專利名稱：：南極假絲酵母脂肪酶b基因及其在酵母展示中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能在畢赤巴斯德酵母中高效表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B的改良基因序列和展示有高活力脂肪酶的酵母菌，以及從該重組酵母中得到的基因工程脂肪酶。
背景技術(shù)：
：來源于南極假絲酵母(Candidaantarctica)的南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)是一類重要的脂肪酶，在酯化、水解、轉(zhuǎn)酯、以及其它類型反應(yīng)中都顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。然而，游離脂肪酶對溫度及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性較差，反應(yīng)產(chǎn)物分離困難，難以適應(yīng)不同工業(yè)生產(chǎn)條件的需求。利用酵母表面展示技術(shù)，外源脂肪酶可借助于錨定在細(xì)胞壁的載體蛋白固定在酵母細(xì)胞表面，類似酶的固定化，保持了脂肪酶相對獨(dú)立的空間構(gòu)象和原有的生物活性，表現(xiàn)出耐溫、耐有機(jī)溶媒以及熱穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性，如天然的米根霉脂肪酶(Rhizopusoryzaelipase，ROL)在有機(jī)溶劑中是不能催化對映體拆分的，而展示的ROL卻可以催化對映體拆分。脂肪酶蛋白酵母表面展示技術(shù)可以在標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)酶在酵母細(xì)胞表面的固定(展示)，不僅保留了固定化酶回收方便、可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，更省去了酶的分離純化以及固定化等步驟，有望成為酶固定化的替代方法之一?；贑ALB的優(yōu)良特性，人們對其進(jìn)行了商業(yè)化的開發(fā)，但高成本依然限制了CALB廣泛應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)。近來，日本的研究學(xué)者嘗試將野生型CALB展示于釀酒細(xì)胞表面，但酶在釀酒酵母細(xì)胞表面展示后表現(xiàn)出催化效率偏低，成為制約其發(fā)展的瓶頸。畢赤酵母具有受甲醇調(diào)控的A0X1基因強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠穩(wěn)定展示糖基化和二硫鍵異構(gòu)化等修飾的真核蛋白，較釀酒酵母而言，更具有表達(dá)量高，胞外表達(dá)本底蛋白少等優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母展示與釀酒酵母展示相比，畢赤酵母更易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，因此一般可獲得高于釀酒酵母的酶產(chǎn)量。目前報(bào)道畢赤酵母表面展示的脂肪酶較少，這與畢赤酵母表面展示系統(tǒng)開發(fā)較晚，載體系統(tǒng)不成熟，展示能力不穩(wěn)定有關(guān)。具體到CALB的展示，發(fā)明人(Shuang-yanHan,etal.HighlyefficientsynthesisofethylhexanoatecatalyzedbyCALB-displayingSaccharomycescerevisiaewhole-cellsinnon-aqueousphase,JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2009,59:168—172)已將未修飾的原始CALB基因在釀酒酵母表面展示，酶水解活力為17U/g干細(xì)胞，產(chǎn)量低，大大限制了其作為全細(xì)胞催化劑的應(yīng)用和CALB脂肪酶酶制劑的開發(fā)。因而急需在增加酶的展示量、尋找更合適的展示宿主，以及改良展示酶的催化特性等方面的研究完善，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有脂肪酶展示催化效率低，提供一種能在畢赤酵母表面高效展示的南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)的基因序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述基因序列克隆的載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供指導(dǎo)CALB展示表達(dá)在畢赤酵母細(xì)胞表面的重組質(zhì)粒載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力CALB的畢赤酵母工程菌。