專(zhuān)利名稱(chēng)：一種納豆激酶的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納豆激酶，特別是涉及一種納豆激酶的純化方法。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的血栓常引發(fā)脈管栓塞、腦血栓中風(fēng)、心肌梗塞、肺梗塞、極性肺原性心臟病等嚴(yán)重疾病。血栓栓塞病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，極大地危害著人類(lèi)的生命和健康，人們期望能研發(fā)和生產(chǎn)出更多高效優(yōu)質(zhì)的溶栓藥物在臨床應(yīng)用。納豆激酶(Nattokinase，NK)自1987年發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)逐步得到廣泛深入的研究，其酰胺水解活性、纖溶活性以及溶血栓作用已經(jīng)被證實(shí)。且納豆激酶與現(xiàn)用的鏈激酶、尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑等溶栓藥物相比，具有安全性高、作用直接迅速、易被人體吸收、特異性高、在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、口服和注射均可等優(yōu)點(diǎn)，可用于開(kāi)發(fā)新一代的溶栓劑或保健食品，具有極為誘人的廣闊前景。
現(xiàn)有納豆激酶的純化方法大多存在工藝繁瑣，不易操作，純度低等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有納豆激酶純化方法上存在的不足，提供一種工藝簡(jiǎn)單，操作方便，可以規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高的納豆激酶純化方法。
一種納豆激酶的純化方法，包括如下步驟
(1)發(fā)酵液預(yù)處理將納豆菌發(fā)酵液離心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾清液；(2)離子交換層析柱純化離子交換層析所用凝膠為CM SepharoseFast Flow，凝膠先用pH6.8、含6～70mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調(diào)節(jié)過(guò)濾清液的離子濃度，使其電導(dǎo)率為1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速將其加入柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液洗滌柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氫鈉和0～1M氯化鈉的洗脫液線型梯度洗脫，流速為5～10mL/min；(或把經(jīng)調(diào)節(jié)離子濃度的過(guò)濾清液在加入柱之前先裝入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝膠，調(diào)pH為6.0，用攪拌機(jī)慢速攪拌吸附30分鐘，吸附完成，濾掉清液，洗滌凝膠，凝膠上柱；再用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉的溶液洗脫，流速為30～100mL/min)用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為280nm處檢測(cè)，收集OD280為0.01以上的洗脫液；(3)冷凍干燥將納豆激酶洗脫液經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，加入添加劑及賦型劑，分裝，冷凍干燥，獲得納豆激酶凍干粉劑。
在上述純化方法中，步驟(1)所述將納豆菌發(fā)酵液離心是采用高速冷凍離心機(jī)在4～10℃，8000～16000rpm的速度下離心5～10min；或者是采用發(fā)酵罐夾層冷卻法冷卻至4～15℃，用高速管式離心機(jī)以10000～16000rpm的速度離心。
在上述純化方法中，步驟(2)所述離子交換層析所用的柱規(guī)格為內(nèi)徑3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或?yàn)閮?nèi)徑16～20厘米，高38～60厘米。
在上述純化方法中，步驟(3)所述濾膜為0.2μm濾膜。
在上述純化方法中，步驟(3)所述的添加劑為吐溫-80，用量為0.05％，所述賦型劑為甘露醇，用量為2％。
在上述純化方法中，步驟(3)所述加入添加劑及賦型劑調(diào)節(jié)濃度為1000IU/mL后再分裝。
在上述純化方法中，步驟(3)所述冷凍干燥是指在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為5～10℃條件下冷凍干燥30～36小時(shí)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的純化方法是將納豆菌發(fā)酵液離心，取上清液，過(guò)濾，濾液經(jīng)離子交換層析柱，收集含納豆激酶的洗脫液，經(jīng)冷凍干燥即獲得納豆激酶凍干粉劑。該純化方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，可以規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.發(fā)酵液預(yù)處理將納豆菌發(fā)酵液用高速冷凍離心機(jī)在4℃下，以8000rpm的速度離心10min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾清液，作上柱液備用。
2.離子交換層析純化離子交換層析所用凝膠為CM Sepharose Fast Flow，柱規(guī)格為內(nèi)徑3.5厘米，高20厘米；凝膠先后用pH6.8、含70mM和6mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調(diào)節(jié)過(guò)濾清液的離子濃度(電導(dǎo)率調(diào)為1.8mS/cm)；調(diào)好離子濃度的過(guò)濾清液以10mL/min的速度加進(jìn)柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液洗滌柱床，再用pH6.8、含6mM的磷酸二氫鈉和1M氯化鈉的洗脫液線性梯度洗脫，流速為6mL/min；用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為280nm處檢測(cè)，收集OD280為0.01以上的洗脫液。
3.冷凍干燥將納豆激酶洗脫液用0.2μm濾膜過(guò)濾除菌，加入0.05％吐溫-80和2％甘露醇，調(diào)節(jié)濃度為1000IU/mL，用10mL硼硅注射劑瓶分裝，裝量為1mL/瓶，在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為10℃條件下冷凍干燥30小時(shí)，獲得納豆激酶凍干粉。
實(shí)施例21.發(fā)酵液預(yù)處理將納豆激酶用高速冷凍離心機(jī)在10℃下，以12000rpm的速度離心5min，收集上清液。上清液用0.2μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾清液，作為上柱樣液備用。
