專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，及其所產(chǎn)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基 因和其在非水相中催化合成小肽的應(yīng)用，屬于微生物學(xué)與酶學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白酶是指能催化肽鍵水解的一類(lèi)酶，由于其重要的商業(yè)價(jià)值而被廣泛關(guān)注并 逐漸成為三大工業(yè)用酶之一。當(dāng)今蛋白酶的產(chǎn)量已經(jīng)占據(jù)商品酶市場(chǎng)的40%以上，被 廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、醫(yī)藥、皮革、有機(jī)合成、廢物處理等領(lǐng)域。蛋白酶雖然存在 于幾乎所有生物中，但由于微生物生產(chǎn)的蛋白酶主要是胞外酶，與動(dòng)物、植物來(lái)源的蛋 白酶相比更適合工業(yè)化，所以微生物來(lái)源的蛋白酶的產(chǎn)量占目前蛋白酶總產(chǎn)量的2/3以 上。
通常情況下，蛋白酶催化水解肽鍵的反應(yīng)是在特定的pH的緩沖溶液中進(jìn)行的， 而且蛋白酶對(duì)其所催化肽鍵的氨基酸殘基具有特異性要求，即有著高度的區(qū)域選擇性和 立體選擇性。近幾年，人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶在有機(jī)溶劑中能夠催化一些水溶液中不能進(jìn)行的 反應(yīng)，比如在非水條件下，蛋白酶能催化肽鍵的形成。大量的研究表明，非水相中進(jìn) 行酶促反應(yīng)有著許多的優(yōu)點(diǎn)1)增大各種有機(jī)底物的溶解度；2、具有高度的立體選擇性 和區(qū)域選擇性，有機(jī)介質(zhì)可改變選擇性；幻控制反應(yīng)平衡向所需方向移動(dòng)，如水解酶在 有機(jī)介質(zhì)中能催化脫水縮合反應(yīng)；4)有效防止微生物污染，產(chǎn)物易于分離純化等。有機(jī) 相生物催化展示了酶類(lèi)在有機(jī)溶劑中應(yīng)用的具大潛力。蛋白酶在非水相中的優(yōu)勢(shì)是能催 化肽鍵與酯鍵的形成，從而被應(yīng)用于一些重要中間體的合成及手性藥物的拆分中。
有機(jī)溶劑體系中酶催化的誘人前景與酶易失活的矛盾推動(dòng)了酶的改造與非水酶 學(xué)的發(fā)展。過(guò)去20多年，研究者致力于提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性。天然具有有機(jī) 溶劑穩(wěn)定性的蛋白酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型蛋白酶，具有能穩(wěn)定存在于有機(jī)溶劑中的 天然特性。這類(lèi)蛋白酶通常由耐有機(jī)溶劑極端微生物產(chǎn)生。盡管有機(jī)溶劑對(duì)微生物細(xì)胞 具有極大的毒害，但近年來(lái)有關(guān)耐有機(jī)溶劑的極端微生物成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。由于耐有 機(jī)溶劑極端微生物能在富含有機(jī)溶劑的環(huán)境中生存，因此由這類(lèi)微生物分泌到胞外的酶 也具有一定的有機(jī)溶劑耐受性。
目前已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌絕大多數(shù)集中是假單菌屬 (Pseudomonas),然而大多報(bào)道的蛋白酶的相關(guān)溶劑測(cè)定耐受濃度較低(約25%，ν/ν), 并且存在酶產(chǎn)量低、不易純化、底物選擇專(zhuān)一性強(qiáng)等缺點(diǎn)，從而影響其在工業(yè)催化中的 應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的菌株，使得其所產(chǎn) 的耐高濃度有機(jī)溶劑的蛋白酶能夠成功應(yīng)用于工業(yè)化非水相小肽合成。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
本發(fā)明從油污土樣中篩選獲得一株耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，經(jīng)BIOLOG全自 動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分析表明該菌株該菌為蠟樣芽孢桿菌，分類(lèi)命名為蠟 樣芽孢桿菌Bacillus cereus WQ9-2,其保藏號(hào)登記號(hào)為CCTCC NO M 2010010。