本發(fā)明提供的南極假絲酵母脂肪酶核苷酸序列，利用基因工程的方法，實(shí)現(xiàn)該基因在畢赤酵母細(xì)胞表面的高效的展示，以提高脂肪酶在細(xì)胞表面的展示量和熱穩(wěn)定性，從而提供一種高效率，耐熱脂肪酶，降低脂肪酶生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)畢赤酵母中高效表達(dá)的改良calb基因根據(jù)已報(bào)道的南極假絲酵母脂肪酶b的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物信息學(xué)計(jì)算，設(shè)計(jì)多個(gè)氨基酸的突變和不同突變位點(diǎn)的組合，建立野生型CALB的突變庫，通過熱穩(wěn)定性、酶活力篩選，發(fā)現(xiàn)對野生型的CALB(Genbank:Z30645,來源于南極假絲酵母LF058株)的氨基酸序列設(shè)計(jì)如下突變，Pro226Asn，Leu227Lys，Phe228Thr，Val229Ser，Leu285Gly，Ala286Met，Ala288Ile，改良后CALB具體的氨基酸序列為SEQ.ID.NOl，突變后的CALB耐熱性顯著提高，75。C保溫16h時(shí)，活力降低50%，較野生型75'C半衰期為8h提高l倍。進(jìn)一步利用畢赤巴斯德酵母菌的偏好密碼子置換出野生型calb基因中稀有密碼子，序列具與seq.id.n02從核苷酸第1_978位具有85%的同源性。上述的改良CALB基因可以通過化學(xué)法(e-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法)，使用全自動(dòng)合成儀合成，這種體外使用核酸自動(dòng)合成儀合成的DNA分子，編碼與野生型CALB蛋白在氨基酸水平上有7個(gè)位點(diǎn)不同，但具有相同功能和不同催化能力的核苷酸序列。本發(fā)明中人工合成改良脂肪酶基因工作可以通過專門的生物技術(shù)公司或機(jī)構(gòu)(如深圳華大基因科技有限公司、上海生工生物工程公司，)采用核酸自動(dòng)合成儀以及PCR拼接方法完成。(2)具有上述基因序列克隆的載體的構(gòu)建利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3'末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，將獲得的改良脂肪酶基因PCR產(chǎn)物與T載體在連接酶作用下實(shí)現(xiàn)體外連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂平板培養(yǎng)過夜，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選的陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證。克隆脂肪酶基因用的T載體可以是市售通用的任意T載體，如pUC57、pGEM-T、PMD18-T、PMD19-T等。本發(fā)明選用了pUC-57，獲得了攜帶改良CALB基因的質(zhì)粒載體pUC57-CALB。本發(fā)明所述基因的重組載體CCTCCM209081，其中fi￡是指脂肪酶基因序列；攜帶該質(zhì)粒的菌株大腸桿菌DH5c^pUC57-CALB(五"/zen'cWaDH5a/pUC57-CALB)于2009年4月22日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO:M209081。保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)(430072)。(3)脂肪酶展示表達(dá)到酵母細(xì)胞外的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)改良CALB在畢赤巴斯德酵母中的展示表達(dá)，采用pKFS(申請?zhí)?00810028631.9，此展示載體在pPIC9K(Invitrogen公司真核表達(dá)載體)的基礎(chǔ)上利用限制性內(nèi)切酶f"RI和7Vbrt將原載體上的信號肽部分基因切除，在此基礎(chǔ)上用來源于釀酒酵母的絮凝素基因FS替換。該質(zhì)粒主要包含5，^m、3，WJ、/^(絮凝素基因)、〃ZS4，以及^^+、A77S+等元件，同時(shí)包含可用來克隆脂肪酶基因的多克隆位點(diǎn)，包括限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)MwI、J戸I、SflcII、五coRI、爿vrll、KI)為克隆表達(dá)載體。去除了ifMZ上游編碼自身信號肽的24個(gè)氨基酸對應(yīng)的序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。根據(jù)GenBank中已報(bào)道的南極假絲酵母脂肪酶B序列(GenBank:Z30645.1)，克隆CALB基因時(shí)去除了C4丄5上游編碼自身信號肽的18個(gè)氨基酸以及前導(dǎo)肽7個(gè)氨基酸對應(yīng)的核苷酸序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。