專利名稱：D-氨甲酰水解酶突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及新的D-氨甲酰水解酶突變體。
背景技術(shù)：
D-對羥基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，D-HPG)做為側(cè)鏈，是羥氨芐青 霉素(即阿莫西林，Amoxycillin)、頭孢羥氨芐(Cefadroxil)等多種半合成廣譜β -內(nèi)酰 胺類抗生素、殺蟲劑和甜味劑中間體的重要中間體，具有廣泛的應(yīng)用價值和重要的商業(yè)價值。D-HPG可以通過化學(xué)水解、菌體轉(zhuǎn)化及固定化酶等方法制備。化學(xué)水解法中涉及 到有毒物質(zhì)如HNO2的使用及消旋體手性拆分等工藝，因此反應(yīng)總收率不高且能耗較大。菌 體轉(zhuǎn)化法呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)化反應(yīng)進程緩慢與中間體氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸(N-carbamoyl-D-hydroxyphenylglycine,NC-D-HPG)積累現(xiàn)象或者該法涉及到雙菌分別發(fā)酵并兩次轉(zhuǎn)化，因 而制備工藝復(fù)雜，成本也相對較高。D-HPG也可由D-海因酶(D-hydantoinase，DHase)和 D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，DCase)水解混旋型對羥基苯海因(D，L-HPH)而得到， 酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中化學(xué)合成的D，L-5-取代乙內(nèi)酰脲在D-Hase催化下得到氨甲酰_D_對 羥基苯甘氨酸，后者在DCase的催化下生成光學(xué)純D-HPG，該方法得率及產(chǎn)品光學(xué)純度高， 且具有環(huán)境友好及成本低廉的優(yōu)勢。而固定化酶法又因為其穩(wěn)定性突出，可重復(fù)回收利用 等優(yōu)點，受到越來越多的重視(Olivieri, Fascetti et al. 1979 ；Olivieri, Fascetti et al. 1981)。而在固定化雙酶法工藝中DCase的穩(wěn)定性和可溶性不佳，成為固定化酶法制備 D-HPG的制約因素。對此，研究人員為改善D-氨甲酰水解酶的穩(wěn)定性做了大量的研究工 作。Giuliano 等將來源于 Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 的 D-氨甲酰水解 酶的243，250，279位的半胱氨酸殘基定點突變，發(fā)現(xiàn)243和279位突變?yōu)楸彼岷?，酶穩(wěn) 定性可以提高6倍(Giuliano et al. 1995)。Kaneka公司以羥胺和亞硝酸鈉對來源于 Agrobacterium sp. KNK712的D-氨甲酰水解酶進行隨機突變，獲得熱穩(wěn)定性提高約5°C的 突變體酶，測序結(jié)果為57位的組氨酸突變?yōu)槔野彼幔?03位的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼峄蚪z氨 酸(Ikenaka et al. 1998a)。Kaneka公司還發(fā)現(xiàn)236位的纈氨酸突變?yōu)楸彼岷?，熱穩(wěn)定 性可提高10°C (Ikenaka et al. 1998b)。進一步對上述3個位點進行定點突變發(fā)現(xiàn)57位 的組氨酸變?yōu)榱涟彼幔?03位的脯氨酸突變?yōu)樘於０?，谷氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，組氨酸 或蘇氨酸；236位的纈氨酸突變?yōu)樘K氨酸或絲氨酸后，酶的熱穩(wěn)定性均可提高。三突變酶 455M(H57Y、P203E、V236A)的熱穩(wěn)定性比野生型酶提高了 19°C (Ikenaka et al. 1999)。本實驗室從國內(nèi)D-HPG工業(yè)轉(zhuǎn)化菌株皮氏羅雷斯頓菌CGMCC1596(簡稱皮氏菌) 中克隆并在E. coli中表達了 DCase和DHase，通過易錯PCR及DNA改組的方法獲得了可 溶性表達提高數(shù)倍的突變體 DCase-M3(A18TA30N/K34E) (Jiang，S，Li 等，“Directed evolution and structural analysis of N-carbamoyl-D-amino acidamidohydroIase provide insights into recombinant protein solubility in Escherichiacoli.