本發(fā)明對(duì)Bacillus cereus WQ9-2進(jìn)行了生物特征鑒定，結(jié)果表明該菌為革蘭氏陽(yáng) 性菌，有芽孢生成；在有氧條件下生長(zhǎng)；在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h后，菌落直徑大小為 3mm 5mm，生長(zhǎng)范圍為20°C 40°C，最適生長(zhǎng)溫度為，生長(zhǎng)pH為6.0 11.0， 最適生長(zhǎng)pH為8.0。Bacillus cereus WQ9-2的生理生化特性表現(xiàn)在氧化酶反應(yīng)結(jié)果為 陰性，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、以及D-果糖利用的結(jié)果為陽(yáng)性，D-木糖以及乳糖的利 用結(jié)果為陰性。
本發(fā)明對(duì)Bacillus cereus WQ9-2進(jìn)行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，優(yōu)化后產(chǎn)酶量高達(dá) 3528U/mL,是優(yōu)化前 1230U/mL 的 2.9 倍。
本發(fā)明對(duì)該菌產(chǎn)生的胞外酶進(jìn)行了純化，經(jīng)過(guò)兩步分離純化得到電泳純的蛋白 酶，命名為耐有機(jī)溶劑WQ9-2蛋白酶，純化后其比酶活為78509U/mg。
本發(fā)明對(duì)耐有機(jī)溶劑WQ9-2蛋白酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，實(shí)驗(yàn)證明該蛋白酶 對(duì)多種有機(jī)溶劑都具有良好的耐受性，并且耐受濃度高達(dá)50% (ν/ν)，大大優(yōu)于多已報(bào) 道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶耐受濃度(25%，ν/ν)；耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的最適pH為 8.0，有效作用的pH值范圍為7 10，為中性蛋白酶，其最佳反應(yīng)溫度為45°C，5mM的 Ca2+離子對(duì)該酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性有顯著的提高作用。
本發(fā)明分離克隆到該菌株所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的編碼基因，通過(guò)PCR法分離 克隆了這一耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因，它具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，DNA全 序列分析結(jié)果表明，耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因WQ9-2全長(zhǎng)1701個(gè)核苷酸，編碼567個(gè)氨 基酸，其中成熟肽為317個(gè)氨基酸。該基因與Bacillus cereus ATCC 14579編碼芽孢菌粘 素的基因同源性為92%，其中成熟肽氨基酸部分同源性為98%。其氨基酸序列示于SEQ ID NO 2。
本發(fā)明提供了耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2在有機(jī)相中催化小肽合成中的應(yīng)用。將 純化的WQ9-2蛋白酶應(yīng)用到有機(jī)相合成不同的小肽合成反應(yīng)中，結(jié)果表明含有50% (ν/ ν)DMSO的Tris-HCl (ρΗ8.5，0.05Μ)溶液是一種優(yōu)良的合成反應(yīng)體系，WQ9-2蛋白酶能 夠在該體系中催化多種小肽合成并且成功實(shí)現(xiàn)了多組反應(yīng)與分離的耦合。
本發(fā)明的有益效果在于
蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus WQ9-2分泌的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的有機(jī)溶劑耐受 性強(qiáng)，產(chǎn)率高、具有高比活、能夠識(shí)別的底物范疇寬等優(yōu)點(diǎn)；耐有機(jī)溶劑WQ9-2在有機(jī) 溶劑中催化小肽前體的成功應(yīng)用，進(jìn)一步證明該酶在有機(jī)溶劑催化反應(yīng)中具有優(yōu)良的性 能，在小肽合成以及制藥等行業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。


圖1為耐有機(jī)溶劑WQ9-2蛋白酶的SDS-PAGE電泳圖，
其中，泳道I-Marker ；泳道2-粗酶液；泳道3-純酶液；
圖2為耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的最適反應(yīng)pH ；
圖3為耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的pH穩(wěn)定性；
圖4為耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的最適反應(yīng)溫度；