根據(jù)上述思路設(shè)計(jì)引物Pl為5'TAGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTC(框內(nèi)部分為五coRI酶切位點(diǎn))，引物P25'TATGCGGCCGCTCAGGGGGTGACGATG(框內(nèi)部分為iVofI酶切位點(diǎn))以質(zhì)粒pUC57-CALB為模板，Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物和pKFS質(zhì)粒都用和M)fI雙酶切，體外連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pKFS-CALB。")提供具有上述基因序列的高表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母工程菌以LiCl法將Sa/I線性化的重組質(zhì)粒pKFS-CALB轉(zhuǎn)化畢赤巴斯德酵母宿主菌GS115或KM71，轉(zhuǎn)化物涂布于MD平板，培養(yǎng)2—3d。將MD平板上的轉(zhuǎn)化子分別接種于含不同濃度的G418抗性YPD平板上，培養(yǎng)3—5d。將高濃度G418-YPD平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子挑取其對應(yīng)的單克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，進(jìn)行酵母基因組PCR鑒定，獲得重組轉(zhuǎn)化子。重組轉(zhuǎn)化子先接種于200mL的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至006()()到8-12作為種子液。培養(yǎng)種子液8—10瓶，然后以5-10%的接種量(體積比)轉(zhuǎn)接至含20-35LBSM培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，甘油耗完后再補(bǔ)加5-8L50M(體積比，1:1)的甘油，至二次甘油消耗完，OD6oo達(dá)280-320左右，饑餓0.5-lh后，補(bǔ)料甲醇，甲醇流加速度為30g/L*h—60g/Lh,溶氧控制在5—10%，氨水自動(dòng)流加，發(fā)酵120-140h后結(jié)束，展示在畢赤酵母表面CALB水解對硝基苯酚丁酸酯的高達(dá)130U/g酵母干細(xì)胞。含有表達(dá)載體pKFS-C^5轉(zhuǎn)化的畢赤巴斯德酵母可用于短鏈芳香酯、生物柴油以及糖苷類的催化合成。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明釆用酵母表面展示系統(tǒng)表達(dá)酶，在保持酶高活力、高催化性能的同時(shí)，相比游離酶或固定化酶省略了純化分離的繁瑣步驟，更具有固定^:酶的優(yōu)點(diǎn)，可以反復(fù)使用，操作穩(wěn)定性強(qiáng)。脂肪酶應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐時(shí)，除對高酶活有要求外，對酶的耐熱性也是重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)的內(nèi)容，本發(fā)明利用生物信息學(xué)，結(jié)合定向進(jìn)化手段，獲得突變的CALB活力可耐75'C高溫，最適作用溫度為55'C，較野生型的最適溫度提高了l(TC。同時(shí)考慮到酵母表達(dá)非同種、非同屬的外源基因時(shí)，也表現(xiàn)出來了產(chǎn)量不高，表達(dá)能力降低的問題，針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)合成適合其表達(dá)的RML基因，有效了解決了上述問題，實(shí)現(xiàn)了酶的高表達(dá)，表達(dá)活力高達(dá)130U/g酵母干細(xì)胞，為現(xiàn)有報(bào)道的最高水平。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合幅圖與實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。實(shí)施例l:改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成現(xiàn)有的南極假絲酵母脂肪酶B(Genbank:Z30645，來源于南極假絲酵母LF058株)，其基因如SEQ.ID.N03所示，而南極假絲酵母對密碼子的偏好性與畢赤酵母存在一定差距。本發(fā)明首先借助生物信息學(xué)預(yù)測，對野生型南極假絲酵母脂肪酶B實(shí)現(xiàn)不同位點(diǎn)、不同氨基酸的飽和突變，之后通過定向進(jìn)化和高通量篩選，篩到1株酶活力和耐熱性均顯著提高的菌株，通過測序，發(fā)現(xiàn)相對野生型的CALB的氨基酸序列有如下突變，Pro226Asn，Leu227Lys，Phe228Thr，Val229Ser，Leu285Gly，Ala286Met，Ala288Ile，改良后的CAL具體的氨基酸序列為SEQ.ID.NOl,在此基礎(chǔ)上，采用畢赤巴斯德酵母偏好的密碼子替換CALB在畢赤酵母中使用頻率低的密碼子，設(shè)計(jì)出在畢赤巴斯德酵母中使用頻率高的基因序列，形成以下具體的基因序列，如SEQ.ID.N02，從而提高CALB在畢赤酵母中的表達(dá)量。