“，Biochem J 402 :似9_37，2007)，這為固定化酶工藝制備D-HPG的工業(yè)化的實現(xiàn)進一步提供 了幫助。在DCase可溶性表達得到提高的基礎(chǔ)上，通過易錯PCR，輔以高通量篩選體系獲得 的突變體F7 0il2L)的熱穩(wěn)定性提高了 7°C左右，而比活力、酶動力學(xué)及高可溶性表達特點 保持不變，使得固定化酶制備D-HPG具有更好的產(chǎn)業(yè)化前景(Hong YU等，"Improving the thermostability of N-carbamyl-D-amino acidamidohydrolase by error-prone PCR", App1. Microbiol. Biotechnol. D0I10. 1007/s00253-008-1748-z, 2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過隨機突變、DNA改組、半理性設(shè)計等酶分子工程方法對皮氏羅雷斯頓菌 CGMCC1596來源的DCase進行改造，獲得了穩(wěn)定性進一步提高的突變體，為固定化酶法制備 D-HPG的產(chǎn)業(yè)化提供更有利支持。具體地說，本發(fā)明提供了一種D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，其中的突變 包括D-氨甲酰水解酶第262位和第248位上的氨基酸取代，所述突變體具有D-氨甲酰水 解酶活性，其熱穩(wěn)定性高于取代前。本文中，若非另外說明，所有的突變的定位都是基于與 皮氏羅雷斯頓菌CGMCC 1596來源的DCase-M3序列(SEQ ID NO :26)的最大同源性比對 (alignment)，DCase-M3的核酸編碼序列如SEQ ID N0:25所示。實施方式之一中，本發(fā)明 的D-氨甲酰水解酶突變體具有含突變的SEQ ID NO J6所示氨基酸序列，所述突變包括第 262位和第248位上的突變。突變方式之一是氨基酸取代，例如，第262位氨基酸可以是丙 氨酸或其保守性取代，第248位可以是谷氨酰胺或其保守性取代。本發(fā)明的突變體還可以含有其它突變。例如，實施方式之一，本發(fā)明的突變體還含 有第沈3位、第23位和第12位上的氨基酸取代，例如第沈3位可以是絲氨酸或其保守性取 代、第23位可以是亮氨酸或其保守性取代，第12位可以是亮氨酸或其保守性取代。更進一步，本發(fā)明的突變體還可以含有以下位點的突變第31位、第207位、第 242位、第271位、第273位，或它們的組合。例如，所述組合可以是第31位和第207位， 第271位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。所 述突變方式之一是氨基酸取代，例如，第31位可以是亮氨酸或其保守性取代，第207位可以 是谷氨酸或其保守性取代，第242位可以是甘氨酸或其保守性取代，第271位可以是異亮氨 酸、亮氨酸或它們的保守性取代，第273位可以是賴氨酸、精氨酸、脯氨酸或它們的保守性 取代。本發(fā)明所述D-氨甲酰水解酶及其突變體不限于特定的物種來源，可以源自例如 羅雷其J 頓菌(Ralstonia sp.)、根瘤菌(Ensifer sp. )、土壤桿菌(Agrobacterium sp.)、 假單胞菌O^eudomonas sp.)等。例如，本發(fā)明的突變體可以是源于皮氏羅雷斯頓菌 CGMCC1596、土壤桿菌 KNK712、放射土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) NRRLBl 1291 或 土壤桿菌IP 1-671的D-氨甲酰水解酶的突變體。實施方式之一中，所述突變體源自皮氏羅 雷斯頓菌CGMCC1596 D-氨甲酰水解酶的突變體M3 (DCase_M3)，DCase_M3與來源于皮氏羅 雷斯頓菌 CGMCC1596、土壤桿菌 KNK712、放射土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) NRRL B11291或土壤桿菌IP 1-671的D-氨甲酰水解酶相比，同源性分別高達約99. 0%,99. 0%, 96. 3%或 92. 8%。作為舉例，本發(fā)明的突變體可具有選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或M所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種核酸分子，其編碼本發(fā)明的D-氨甲酰水解酶突變體，或 與所述編碼序列互補。例如，本發(fā)明的核酸分子或其互補序列的核苷酸序列可以選自SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 或 23。本發(fā)明還提供一種載體，其含有本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞， 其含有本發(fā)明核酸分子。實施方式之一中，所述宿主細(xì)胞是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和本發(fā)明的 D-氨甲酰水解酶突變體水解混旋型對羥基苯海因。


