物體給藥時(shí)的AGEs化。本發(fā)明的免疫試劑的特征在于，是包含抗AGEs的抗AGEs 抗體的免疫試劑，所述AGEs為3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)
物，所述抗AGEs抗體是所述本發(fā)明的抗AGEs抗體。本發(fā)明的 免疫試劑可以用于前述本發(fā)明的AGEs檢測(cè)方法和3，4-DGE的 檢測(cè)方法中，其使用方法與本發(fā)明的抗AGEs抗體相同。本發(fā)明的免疫試劑中，抗AGEs抗體例如可以根據(jù)抗原抗體 反應(yīng)的檢測(cè)方法，用各種標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記。另外，本發(fā)明的免疫 試劑只要含有本發(fā)明的抗AGEs抗體即可，其他組成沒有任何限 制。以下，通過(guò)實(shí)施例和比較例更加具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本 發(fā)明并不限定于此。另外，只要沒有特別說(shuō)明，則"％"表示質(zhì) 量％。實(shí)施例1抗3，4-DGE來(lái)源的AGEs多克隆抗體的制備(1) AGEs抗原(3，4-DGE來(lái)源的AGEs)的制備 首先制備500mM的3，4-DGE水溶液。另一方面，在0.2M磷酸鈉緩沖液(PB:pH7.4 )中溶解RSA( 10mg/ml )和DTPA( 5mM )， 并且，以3，4-DGE量達(dá)到RSA中的NHs基的2.5當(dāng)量的量混合前 述3，4-DGE水溶液。該混合液利用0,2nm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，然 后在37。C下孵育3天，進(jìn)而以3,4-DGE量達(dá)到RSA中的NHs基的 2.5當(dāng)量的量再次添加前述3,4-DGE水溶液，在37。C下孵育4天。 將該反應(yīng)液加入到脫鹽柱(商品名PD-10 、 Amarsham Biosciences公司生產(chǎn))，利用PBS(-)透析其回收液一晝夜， 從而進(jìn)行脫鹽和除去低分子化合物。前述PBS是含有0.15M氯化 鈉的1 OmM磷酸緩沖液。該透析后的溶液利用0.2pm的過(guò)濾器過(guò) 濾除菌，作為抗原(3,4-DGE來(lái)源的AGEs)溶液。另外，該抗 原溶液的濃度是蛋白質(zhì)濃度為7mg/ml。(2) 對(duì)兔子的免疫將前述抗原溶液(蛋白質(zhì)濃度7mg/ml)與等量的完全弗
氏佐劑混合，使其乳化，將該乳化液隔周給藥到兔子背部皮下數(shù)個(gè)位置。另外，l次的給藥量以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)為5mg/只。從 免疫開始時(shí)刻起按照時(shí)間進(jìn)行采血，通過(guò)間接ELISA法確認(rèn)抗 體效價(jià)，結(jié)果可以判斷通過(guò)共計(jì)5次的背部皮下免疫，抗體效 價(jià)充分上升。因此，最后一次(第6次)的給藥是將前述抗原溶 液原樣地給藥到兔子耳靜脈中，之后的10天后，在麻醉的狀態(tài) 下，從免疫過(guò)的兔子身上采集全血(whole blood )。(3)抗3,4-DGE來(lái)源的AGEs多克隆抗體的提純(3-1 )抗血清的分離 在室溫下靜置所得的兔子血液約3小時(shí)，使血塊和血清自然 分離后，將它們離心分離(3500rpm、 10分鐘)，將回收的上清 液再次離心分離(3500rpm、 10分鐘)。將如此獲得的上清液(抗 血清)分為每10ml—份，在56。C下失活處理30分鐘，使用之前 一直冷凍保存在-80'C下。(3-2)多克隆抗體的提純將10ml進(jìn)行了前述處理的抗血清與等量的0.02M磷酸鈉緩 沖液(pH7.0)混合后，利用0.45^m的過(guò)濾器過(guò)濾，在以下所 示的條件下進(jìn)行IgG親和色譜法，進(jìn)行多克隆抗體的提純。色譜柱Affi-Gel Protein A Agarose for IgG Purification (Bio-Rad公司生產(chǎn))柱子規(guī)才各10ml (OlOxlOOmm)洗脫液(A) 0.02M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)(B ) O.IM甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.7 )洗脫條件由洗脫液(A)向(B )的分級(jí)梯度洗脫(Step gradient)流速lml/分鐘首先，將前述抗血清加到用洗脫液(A)平4軒好的前述色 譜柱中，通過(guò)前述洗脫液(A)進(jìn)行洗脫。然后，按順序測(cè)定洗脫組分在波長(zhǎng)280nm的吸光度，在前述洗脫組分的吸光度基 本達(dá)到O的時(shí)刻，將洗脫液置換為洗脫液(B )?；厥沼上疵撘?(B )獲得的洗脫組分(蛋白質(zhì)組分)，在該回收組分中加入1M Tris-HCl緩沖液(pH9.0)進(jìn)行中和后，離心濃縮直至達(dá)到約 10ml，將其作為提純抗3,4-DGE來(lái)源AGEs多克隆抗體溶液(蛋 白質(zhì)濃度9.7mg/ml )。另夕卜，前述抗體分為每^f分lml，在使用前 一直冷凍保存在-80 °C下。對(duì)于所得的抗3，4-DGE來(lái)源的AGEs 多克隆抗體，在實(shí)施例2~ 5中確認(rèn)其性質(zhì)等。