本發(fā)明提供的基因序列可以通過專門的生物技術(shù)公司或機(jī)構(gòu)使用全自動(dòng)合成儀合成。實(shí)施例2:pUC-CALB質(zhì)粒的構(gòu)建上步獲得的全合成基因可與pUC57進(jìn)行TA克隆實(shí)現(xiàn)體外鏈接，可按照說明書進(jìn)行操作。10uL體積反應(yīng)體系如下T載體luL(50ng)，加入全合成基因產(chǎn)物3uL，含ATP的10XBuffer1HL，T4DNA連接酶1iiL，用ddH20補(bǔ)足至10uL。稍加離心，16。C水浴連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co/i'DH5a，然后涂布到含0.5mMIPTG，40ug/mlX-Gal指示平板上，過夜培養(yǎng)，挑選白斑提取質(zhì)粒酶切鑒定后，將重組質(zhì)粒PMD18-T-iMi:送上海生工生物工程有限公司測序，測序表明克隆的基因與我們所述的全合成基因一致。實(shí)施例3:重組質(zhì)粒pKFS-CALB的構(gòu)建以質(zhì)粒pUC57-CALB為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。體系為模板lpL;10xr"《DNA聚合酶buffer5pL(含Mg2+);2.5wwo〃LdNTP4pL;20pMmol/L的引物各lpL;%《DNA聚合酶0.75pL，加無菌水至總體積為50pL。反應(yīng)條件為:94"預(yù)變性5min;94'C變性45s，45。C退火45s，72。C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；第30個(gè)循環(huán)72。C延伸10min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收純化。將全合成基因的PCR產(chǎn)物和pKFS質(zhì)粒都用&0//和MfI雙酶切，進(jìn)行體外連接。20PL體積反應(yīng)體系如下pKFS質(zhì)粒2liL(50ng)，PCR產(chǎn)物15yL(50ng)，10XBuffer2uL，T4DNA連接酶luL。16'C水浴連接過夜后，去連接產(chǎn)物10uL用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.co/!'TopiOF，在Amp+LB(50mg/mL)平板上涂板，提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行Eco及/和WWI雙酶切鑒定。鑒定正確后，同樣委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。實(shí)施例4:表達(dá)高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌的培養(yǎng)以LiCI法將Sail線性化的重組質(zhì)粒pKFS-CALB轉(zhuǎn)化宿主菌GS115，轉(zhuǎn)化物涂布于MD平板，30。C培養(yǎng)2d。將MD平板上的轉(zhuǎn)化子分別接種于含G4180.5mg/mL,1.0mg/mL，L5mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL的YPD平板上，30。C培養(yǎng)3d。將高濃度G418-YPD平板(3.0mg/mL)上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子挑取單克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，利用目的基因序列的PCR引物進(jìn)行酵母基因組PCR鑒定，總反應(yīng)體積為2(HiL，T叫酶量為2U，取2pLPCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的重組轉(zhuǎn)化子GS115/pKFS-C4LS先接種于200mL的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD咖至[J10作為種子液。培養(yǎng)種子液8瓶，然后以5%的接種量(體積比)轉(zhuǎn)接至含30LBSM培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，甘油耗完后再補(bǔ)加6L50%(質(zhì)量體積比)的甘油，至二次甘油消耗完，OD6oo達(dá)300，饑餓半小時(shí)后，補(bǔ)料甲醇，甲醇流加速度為30g/L*h—60g/L*h，溶氧控制在5—10%，氨水自動(dòng)流加，發(fā)酵120h后結(jié)束。