2.離子交換層析純化離子交換層析所用凝膠為CM Sepharose Fast Flow，柱規(guī)格為內(nèi)徑5.5厘米，高30厘米；凝膠先、后用pH6.8、含70mM和6mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調(diào)節(jié)過(guò)濾清液的離子濃度(電導(dǎo)率調(diào)為2.0mS/cm)；將調(diào)好離子濃度的過(guò)濾清液以15mL/min的速度加進(jìn)柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液洗滌柱床，再用pH6.8、含6mM磷酸二氫鈉和0.5M氯化鈉的洗脫液線性梯度洗脫，流速為10mL/min；用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，收集OD280為0.01以上的洗脫液。
3.冷凍干燥將收集到的納豆激酶洗脫液經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾除菌，加入0.05％吐溫-80和2％甘露醇，調(diào)節(jié)濃度為1000IU/mL，用10mL硼硅注射劑瓶分裝，裝量為1mL/瓶，在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為5℃條件下冷凍干燥36小時(shí)，即獲得納豆激酶凍干粉。
實(shí)施例31.發(fā)酵液預(yù)處理將納豆菌發(fā)酵液通過(guò)發(fā)酵罐夾層冷卻法冷卻至15℃，用高速管式離心機(jī)以16000rpm的速度離心，收集上清液。上清液用0.2μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾清液，作為上柱樣液備用。
2.離子交換層析純化離子交換層析所用凝膠為CM Sepharose Fast Flow，柱規(guī)格為內(nèi)徑16厘米，高38厘米；凝膠先、后用pH6.0、含70mM和6mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調(diào)節(jié)已準(zhǔn)備的過(guò)濾清液的離子濃度(電導(dǎo)率調(diào)為2.2mS/cm)，裝入塑料桶中，加進(jìn)2L已平衡好的CM Sepharose FastFlow凝膠，調(diào)pH為6.0，用攪拌機(jī)慢速攪拌吸附30分鐘，吸附完成，濾掉清液，洗滌凝膠，凝膠上柱；再用pH6.8、含6mM的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，最后用pH6.8、含6mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉的洗脫液洗脫，流速為50mL/min；用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處檢測(cè)，收集OD280為0.01以上的洗脫液。
3.冷凍干燥將收集到的納豆激酶洗脫液經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾除菌，加入添加劑0.05％吐溫-80、賦型劑2％甘露醇，調(diào)節(jié)濃度為1000IU/mL，用10mL硼硅注射劑瓶分裝，裝量為1mL/瓶，在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為8℃條件下冷凍干燥32小時(shí)，即獲得納豆激酶凍干粉劑。
權(quán)利要求
1.一種納豆激酶的純化方法，包括如下步驟(1)發(fā)酵液預(yù)處理將納豆菌發(fā)酵液離心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾清液；(2)離子交換層析柱純化離子交換層析所用凝膠為CM SepharoseFast Flow，凝膠先用pH6.8、含6～70mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調(diào)節(jié)過(guò)濾清液的離子濃度，使其電導(dǎo)率為1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速將其加入柱中，先用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液洗滌柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氫鈉和0～1M氯化鈉的洗脫液線型梯度洗脫，流速為5～10mL/min；或把經(jīng)調(diào)節(jié)離子濃度的過(guò)濾清液在加入柱之前先裝入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝膠，調(diào)pH為6.0，用攪拌機(jī)慢速攪拌吸附30分鐘，吸附完成，濾掉清液，洗滌凝膠，凝膠上柱，再用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉的溶液洗脫，流速為30～100mL/min；用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為280nm處檢測(cè)，收集OD280為0.01以上的洗脫液；(3)冷凍干燥將納豆激酶洗脫液經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，加入添加劑及賦型劑，分裝，冷凍干燥，獲得納豆激酶凍干粉劑。
2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(1)所述將納豆菌發(fā)酵液離心是采用高速冷凍離心機(jī)在4～10℃，8000～16000rpm的速度下離心5～10min；或者是采用發(fā)酵罐夾層冷卻法冷卻至4～15℃，用高速管式離心機(jī)以10000～16000rpm的速度離心。
3.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(2)所述離子交換層析所用的柱規(guī)格為內(nèi)徑3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或?yàn)閮?nèi)徑16～20厘米，高38～60厘米。
4.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)所述濾膜為0.2μm濾膜。
5.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)所述的添加劑為吐溫-80，用量為0.05％；所述賦型劑為甘露醇，用量為2％。
6.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)所述加入添加劑及賦型劑調(diào)節(jié)濃度為1000IU/mL后再分裝。
7.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于步驟(3)所述冷凍干燥是指在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為5～10℃條件下冷凍干燥30～36小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種納豆激酶的純化方法。本發(fā)明的純化方法是將納豆菌發(fā)酵液離心，取上清液，過(guò)濾，濾液經(jīng)離子交換層析柱，收集含納豆激酶的洗脫液，經(jīng)冷凍干燥即獲得納豆激酶凍干粉劑。該純化方法工藝簡(jiǎn)單，操作方便，可以規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101058804SQ20071002748
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者彭中健, 夏楓耿, 李運(yùn)南, 梁淑娃, 董加喜, 譚穎嫦, 藍(lán)碧鋒, 杜少平, 明飛平 申請(qǐng)人:廣州市微生物研究所