另外，根據(jù)本實(shí) 施例l的方法，數(shù)次制備多克隆抗體，結(jié)果具有再現(xiàn)性地獲得相 同的抗體。 實(shí)施例2對(duì)于通過(guò)實(shí)施例1獲得的抗3，4-DGE來(lái)源的AGEs多克隆抗 體，確認(rèn)其結(jié)合常數(shù)。結(jié)合常數(shù)通過(guò)竟?fàn)嶦LISA法決定。首先，利用50mM碳酸鈉 緩沖液將通過(guò)實(shí)施例l制備的抗原溶液稀釋，使其濃度達(dá)到 l|tig/ml。將其加入到96孔免疫板中，每孑L力。入100pl，在室溫下 孵育2小時(shí)使抗原固定。2小時(shí)后除去抗原溶液，利用含有0.05% Tween206々PBS ( TPBS )、洗涂各孑L后，在每孑L中力口入300ilU含有 0.5%脫脂乳的PBS,在室溫下孵育2小時(shí)將未固定的抗原部分封 閉。2小時(shí)后，除去封閉溶液，利用TPBS洗滌后，向其中加入 50pl利用含有0.1%甘油和0.1% Tween20的50ml Tris-HC1緩沖液 (pH7.4:TB )稀釋過(guò)的各種濃度的抗原溶液以及50pl利用含有在室溫下孵育2小時(shí)。2小時(shí)后除去反應(yīng)液，利用TPBS洗滌后， 加入100pl用含有0.3。/。脫脂乳的TB稀釋了 2250倍的抗前述一抗 的石成性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體溶液(在冷凍干燥品
(CHEMICON公司生產(chǎn))中加入lml水和lml甘油溶解的溶液)， 在37。C下孵育1小時(shí)。l小時(shí)后除去反應(yīng)液，利用TPBS洗滌后， 在每孔中加入lOOjil顯色試劑(在9ml水中溶解有2ml商品名 Diethanolamine Substrate Buffer ( 5x ) ( PIERCE公司生產(chǎn)) 和2片商品名ImmunoPure PNP PTablets ( PIERCE公司生產(chǎn))的 試劑)，在室溫下孵育30分鐘。孵育后，在每孔中加入50jil 2M 氫氧化鈉水溶液，佳^咸性磷酸酶的反應(yīng)停止，測(cè)定405nm的吸 光度。之后，通過(guò)下式制作圖l的曲線，計(jì)算離解常數(shù)Kd。 Kd=k2/k 1 =[Agf] [Abf]/[AgAb] [Agf]:游離的抗原濃度 [Abf]:游離的抗體濃度 [AgAb]:抗原抗體復(fù)合物的濃度 由前述圖l求出的離解常數(shù)Kd為5.7x10—9( M)。由于結(jié)合常 數(shù)Ka是離解常數(shù)Kd的倒數(shù)，因此計(jì)算出為1.8xl08 ( M—1 )。由于 一般的多克隆抗體的結(jié)合常數(shù)為107~ 109 (M—1)，因此可以說(shuō) 通過(guò)實(shí)施例l獲得的抗體與抗原的結(jié)合力很充分。 實(shí)施例3對(duì)于通過(guò)實(shí)施例l獲得的抗3,4-DGE來(lái)源的AGEs多克隆抗 體，確認(rèn)其反應(yīng)特異性。通過(guò)與測(cè)定結(jié)合常數(shù)同樣的竟?fàn)嶦LISA法及蛋白質(zhì)印跡法 確認(rèn)其對(duì)3 ，4-DGE來(lái)源的AGEs蛋白質(zhì)的特異性。以下所示的各 種AGEs化蛋白質(zhì)與前述實(shí)施例l的"(1 )抗原的制備"同樣地制 備。另外，Glu-BSA如下制備:將BSA( 10mg/ml)和DTPA( 5mM ) 溶解在0.2MPB (pH7.4)中，在其中添加Glu直至達(dá)到100mM， 在37。C下孵育8周。(1 )竟?fàn)嶦LISA法作為竟?fàn)幰种莆镔|(zhì)，除了使用#皮3，4-DGE AGEs化的蛋白質(zhì)"3,4-DGE-RSA"、天然蛋白質(zhì)"RSA、 BSA、 HSA"、被3，4-DGE 以外的羰基化合物(MGO、 GO、 3-DG) AGEs化的蛋白質(zhì) "MGO-BSA、 GO-BSA、 3-DG-BSA，，、以及糖基化蛋白質(zhì) "glycated HSA ( SIGMA公司生產(chǎn)商品名A-8301 )，，以外，與 前述實(shí)施例2同樣地通過(guò)E LIS A法評(píng)價(jià)反應(yīng)特異性。該結(jié)果示于 圖2(A)(B)中。該圖中的(A)為顯示3，4-DGE-RSA、天然 蛋白質(zhì)和glycated HSA結(jié)果的曲線圖、(B)為顯示3，4-DGE-RSA 和其他AGEs化蛋白質(zhì)結(jié)果的曲線圖。另外，該圖中的"B"表示 在將竟?fàn)幰种莆镔|(zhì)加入到孔中時(shí)的405nm的吸光度、"BO，，表示 在未將竟?fàn)幰种莆镔|(zhì)加入到孔中時(shí)的405nm的吸光度，竟?fàn)幬?質(zhì)的單位(pg/ml)表示加入到孔中的竟?fàn)幰种莆镔|(zhì)的濃度。如圖2 (A)所示，通過(guò)實(shí)施例l獲得的多克隆抗體與天然 蛋白質(zhì)和glycated HSA不顯示交叉反應(yīng)，另夕卜，如該圖(B)所 示，與其它的AGEs化蛋白質(zhì)也不顯示交叉反應(yīng)。 (2)蛋白質(zhì)印跡法使用被3，4-DGE AGEs化的蛋白質(zhì)"3，4-DGE-RSA 、 3，4-DGE-BSA、 3，4-DGE-HSA"、天然蛋白質(zhì)"RSA、 BSA、 HSA"、 被3,4-DGE以外的羰基化合物(MGO、 GO、 3-DG、 5-HMF、 Fur、 AA、 FA、 glycer 、 glycol)和Glu AGEs化的蛋白質(zhì) "MGO-BSA、 GO-BSA、 3-DG-BSA、 5-HMF-BSA、 Fur-BSA、 AA-BSA、 FA-BSA、 glycer-BSA、 glycol—BSA、 Glu-BSA，，作 為試樣。將這些試樣(各lpg)加入到SDS-PAGE,利用PVDF (聚偏二氟乙烯)膜印跡蛋白質(zhì)條帶。將該膜浸漬在含有0.3% 脫月旨乳的TTBS (含有0.15M氯化鈉和0.10/。 Tween20的25mM Tris-HC1緩沖液(pH7.4))中，在室溫下孵育1小時(shí)進(jìn)行封閉。 孵育后，除去封閉溶液，利用TTBS洗滌，然后浸漬在用封閉溶 液稀釋了 12000倍的實(shí)施例l的抗體( 一抗)溶液中，在室溫下