發(fā)酵液在7000rpm、4'C離心10分鐘，棄上清，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經(jīng)真空冷凍干燥24h，得菌體凍干粉。利用對硝基苯酚丁酸酯(PNPB)做底物進(jìn)行NaOH法滴定測定脂肪酶水解活力，結(jié)果顯示該脂肪酶活力高達(dá)130U/g酵母干細(xì)胞，比現(xiàn)有技術(shù)(T.Tanino，T.Ohno,T.Aoki,H.Fukuda，A.Kondo,DevelopmentofyeastcellsdisplayingCandidaantarcticalipaseBandtheirapplicationtoestersynthesisreactionAppl.Microbiol.Biotechol.2007，75:1319-1325)報(bào)道的釀酒酵母展示的CALBCBS6678的酶活力(20.4U/g酵母干細(xì)胞)提高近6倍。1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘水解底物對硝基苯酚丁酸酯生成1pmol對硝基苯酚所需的酶量。實(shí)施例5:葡萄糖月桂酸酯的合成采用葡萄糖和月桂酸為原料，使用有機(jī)溶劑叔戊醇和二甲基亞砜，在畢赤酵母細(xì)胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發(fā)生酯化反應(yīng)，得到糖酯產(chǎn)品。有機(jī)溶劑叔戊醇和二甲基亞砜(4ml的叔戊醇，lml的二甲基亞砜)預(yù)先用4A分子篩充分除水。取底物0.595g葡萄糖，1.2g月桂酸(?；w和?；荏w摩爾比為2:1)于25ml具塞三角瓶中，在55度下預(yù)熱20min，然后加入0.3g(約39U)畢赤酵母工程菌菌體凍干粉(實(shí)施例4制備的)，反應(yīng)溫度55'C，然后于200rpm下振蕩反應(yīng)72h。反應(yīng)完成后離心取上清，然后上高效液相色譜定量分析(液相色譜waters2695;檢測器蒸發(fā)光散色檢測器2424;柱子C18柱)，最終葡萄糖酯的產(chǎn)率為70%。實(shí)施例6:果糖月桂酸酯的合成采用果糖和月桂酸為原料，使用有機(jī)溶劑叔戊醇和二甲基亞砜，在畢赤酵母細(xì)胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發(fā)生酯化反應(yīng)，得到糖酯產(chǎn)品。有機(jī)溶劑叔戊醇和二甲基亞砜(4ml的叔戊醇，lml的二甲基亞砜)預(yù)先用4A分子篩充分除水。取底物0.54g果糖，L2g月桂酸(酰基供體和?；荏w摩爾比為2:1)于25ml具塞三角瓶中，在55t:下預(yù)熱20min，然后加入0.2g(約26U)畢赤酵母工程菌菌體凍干粉，反應(yīng)溫度55'C，然后于200rpm下振蕩反應(yīng)72h。反應(yīng)完成后離心取上清，然后上高效液相色譜定量分析(液相色譜waters2695;檢測器蒸發(fā)光散色檢測器2424;柱子C18柱)，最終果糖的產(chǎn)率為80%。實(shí)施例7:油酸甲酯的合成采用大豆油和甲醇為原料，使用有機(jī)溶劑異辛垸(2ml)，在畢赤酵母細(xì)胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，得到脂肪酸甲酯產(chǎn)品。異辛垸(2ml)預(yù)先用3A分子篩充分除水。向25ml具塞錐形瓶中加入0.965g大豆油和0.0525g甲醇(摩爾比為1)，放于40。C的恒溫空氣搖床(200rpm)中預(yù)熱20min，然后加入0,2g(約26U，實(shí)施例4制備)實(shí)施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉開始反應(yīng)。反應(yīng)溫度55。C,然后于200rpm下振蕩反應(yīng)，在反應(yīng)24h和48h后分別加入0.0525g甲醇(最終醇油摩爾比為3:1)，反應(yīng)72h，反應(yīng)完成后離心取上清，然后上氣相色譜分析(氣相色譜.-安捷倫7890C;檢測器氫離子檢測器；柱子DB-FFAP毛細(xì)管柱)，最終脂肪酸甲酯產(chǎn)率為65%。實(shí)施例8:非水相酯化反應(yīng)制備己酸乙酯試劑都預(yù)先用3A分子篩充分除水。在25ml具塞三角瓶中加入4.604ral的正庚垸，375yl的正己酸(終濃度0.6M)和實(shí)施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉(O.lg,約13U)放于40度的恒溫?fù)u床中預(yù)熱10min，然后加入219"1無水乙醇(反應(yīng)體系中，正己酸與乙醇的摩爾比為l:1.25)，在40度搖床中反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為0.5h和5h時(shí)，分別加入0.6g和0.3g分子篩，反應(yīng)6h，己酸的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到95%。