圖5為耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的溫度穩(wěn)定性。
本發(fā)明的微生物分類(lèi)命名為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus WQ9-2,保藏日期為 2010年1月15日，保藏單位全稱(chēng)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏單位地 址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO: M 2010010。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
本實(shí)施例說(shuō)明產(chǎn)生耐有機(jī)溶劑蛋白酶的天然菌株的篩選方法。
采用不同濃度的環(huán)己烷、甲苯等有機(jī)溶劑作為篩選壓力從油污土樣中篩選獲得 耐有機(jī)溶劑極端微生物采用牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基，具體配方為(g/L)胰蛋白胨5、酵 母粉3、脫脂奶粉25、瓊脂12。將所篩選到的耐有機(jī)溶劑微生物接種于牛奶瓊脂平板， 根據(jù)菌落與透明圈大小的比值，初步篩選蛋白酶產(chǎn)量高的菌株。此方法篩選到具有蛋白 酶產(chǎn)量高的耐有機(jī)溶劑極端微生物13株。
為了進(jìn)一步檢測(cè)初篩得到的蛋白酶的溶劑耐受性，對(duì)13株菌的蛋白酶產(chǎn)生能力 和所產(chǎn)蛋白酶的耐有機(jī)溶劑性質(zhì)進(jìn)行全面的檢測(cè)。將初篩得到的蛋白酶產(chǎn)生菌株接種到 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方為胰蛋蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L, KH2PO4 0.5g/ L，MgSO4 0.3g/L, CaCl2 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，甘油 6.3g/L，pH7.0。培養(yǎng)溫度為 37°C,培養(yǎng)時(shí)間為72h，搖床轉(zhuǎn)速為180rmp。發(fā)酵結(jié)束后，IOOOOrmp于4°C離心15η ι， 取上清為粗酶液。在ImL粗酶液中分別加入等體積(ImL)的甲醇、甲苯、己醇、異 戊醇、丁醇、異丙醇、丙酮、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)，在 30°C、150rpm條件下振蕩處理24h，以酪蛋白為底物檢測(cè)蛋白酶剩余酶活；選取具有最 高活力的菌株作為目的有機(jī)溶劑蛋白酶生產(chǎn)菌株。
其中，蛋白酶活力檢測(cè)方法為配制酪蛋白含量為2%的pH 8.0的Tris-HCl緩 沖液作為反應(yīng)底物。取200 μ L稀釋合適倍數(shù)的酶液加入200 μ L反應(yīng)底物，40°C精確反 M IOmin,加入400 μ L TCA反應(yīng)終止液(0.11M三氯乙酸，0.22Μ醋酸鈉，0.33Μ醋酸) 終止反應(yīng)，4°C放置15η ι，15000rpm離心15η ι，于^Onm下檢測(cè)紫外吸光值。
蛋白酶活力單位(U)定義為在40°C，pH8.0緩沖液中，每分鐘催化產(chǎn)生1 μ g 酪氨酸所需要的酶量(U = ug/mL · min)。通過(guò)酶活性檢測(cè)以及有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢 測(cè)，其中一株具有優(yōu)良耐受性的蛋白酶生產(chǎn)菌株所產(chǎn)蛋白酶活力高達(dá)1230U/mL，命名為 WQ9-2。
實(shí)施例二
本實(shí)施例說(shuō)明耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌WQ9-2的生物學(xué)性質(zhì)、鑒定及其產(chǎn)酶條 件研究。
菌株WQ9-2的生物學(xué)性質(zhì)革蘭氏染色表明此菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌株，有芽 孢，在有氧條件下生長(zhǎng)。在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h后，菌落大小直徑為3_ 5mm， 生長(zhǎng)溫度范圍為20°C 40°C，最適生長(zhǎng)溫度為35°C，生長(zhǎng)pH范圍為6.0 11.0，最適生 長(zhǎng)pH為8.0，其生理生化特性表現(xiàn)在氧化酶反應(yīng)陰性，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖與D-果糖利用的結(jié)果為陽(yáng)性，D-木糖以及乳糖的利用結(jié)果為陰性。