孵育1小時(shí)。孵育后除去一抗溶液，利用TTBS洗滌后，浸漬在 用封閉溶液稀釋了 12000倍的抗前述一抗的石咸性磷酸酶標(biāo)記羊 抗兔IgG抗體溶液(CHEMICON公司生產(chǎn))中，在室溫下孵育l 小時(shí)。孵育后除去反應(yīng)液，利用TTBS洗滌后，通過(guò)按照使用說(shuō) 明書制備的顯色試劑(BCIP/NBT (氮藍(lán)四唑/5-溴_4-氯-3-吲 哚基磷酸鹽)；Promega公司生產(chǎn))使其顯色。其結(jié)果示于圖3 的照片中。另夕卜，前述5-HMF表示5-羥曱基-糠醛、前述Fur表 示糠醛、前述AA表示乙醛、前述FA表示曱醛、前述glycer表示 甘油醛、前述glycol表示乙醇醛。如圖3所示，僅在被3，4-DGE AGEs化的3，4-DGE-BSA (條 帶l)、 3，4-DGE-RSA (條帶3 )、 3,4-DGE-HSA (條帶5 )確認(rèn) 有顯色，天然蛋白質(zhì)、被其他羰基化合物AGEs化的蛋白質(zhì)未顯 示交叉反應(yīng)。由以上的竟?fàn)嶦LISA法和蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果可知，實(shí)施 例1的多克隆抗體僅特異性識(shí)別被3 ，4-DGE AGEs化的蛋白質(zhì)。 實(shí)施例4利用3,4-DGE進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的AGEs化，利用實(shí)施例l 的多克隆抗體進(jìn)行AGEs的檢測(cè)。將懸浮在含有20。/。FBS (胎牛血清)的M199培養(yǎng)基(以下 稱為"FBS-M199培養(yǎng)基")的人腹膜間皮細(xì)胞(HPMC)接種于 8孔玻片室中，培養(yǎng)至鋪滿(37°C)。培養(yǎng)后從前述玻片室中除 去i咅養(yǎng)基，4奪利用M199;咅養(yǎng)基稀釋至30^M、 250pM的3，4-DGE 溶液暴露于HPMC。另外，對(duì)照組是暴露M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 小時(shí)后，除去前述M199培養(yǎng)基，之后用PBS洗滌HPMC,進(jìn)而 注入-30。C的冷曱醇，在-30。C下固定5分鐘。接著，利用PBS洗 滌后，滴力口含有0.2。/oTritonX-IOO的PBS,在室溫下進(jìn)行浸漬化 處理5分鐘。除去浸漬化溶液并用PBS洗滌后，滴加含有5%正
常豬血清(DAKO公司生產(chǎn))的PBS，在室溫下放置5分鐘，進(jìn) 行封閉。除去封閉溶液，滴加用含有5。/。正常豬血清的PBS稀釋 了 500倍的實(shí)施例l的抗體( 一抗)溶液，在室溫下孵育l小時(shí)。 孵育后除去一抗溶液，利用PBS洗滌后，滴加用含有5%正常豬 血清的PBS稀釋了 30倍的抗前述一 抗的FITC標(biāo)記的豬抗兔IgG 抗體溶液(DAKO公司生產(chǎn))，在暗處室溫下孵育l小時(shí)。孵育 后除去反應(yīng)液，利用PBS洗滌后，利用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果 示于圖4的顯微鏡照片中。該圖的(a)為未暴露于3，4-DGE的 對(duì)照組的結(jié)果、(b)為3，4-DGE濃度為30^M的結(jié)果、(c)為 3，4-DGE濃度為250pM的結(jié)果，左列為明亮^L野的照片、右列 為熒光顯微鏡照片。如該圖(b)和(c)所示，只有暴露在3,4-DGE中的HPMC 觀察到熒光、該圖(a)的對(duì)照組中未檢查到熒光。由此可知， 實(shí)施例l的多克隆抗體在人體細(xì)胞中僅特異性地結(jié)合于被暴露 的被3，4-DGE AGEs化的蛋白質(zhì)，另外，實(shí)施例l的多克隆抗體 可以用于人體細(xì)胞的抗體染色中。實(shí)施例5對(duì)腹膜透析的模型大鼠，確認(rèn)腹膜的3，4-DGE來(lái)源的AGEs 的累積。在2組大鼠腹腔中分別給藥3，4-DGE濃度為2pM、 58iuM的 透析液30天(2次/天各組7只)。另外，對(duì)照組(7只)不給藥 透析液，僅扎針。由各大鼠身上采集壁側(cè)腹膜，冷凍包埋，制 作薄切片。利用多聚曱醛固定該切片，滴加用含有0.5%脫脂乳 的PBS稀釋了 500倍的實(shí)施例l的抗體(一抗)溶液，在室溫下 孵育1小時(shí)。孵育后除去一抗溶液，利用TTBS洗滌后，按照使 用說(shuō)明書用抗前述一抗的堿性磷酸酶標(biāo)記二抗試劑盒(商品名 DAKO LSAB 2System Alkaline Phosphatase; DAKO公司生產(chǎn))