在上述條件下反應(yīng)后，離心回收菌體，經(jīng)溶劑正庚垸洗滌，去除產(chǎn)物和殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應(yīng)體系中催化酯化反應(yīng)，經(jīng)過IO批次的連續(xù)使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的轉(zhuǎn)化率保持在95%以上。由實(shí)施例5、6、7、8可見，應(yīng)用實(shí)施例4制備的畢赤酵母工程菌菌體凍干粉均能有效催化糖脂、油酸甲酯以及己酸乙酯的合成，由于該菌體凍干粉作為催化劑，與游離酶和固定化酶相比，省去了分離純化的繁瑣步驟，易于制備，生產(chǎn)周期短，操作穩(wěn)定性強(qiáng)，有利于降低生產(chǎn)成本，并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。序列列表SEQ.ID.NOl:(改良后的南極假絲酵母的氨基酸序列，劃線部分標(biāo)出的是與Genank中提供(Z30645)的不一致之處)MATPLVKRLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP*SEQ.ID.N02:(改良后的南極假絲酵母DNA序列，包括了AA突變和密碼子偏好)AAGAGAACTTGTTCTGGTATTGTTACTCCATAA〃SEQ.ID.N03:野生型的南極假絲酵母的DNA序列:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種南極假絲酵母脂肪酶B基因，其特征在于，其編碼的蛋白與野生型南極假絲酵母脂肪酶蛋白在氨基酸水平具有相同的功能，其酶的耐熱能力為50-80℃，半衰期為3h-24h，所述的核苷酸序列在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ.ID.NO2從核苷酸第1-978位雜交。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南極假絲酵母脂肪酶B基因，其特征在于，按照畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)核苷酸序列，南極假絲酵母脂肪酶B基因具有與SEQ.ID.N02從核苷酸第1-978位85%的同源性。3、一種含有權(quán)利要求l所述南極假絲酵母脂肪酶B基因的重組載體pUC57-CALB，其中^Z5是指權(quán)利要求1所述的脂肪酶基因序列；攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌DH5VpUC57-CALB(Eyc/zm'c/n》co//DH5a/pUC57-CALB)的保藏號為CCTCCNO:M209081。4、一種含有權(quán)利要求1所述基因的重組質(zhì)粒沐FS-CALB，其中C^"是指權(quán)利要求1所述的脂肪酶基因；以重組載體pUC57-"Z5為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增C^^后利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pKFS-CALB。5、一種由權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒沐FS-CALB所轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌，其特征在于，將表達(dá)載體pKFS-C4丄5轉(zhuǎn)化入畢赤巴斯德酵母。6、一種含有權(quán)利要求5表達(dá)載體pKFS-C4i:s轉(zhuǎn)化的畢赤巴斯德酵母短鏈芳香酯、生物柴油以及糖苷類的催化合成中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的應(yīng)用。改良的南極假絲酵母B其編碼的蛋白與野生型南極假絲酵母脂肪酶蛋白在氨基酸水平具有相同的功能，其酶的耐熱能力為50-80℃，半衰期為3h-24h，核苷酸序列在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ.ID.NO2從核苷酸第1-978位雜交。攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α/pUC57-CALB(EscherichiacoliDH5α/pUC57-CALB)的保藏號為CCTCCM209081。將其基因轉(zhuǎn)入到畢赤酵母宿主菌中，實(shí)現(xiàn)南極假絲酵母脂肪酶B在畢赤酵母中的高效展示表達(dá)，提供的畢赤酵母菌能有效展示南極假絲酵母脂肪酶B能廣泛應(yīng)用于合成己酸乙酯、糖脂，具有不同熔點(diǎn)且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重構(gòu)脂”等。文檔編號C12P7/64GK101565713SQ200910039860公開日2009年10月28日申請日期2009年6月1日優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日發(fā)明者影林,蘇國棟,鄭穗平,韓雙艷,黃登峰申請人:華南理工大學(xué)