圖1 不同溫度處理對初始酶M3和突變酶穩(wěn)定性影響。在不同溫度下處理15min 殘余酶活分析，殘余酶活以最適反應(yīng)溫度下酶活的百分比計算表示。圖2.不同溫度處理對出發(fā)酶E6和突變酶穩(wěn)定性影響。在不同溫度下處理15min 殘余酶活分析，殘余酶活以最適反應(yīng)溫度下酶活的百分比計算表示。圖3.不同溫度處理對出發(fā)酶B5和突變酶穩(wěn)定性影響。在不同溫度下處理15min 殘余酶活分析，殘余酶活以最適反應(yīng)溫度下酶活的百分比計算表示。圖4.不同溫度處理對出發(fā)酶B5和突變酶穩(wěn)定性影響。在不同溫度下處理15min 殘余酶活分析，殘余酶活以最適反應(yīng)溫度下酶活的百分比計算表示。圖5.不同溫度處理對出發(fā)酶B5、C18和突變酶穩(wěn)定性影響。在不同溫度下處理 15min殘余酶活分析，殘余酶活以最適反應(yīng)溫度下酶活的百分比計算表示。
具體實施例方式本發(fā)明通過DNA改組方法(DNA shuffling)對隨機突變后篩得的突變位點隨機組 合，通過高效篩選方法篩得熱穩(wěn)定性(以表觀半殘余酶活時處理溫度Tm表征)比突變前的 初始酶提高至少8°C的一組合突變。所述組合突變發(fā)生在第262位和第248位氨基酸殘基。 這些突變體的比酶活和可溶性與DCase-M3相比基本相同。由此可知，至少該兩位點上的聯(lián) 合突變可顯著提高DCase酶的穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，就氨基酸序列或核苷酸序列而言，所述突變包括氨基酸或 堿基的插入、取代、缺失或它們的組合。本發(fā)明實施方式之一中，DCase突變體氨基酸序列中 的突變?yōu)榘被崛〈?，即某一位點的氨基酸被改變?yōu)榕c野生型或模板中相應(yīng)位點上原有氨 基酸不同的氨基酸(本文中稱為“取代氨基酸”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過簡單的試驗和篩選， 很容易確定合適的取代氨基酸。作為實施方式之一，取代氨基酸可選自一系列互為保守性 取代的氨基酸。所為保守性取代即氨基酸之間的相互置換不至于影響所得蛋白質(zhì)的活性。 例如，就本發(fā)明而言，當(dāng)突變位點上的某一取代氨基酸被保守性取代時，所得新的保守性取 代突變體保留原突變體的酶活性、可溶性和熱穩(wěn)定性等特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員借助現(xiàn)有技 術(shù)手段，通過簡單的試驗和篩選，很容易確定這樣的保守性取代。例如，保守性氨基酸取代 可以考慮符合以下分組的類似氨基酸一.中性氨基酸脂肪族氨基酸甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，纈氨酸(V)，亮氨酸(L)，異亮氨酸(I)；
芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；含羥基氨基酸絲氨酸( ，蘇氨酸(T)；含硫氨基酸半胱氨酸(C)，胱氨酸，甲硫氨酸(M)；亞氨基酸脯氨酸(P)，羥脯氨酸；二 .酸性氨基酸天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)，及其酰胺(中性)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；三.堿性氨基酸精氨酸( ，賴氨酸(K)，組氨酸(H)。進一步分析各來源DCase上與穩(wěn)定性相關(guān)的位點，并通過DNA改組方法對這些位 點再組合、再篩選，本發(fā)明獲得了 Tm比初始酶提高更多，例如提高10°C以上的組合突變，即 第沈2、對8、沈3、23和12位063Λ62Λ48/23/υ)氨基酸殘基聯(lián)合發(fā)生突變。作為實施方 式之一，所述突變?yōu)榘被崛〈＿@些突變體的比酶活和可溶性與DCase-M3相比基本相 同。由此可知，某些位點例如上述位點的組合突變對于提高DCase酶穩(wěn)定性尤其熱穩(wěn)定性 而言可產(chǎn)生疊加、甚至協(xié)同效應(yīng)。然后，本發(fā)明通過醇結(jié)構(gòu)共義性方法(structure guided consensus concept) M 不同來源DCase氨基酸序列進行比對和DCase結(jié)構(gòu)特點分析，通過半理性設(shè)計，獲得了 Tm 進一步提高的組合突變，并發(fā)現(xiàn)以下位點與DCase的穩(wěn)定性尤其熱穩(wěn)定性顯著相關(guān)第31 位，第207位，第242位，第271位和第273位。