處理。除去反應(yīng)液利用TTBS洗滌后，通過(guò)按照使用說(shuō)明書制備 的顯色試劑(商品名New Fuchsin; DAKO公司生產(chǎn))使其顯 色。其結(jié)果示于圖5的照片中。該圖的(A)為對(duì)照組、(B)為 利用含有2^iM的3，4-DGE的透析液進(jìn)行透析的大鼠結(jié)果的照 片、(C)為利用含有58(iM的3，4-DGE的透析液進(jìn)行透析的大鼠 結(jié)果的照片。如圖5所示，與對(duì)照組(該圖(A))相比，在利用前述含 有3，4-DGE的透析液進(jìn)行透析的大鼠(該圖(B)、 (C))中確 認(rèn)了顯色，特別是在3,4-DGE含量多的大鼠中可見強(qiáng)的顯色(該 圖(C))。由此可以推測(cè)，通過(guò)透析液中所含的3，4-DGE,腹膜 組織被AGEs化。才艮據(jù)該實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)，通過(guò)實(shí)施例l的多克隆抗 體還可以進(jìn)行生物組織的抗體染色。實(shí)施例6通過(guò)與前述實(shí)施例1相同的方法制備抗3，4-DGE來(lái)源的 AGEs多克隆抗體，利用反應(yīng)特異性和結(jié)合常數(shù)，與前述實(shí)施例 l的抗體進(jìn)行比較。反應(yīng)特異性與前述實(shí)施例3同樣地通過(guò)竟?fàn)嶦LISA法確認(rèn)。 該結(jié)果示于圖6( A)、 (B)中。該圖(A)為表示3，4-DGE-RSA、 天然蛋白質(zhì)和glycated HS A結(jié)果的曲線圖，(B )為3,4-DGE-RS A 以及其他AGEs化蛋白質(zhì)結(jié)果的曲線圖。另外，該圖的"B"和 "BO"與前述相同。將該結(jié)果與通過(guò)前述實(shí)施例l制備的抗體結(jié)果(圖2 ( A)、 (B))相比較，實(shí)施例6的多克隆抗體未顯示與天然蛋白質(zhì)和 glycated HSA的交叉反應(yīng)，另外，如該圖(B)所示，與其他的 AGEs化蛋白質(zhì)也未顯示交叉反應(yīng)，顯示出與實(shí)施例l的抗體相 同的4亍為。結(jié)合常數(shù)與前述實(shí)施例2同樣地通過(guò)竟?fàn)嶦LISA法決定，同
樣，由圖7所示的曲線計(jì)算結(jié)合常數(shù)。該結(jié)果證明由前述圖7 求出的結(jié)合常數(shù)為1.9x108 (JVf1)，與前述實(shí)施例2的實(shí)施例l多 克隆抗體的結(jié)合常數(shù)數(shù)量級(jí)相同。由以上結(jié)果可知，根據(jù)前述 實(shí)施例1的方法，可以再現(xiàn)性良好地獲得同樣的抗體。 實(shí)施例7制備反應(yīng)時(shí)間不同的AGEs抗原(3,4-DGE來(lái)源的AGEs ), 確i人是否能夠不依賴于反應(yīng)時(shí)間地利用前述實(shí)施例1的抗 3，4-DGE來(lái)源AGEs多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。在PBS(pH7.4)中溶解BSA ( 5mg/ml )，進(jìn)而以3，4-DGE 量達(dá)到BSA中NH2基的4當(dāng)量的量混合前述3，4-DGE水溶液，在 37。C下孵育規(guī)定時(shí)間(2、 4、 8、 24、 72、 168小時(shí))，除此之外 與前述實(shí)施例l同樣地制備抗原(3,4-DGE來(lái)源AGEs )。然后通 過(guò)與前述實(shí)施例3同樣的竟?fàn)嶦LISA法評(píng)價(jià)所得的各抗原與實(shí) 施例l的多克隆抗體的反應(yīng)性。結(jié)果示于圖8的曲線圖中。另夕卜， 該圖的"B"和"BO"與上述相同。如圖8所示可知，對(duì)各抗原的結(jié)果全部同樣顯示向右下傾斜 的行為，其反應(yīng)性依賴于竟?fàn)帩舛?。由此結(jié)果可以說(shuō)，與蛋白 質(zhì)和3,4-DGE的反應(yīng)時(shí)間無(wú)關(guān)，生成同樣的AGEs。另外，由于 B/BO值依賴于反應(yīng)時(shí)間而減少，因此根據(jù)反應(yīng)時(shí)間AGEs化的 程度不同，蛋白質(zhì)的完全AGEs化需要例如72小時(shí)左右的賻育。 (參考例l )進(jìn)行利用3，4-DGE的蛋白質(zhì)的AGEs化，確認(rèn)所得AGEs的 反應(yīng)性、物性。l.與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性 (外觀)使用羰基化合物(3,4-DGE、 MGO、 GO、 3-DG、 Glu), 進(jìn)行蛋白質(zhì)BSA的AGEs化。首先，以BSA ( SIGMA公司生產(chǎn)
商品名A-0281 )達(dá)到濃度5mg/ml (堿性氨基酸殘基6.2mM)的 量，溶解在PBS ( pH7.4)中，制備BSA溶液。在前述BSA溶液 中添加羰基化合物，使羰基化合物濃度達(dá)到25mM( BSA中的堿 性氨基酸殘基的4當(dāng)量)，在37。C下孵育規(guī)定時(shí)間(2、 4、 8、 24、 72、 168小時(shí))。另夕卜，各種羰基化合物使用500mM的3，4-DGE 水溶液(本公司制備)、40% MGO水溶液(SIGMA公司生產(chǎn))、 40% GO水溶液(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))、3-DG (同仁化學(xué)公 司生產(chǎn))、Glu(藥典、San國(guó)ei Sucrochemical Co， Ltd.