菌株WQ9-2的菌種鑒定經(jīng)BIOLOG自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分 析，表明該菌株為蠟樣芽孢桿菌屬，并命名為Bacillus cereusWQ9-2。
Bacillus cereus WQ9-2產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法對(duì)發(fā) 酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的培養(yǎng)基為(g/L)葡萄糖17.0，酵母粉8.0，KH2PO4 0.5, MgSO4 0.3， CaCl2 0.5，NaCl 1。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為發(fā)酵初始pH 7.5，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，接種量 2% (ν/ν),接種齡12h，發(fā)酵溫度為25°C，裝液量為50mL/250mL。在此發(fā)酵條件下培 養(yǎng)48小時(shí)后蛋白酶酶活力為35^U/mL。
實(shí)施例三
本實(shí)施例說(shuō)明耐有機(jī)溶劑WQ9-2蛋白酶的純化程序。
將Bacillus cereus WQ9-2在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)4Sh后，發(fā)酵液在10,000rpm， 4°C離心ΙΟη ι，取上清液作為粗酶液；將粗酶液置于冰浴中，采用乙醇沉淀收集45% 75% (ν/ν)部分沉淀蛋白然后用0.05Μ的ρΗ8.5的Tris-HCl緩沖液溶解，10,000rpm、4°C 離心IOmin去除不能溶解的雜蛋白。將以上處理得到的酶液，采用DEAE-Sepharose FF 離子交換層析柱進(jìn)行純化，以0.05M的Tris-HCKpH 8. 緩沖液進(jìn)行洗脫，收集蛋白酶 活力峰。通過(guò)SDS-PAGE電泳圖(圖1)，發(fā)現(xiàn)兩步純化后的耐有機(jī)溶劑蛋白酶(命名為 耐有機(jī)溶劑WQ9-2蛋白酶)已達(dá)電泳純，該蛋白酶亞基分子量約為37kDa。純化倍數(shù)為 3.8倍，回收率為57%，最終蛋白酶比活達(dá)到78509U/mg，匯總見(jiàn)表1。
表1.耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的純化步驟及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，其分類(lèi)命名為蠟樣芽孢桿菌的一個(gè)新菌株，命名 為 Bacillus cereus WQ9-2,其保藏號(hào)登記號(hào)為 CCTCC NO M 2010010。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，其特征在于其所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑 WQ9-2蛋白酶具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，其特征在于耐有機(jī)溶劑WQ9-2 蛋白酶的編碼基因具有SEQIDNO 1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑蛋白酶在非水相 小肽合成體系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌及其所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基因和應(yīng)用，具體涉及一種耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，及其所產(chǎn)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶的基因和其在非水相中催化合成小肽的應(yīng)用，屬于微生物學(xué)與酶學(xué)領(lǐng)域。該菌株分類(lèi)命名為Bacilluscereus WQ9-2，為革蘭氏陽(yáng)性菌株，能耐受一定濃度的多種有機(jī)溶劑。本發(fā)明分離克隆到該菌所產(chǎn)耐有機(jī)溶劑的蛋白酶編碼基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，它具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。該蛋白酶具有產(chǎn)量高、比活高、耐受性廣而強(qiáng)等性質(zhì)。該蛋白酶具有非水相中催化小肽合成的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102021125SQ20101010380
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者何冰芳, 吳斌, 孫洪林, 歐陽(yáng)平凱, 許家興 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)