生產(chǎn))。另 外，將未添加羰基化合物的BSA溶液同樣地孵育，作為對(duì)照組。 將孵育168小時(shí)后的反應(yīng)液外觀示于圖9的照片中。該圖中，從 左開始為3，4-DGE ( DGE)、 MGO、 GO、 3-DG(3DG)、 Glu、 空白(對(duì)照組)的結(jié)果。使用3,4-DGE時(shí)，反應(yīng)液在約2小時(shí)時(shí)著色，之后褐色隨著 時(shí)間而加深，在168小時(shí)后確i人為圖示的濃重褐色。如圖所示， 在與Glu的反應(yīng)液中未見褐色化，對(duì)于已知作為AGEs化的介質(zhì) 的MGO、 GO、 3-DG,發(fā)現(xiàn)褐色化，因此可以說(shuō)3，4-DGE與MGO、 GO、 3-DG同樣地發(fā)生了梅拉德反應(yīng)后期的AGEs化。而且，由 于褐色很濃重，因此可知3，4-DGE對(duì)于蛋白質(zhì)的反應(yīng)性很強(qiáng)。 (熒光強(qiáng)度)采集如上孵育的反應(yīng)液，將這些樣品反應(yīng)液加入到脫鹽柱 (商品名PD-IO、 amersham pharmacia biotech公司生產(chǎn))進(jìn)行 脫鹽。對(duì)于脫鹽后的反應(yīng)液，使用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce 公司生產(chǎn))測(cè)定BSA濃度，用水稀釋使得BSA濃度達(dá)到 l.Omg/ml,將其作為試樣溶液。另外，這些試樣溶液在使用之 前一直冷凍保存在-3(TC。將這些試樣溶液注入到96孔白色板 中，在激發(fā)波長(zhǎng)360nm、熒光波長(zhǎng)430 nm下觀'J定熒光虧雖度(觀'J定 裝置商品名SPECTRAFLUOR PLUS、 TECAN公司生產(chǎn))。這
些結(jié)果示于圖10中。另外，圖中的"BSA"表示未添加羰基化合 物的對(duì)照組。如圖所示，使用了 3,4-DGE的試樣與其他的羰基化合物相 比，熒光強(qiáng)度極強(qiáng)，通過(guò)24小時(shí)的反應(yīng)基本達(dá)到平衡。2. 反應(yīng)物的評(píng)價(jià)對(duì)于羰基化合物(3,4-DGE、 3-DG、 GO、 MGO )的前述 試樣溶液，利用ELISA法確認(rèn)是否生成作為已知AGEs的戊糖 素、羧曱賴氨酸(CML)、梅拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRX: 8-羥基-5-甲基二氫噻唑[3,2-a])。結(jié)果，使用了 GO的反應(yīng)液在孵育24小 時(shí)的階I殳每個(gè)BSA分子已經(jīng)產(chǎn)生了 3.025分子的CML,而在168 小時(shí)后，每個(gè)BSA分子產(chǎn)生了 3.7分子的CML。另外，使用了 MGO的反應(yīng)液經(jīng)過(guò)168小時(shí)后，確認(rèn)每個(gè)BSA分子產(chǎn)生了 0.0028 分子的戊糖素。與此相對(duì)，使用了3，4-DGE的反應(yīng)液沒有生成 CML、戊糖素、MRX所有物質(zhì)。由此可知，由3，4-DGE所生成 的AGEs與以往公知的AGEs不同。3. 氨基酸分析將前述試樣溶液冷凍干燥后，在6N鹽酸中酸水解(120°C、 24小時(shí))。根據(jù)現(xiàn)有公知的方法，用丹磺酰氯將其衍生化，利用 HPLC分離，研究試樣中的精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)的殘 基量(n=3)。該結(jié)果示于圖ll (A) (B)中。該圖(A)為顯 示Arg殘基的殘存率的曲線圖，(B)為顯示Lys殘基的殘存率的 曲線圖。另外，該殘存率表示的是將未處理的天然BSA中的殘 基量作為100%時(shí)的殘存率。如圖ll (A)所示，與其他羰基化合物引起的AGEs化同樣 地，游離Arg和Lys減少。由此可推測(cè)與現(xiàn)有乂>知的AGEs同樣地， 3,4-DGE與Arg殘基、Lys殘基反應(yīng)。4. 等電點(diǎn)電泳 預(yù)先將等電點(diǎn)標(biāo)記施加在電泳中，制作pl與遷移率的標(biāo)準(zhǔn) 曲線。然后對(duì)于前述試樣溶液也進(jìn)行電泳，將各試樣中染色最 濃的部分作為條帶的中心，使用前述標(biāo)準(zhǔn)曲線求出等電點(diǎn)。另 外，將各試樣的等電點(diǎn)的變化示于圖12中。如圖12所示，使用了 3，4-DGE的試樣被確認(rèn)在反應(yīng)24小時(shí) 后向酸性側(cè)位移。由此可知，在反應(yīng)了24小時(shí)的時(shí)刻，蛋白質(zhì) 的AGEs化已經(jīng)開始。5.SDS-PAGE對(duì)于使用了 3，4-DGE和MGO的試樣，分別進(jìn)行SDS-PAGE。 將這些結(jié)果示于圖13的電泳照片中。另外，該圖(A )顯示 3，4-DGE的結(jié)果、該圖(B)顯示MGO的結(jié)果，條帶從左側(cè)開 始依次為分子量標(biāo)記、天然BSA、試樣(2、 4、 8、 24、 72、 168 小時(shí))的結(jié)果。如圖所示，反應(yīng)2~ 4小時(shí)時(shí)條帶混亂，因此認(rèn)為蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)變化很大、發(fā)生了AGEs化。另外，公知的引起AGEs化的羰 基化合物MGO,也可見相似的條帶變化。 (參考例2)對(duì)于以3,4-DGE為首的羰基化合物，確認(rèn)了與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。作為羰基化合物，使用3，4-DGE、 MGO、 GO、 3-DG、AA、 FA、 Fur、 5-HMF、 Glu。將BSA溶解在PBS ( pH7.4 )中并使BSA濃度達(dá)到10mg/mL。 向其中添加各種羰基化合物使羰基化合物濃度達(dá)到30mmo!/L，在37r下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后，利用反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度(激發(fā) 波長(zhǎng)360nm、熒光波長(zhǎng)430nm)評(píng)價(jià)BSA的改性(AGEs化)。其 結(jié)果示于圖14中。如圖14所示，添加了 3,4-DGE的BSA溶液與其他羰基化合 物相比顯示極強(qiáng)的熒光。由該結(jié)果可知，3，4-DGE富于與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，是很強(qiáng)的AGEs的中介體。 (參考例3)確認(rèn)了 3,4-DGE來(lái)源的AGEs化蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性。 為了研究來(lái)源于各種羰基化合物的AGEs化蛋白質(zhì)的生物 活性，實(shí)施細(xì)胞毒性試驗(yàn)。另外，作為AGEs化蛋白質(zhì)，使用與 實(shí)施例3同樣制備的3，4-DGE-BSA、 MGO-BSA、 GO-BSA、 AA-BSA。將懸浮在FBS-Ml99培養(yǎng)基中的人腹膜間皮細(xì)胞(HPMC ) 接種在96孔板(Iwaki公司生產(chǎn))，每孔3400個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)1晚。 將孔中的貼壁細(xì)胞暴露于溶解有l(wèi)mg/mL AGEs化蛋白質(zhì)的含 8.4。/。FBS的M199培養(yǎng)基(O.lmL/孔)中，培養(yǎng)4天。暴露后除 去前述培養(yǎng)基，利用含有10%顯色基質(zhì)(商品名WST-1; TAKARABIO， INC.生產(chǎn))的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)定40分鐘后 的波長(zhǎng)405nm的吸光度，求出活細(xì)胞數(shù)。該結(jié)果示于圖15的曲 線圖中。另外，圖中的DGE-BSA表示3，4-DGE-BSA。如圖所示，其他蛋白質(zhì)不影響細(xì)胞活性，相反，暴露在被 3,4-DGE AGEs化的BSA溶液中的細(xì)胞的活性降低至約25%。由 此結(jié)果可確認(rèn)，由3 ，4-DGE生成的AGEs化蛋白質(zhì)顯示極強(qiáng)的細(xì) 胞毒性。實(shí)施例8使用通過(guò)前述實(shí)施例l制備的抗體檢測(cè)由腹膜透析液中所 含的3，4-DGE形成AGEs。作為腹膜透析液，分別使用不含3,4-DGE的透析液A 、 3,4-DGE濃度為15nM的透析液B、3,4-DGE濃度為6pM的透析液 C。首先，按照體積比9:1 ( v/v)混合各透析液和200mM磷酸鈉 緩沖液(pH7.4),將pH調(diào)整到7.15 ~ 7.27后，溶解HSA (人血 清白蛋白)使之達(dá)到2mg/ml。在37。C下孵育該溶液4周后作為 分析試樣。將3ng的這些各試樣加入到SDS-PAGE,使用通過(guò)前 述實(shí)施例l制作的抗體，與前述實(shí)施例3同樣地進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。 作為陰性對(duì)照組，對(duì)HSA同樣地進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡； 作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)3,4-DGE-HSA同樣地進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白 質(zhì)印跡。另夕卜，陽(yáng)性對(duì)照的3,4-DGE-HSA與前述實(shí)施例3同樣 地制備。該結(jié)果示于圖16中。如該圖所示，在孵育含有3，4-DGE 的透析液A、 B、 C和HSA獲得的分析試樣中，在116kDa、 200kDa 附近確認(rèn)了顯示與抗體的反應(yīng)的條帶。這些116kDa、 200kDa 附近的條帶由于HSA的分子量為66kDa ，因此認(rèn)為是通過(guò)與 3,4-DGE反應(yīng)而交聯(lián)的HSA的二聚物和三聚物。這樣，如果使 用含有3，4-DGE的透析液，則其與蛋白質(zhì)反應(yīng)，形成3,4-DGE 來(lái)源的AGEs。另外，通過(guò)前述實(shí)施例l制作的抗體可以檢測(cè)這 些AGEs，因此通過(guò)比較條帶濃度，還可以定量所生成的AGEs。 實(shí)施例9將腎功能不全患者的血清蛋白質(zhì)作為分析試樣，使用通過(guò) 前述實(shí)施例1制作的抗體確認(rèn)有無(wú)3 ，4-DGE來(lái)源的AGEs 。將9位腎功能不全患者的血清蛋白質(zhì)(富含白蛋白的總蛋白 質(zhì))作為試樣，將8pg各試樣分別加入到SDS-PAGE，使用通過(guò) 前述實(shí)施例l制作的抗體，與實(shí)施例3同樣地進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。 另外，同時(shí)將健康者的血清蛋白質(zhì)也作為試樣。陽(yáng)性對(duì)照組使 用與前述實(shí)施例8相同的3，4-DGE-HSA。其結(jié)果示于圖17中。 另外，該圖顯示了9位患者中的2位(患者A和患者B)的結(jié)果。 如該圖所示，在患者A和患者B的試樣中，在116kDa附近確認(rèn)了 顯示與抗體反應(yīng)的條帶。另外，剩余的7位患者也得到了與該圖 相同的結(jié)果。與此相對(duì)，對(duì)于健康者基本看不到條帶。由該結(jié) 果可以確認(rèn)，在腎功能不全患者的血清中存在3,4 - D G E來(lái)源的 AGEs。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性如上所述，通過(guò)本發(fā)明的抗AGEs抗體，例如可以才全測(cè) 3,4-DGE來(lái)源的AGEs。因此可以說(shuō)，本發(fā)明對(duì)前述3，4-DGE來(lái) 源的AGEs的進(jìn)一步研究、以及被認(rèn)為與前述3,4-DGE來(lái)源的 AGEs相關(guān)的各種疾患診斷等有用。
權(quán)利要求
1.抗AGEs抗體，其特征在于，其為抗晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEsadvanced glycation endproducts)的抗體，所述AGEs為3，4-二脫氧葡糖醛酮-3-烯(3，4-DGE)與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其與選自甲基乙二 醛(MGO)、乙二醛(GO)、 3-脫氧葡糖醛酮(3-DG)、 5-羥 甲基糠醛(5-HMF)、糠醛(Fur)、曱醛(FA )、葡萄糖(Glu ) 和乙醛(AA)的至少一種羰基化合物和蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物 不反應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其與具有戊糖素殘 基和羧甲賴氨酸(CML)殘基中至少一種殘基的蛋白質(zhì)或肽不 反應(yīng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其中所述AGEs為 通過(guò)在25 ~ 50。C下孵育3,4-DGE與蛋白質(zhì)或肽而獲得的反應(yīng)產(chǎn)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，所述蛋白質(zhì)為血清 白蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗AGEs抗體，所述血清白蛋白為 選自兔血清白蛋白、牛血清白蛋白和人血清白蛋白中的至少一 種白蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗AGEs抗體，所述AGEs是如下 獲得的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)于蛋白質(zhì)，以3，4-DGE達(dá)到所述蛋白質(zhì)的 氨基的2.5當(dāng)量的量添加3，4-DGE,在37。C下孵育3天后，再以達(dá) 到所述蛋白質(zhì)的氨基的2.5當(dāng)量的量添加3,4-DGE,在37°C下孵 育4天。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其中抗體為多克隆 抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其中抗體為單克隆 抗體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗AGEs抗體，其中抗體是通過(guò) 將所述AGEs作為抗原4吏宿主動(dòng)物免疫致每丈后，從所述動(dòng)物的血 液或腹水分離所獲得的抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗AGEs抗體，其中所述宿主動(dòng) 物為兔子。
12. AGEs檢測(cè)方法，其特征在于，其為使試樣和抗AGEs 的抗AGEs抗體反應(yīng)，通過(guò)所述試樣中的AGEs與抗AGEs抗體的 抗原抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)所述試樣中的AGEs的方法，其中，所述AGEs為3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物，所 述抗AGEs抗體為權(quán)利要求1所述的抗AGEs抗體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的AGEs檢測(cè)方法，其通過(guò)選自酶 免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、膠乳凝集法和金溶膠顆粒法中 的至少 一 種免疫學(xué)方法4企測(cè)所述抗原抗體反應(yīng)。
14. 羰基化合物的檢測(cè)方法，該方法為使用抗AGEs的抗 AGEs抗體，檢測(cè)生成所述AGEs的試樣中的羰基化合物的方法，所述羰基化合物為3,4-DGE,所述AGEs是3,4-DGE與蛋白 質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物，所述抗AGEs抗體為；k利要求l所述的抗 AGEs抗體，該4全測(cè)方法包含以下工序使所述試樣中的3,4-DGE與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的工序； 使所述反應(yīng)生成的產(chǎn)物與所述抗AGEs抗體反應(yīng)的工序； 通過(guò)所述產(chǎn)物與所述抗A G E s抗體的抗原抗體反應(yīng)#r測(cè)所生成的AGEs的工序；以及，由所述AGEs的有無(wú)或量，對(duì)試樣中的3,4-DGE進(jìn)行定性或定量的工序。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的羰基化合物的檢測(cè)方法，其通 過(guò)選自酶免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、膠乳凝集法和金溶膠 顆粒法中的至少 一 種免疫學(xué)方法檢測(cè)所述抗原抗體反應(yīng)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的羰基化合物的檢測(cè)方法，所述 試才羊?yàn)橥敢唤镆骸Ⅻc(diǎn)滴液、注射液、食品或體液。
17. 免疫試劑，其特征在于，該免疫試劑包含抗AGEs的抗 AGEs抗體，所述AGEs是3,4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物， 所述抗AGEs抗體為權(quán)利要求1所述的抗AGEs抗體。
18. 根據(jù)4又利要求17所述的免疫試劑，其為用于檢測(cè)AGEs 的試劑，所述AGEs為3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的免疫試劑，其為用于檢測(cè) 3,4-DGE的試劑。
20. 抗AGEs抗體的制造方法，其特征在于，其為抗晚期糖 基化終末產(chǎn)物(AGEs: advanced glycation endproducts )的抗 體的制造方法，所述AGEs為3,4- 二脫氧葡糖醛酮-3-烯(3,4-DGE)與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)產(chǎn)物，該制造方法包含以下 工序?qū)⑺鯝GEs作為抗原，將人以外的宿主動(dòng)物免疫致敏的 工序；回收由所述免疫致敏生成的抗所述A G E s的抗體的工序。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗AGEs抗體的制造方法，其包 括在25 ~ 5(TC下孵育3，4-DGE與蛋白質(zhì)或肽而生成所述AGEs 的工序。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗AGEs抗體的制造方法，所述 蛋白質(zhì)為血清白蛋白。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗AGEs抗體的制造方法，所述 血清白蛋白為選自兔血清白蛋白、牛血清白蛋白和人血清白蛋 白中的至少 一種白蛋白。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗AGEs抗體的制造方法，所述AGEs的生成工序是如下工序?qū)τ诘鞍踪|(zhì)，以3，4-DGE達(dá)到所 述蛋白質(zhì)的氨基的2.5當(dāng)量的量添加3，4-DGE,在37°C下孵育3 天后，再以達(dá)到所述蛋白質(zhì)的氨基的2.5當(dāng)量的量添加 3,4-DGE,在37。C下孵育4天，從而生成AGEs。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗AGEs抗體的制造方法，所述 回收工序是從免疫致敏的所述宿主動(dòng)物的血液或腹水分離抗體 的工序。
26. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗AGEs抗體的制造方法，所 述宿主動(dòng)物為兔子。
全文摘要
本發(fā)明提供與蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)性強(qiáng)的羰基化合物來(lái)源的AGEs抗體，以及提供所述羰基化合物來(lái)源的AGEs的檢測(cè)方法。使3，4-二脫氧葡糖醛酮-3-烯(3，4-DGE)與蛋白質(zhì)反應(yīng)，將其反應(yīng)產(chǎn)物AGEs免疫致敏在宿主動(dòng)物中，從所述宿主動(dòng)物身上回收血清，從該血清分離出抗所述反應(yīng)產(chǎn)物AGEs的抗體(抗AGEs抗體)。將該分離出的抗AGEs抗體與試樣反應(yīng)，檢測(cè)所述試樣中的AGEs與抗AGEs抗體的抗原抗體反應(yīng)，從而可以檢測(cè)所述試樣中的AGEs的有無(wú)或含量。
文檔編號(hào)C12P21/08GK101120019SQ20068000508
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者山本敬史, 木村祐子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Jms