并且，本發(fā)明還進一步發(fā)現(xiàn)，這些位點的組合 能夠進一步提高DCase酶的穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定性，這樣的組合包括第31位和第207位 (31/207)，第 271 位和第 273 位(271/273)，第 242 位和第 207 位(242/207)，第 31 位和第 242 位(31/ 或第242位和第273位042/273)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，點突變的疊加亦即新的聯(lián)合 突變對于提高DCase酶穩(wěn)定性尤其熱穩(wěn)定性而言可產(chǎn)生疊加、甚至協(xié)同效應(yīng)。所述新的聯(lián) 合突變包括:263/262/248/23/12/31,263/262/248/23/12/207,263/262/248/23/12/242, 263/262/248/23/12/271,263/262/248/23/12/273,263/262/248/23/12/31/207, 263/262/248/23/12/271/273,263/262/248/23/12/242/207,263/262/248/23/12/31/242 或^3Λ62/Μ8/23/12Λ42/273。這些組合突變能進一步提高酶的穩(wěn)定性，例如將Tm提高 約11_14°C或更多，甚至提高約17°C或更多。作為實施方式之一，所述突變?yōu)榘被崛〈?這些突變體的比酶活和可溶性與DCase-M3相比基本相同?；诒旧暾埞_的序列信息，本發(fā)明的酶突變體可以用化學(xué)合成或基因重組等方 法來生產(chǎn)，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。例如，在采用重組法進行生產(chǎn)的實施方式 中，可將本發(fā)明突變體的編碼核酸克隆到合適的載體中，用所述載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿 主細(xì)胞，在適宜的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)表達，然后用合適的已知方法由宿主細(xì)胞裂 解物或培養(yǎng)液分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物。為此，本申請內(nèi)容之一是提供編碼本發(fā)明突變體的核酸分子。所述核酸分子可以 是單鏈或雙鏈DNA或RNA。本發(fā)明還包括編碼鏈的互補鏈。此外，就編碼同一突變體的核酸 分子而言，可以包括多種基于簡并密碼子的變體。這些變體可能提供例如優(yōu)化表達等有利 特性。本發(fā)明的另一項內(nèi)容是包含本發(fā)明核酸分子的載體。所述載體可以是質(zhì)粒、粘粒、 噬菌體等基因工程常用載體。本發(fā)明實施方式之一中，所述載體是表達載體。載體可以以游 離形式穩(wěn)定存在于宿主中并自主表達，也可以整合到宿主的基因組內(nèi)穩(wěn)定遺傳并表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠根據(jù)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化目的(例如是擴增、重組還是表達)自主選擇合適 的宿主和相宜的載體。本發(fā)明的另一項內(nèi)容是包含本發(fā)明核酸分子的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞或真核細(xì) 胞，例如細(xì)菌(如大腸桿菌)或真菌(如酵母細(xì)胞)等。根據(jù)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化目的(例如是擴 增、重組還是表達)、回收、純化等多種因素，選擇合適的宿主細(xì)胞屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常 規(guī)技能。本發(fā)明的酶突變體可以用各種已知的蛋白質(zhì)分離和純化方法來回收，例如但不 限于滲透壓裂解、超聲裂解、離心、鹽析、和各種層析技術(shù)，例如分子篩層析、高效液相層析 (HPLC)、親和力層析、離子交換層析等等。本發(fā)明D-氨甲酰水解酶突變體提供了熱穩(wěn)定性，比活力、酶動力學(xué)及高可溶性表 達特點保持不變，與其適合用于通過固定化酶法制備D-HPG，從而提供顯著的技術(shù)進步。以下，通過實施例進一步說明本發(fā)明的各項特點和優(yōu)點。需要說明是，以下實施例 僅以闡釋本發(fā)明為目的，不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的任何限定。實施例一 DCase-E6突變體的獲得皮氏羅雷斯頓菌CGMCC1596來源突變酶DCase-M3(A18TA30N/K34E)的可溶性 表達水平顯著提高，在其基礎(chǔ)上又得到7個與穩(wěn)定性相關(guān)的突變位點及相應(yīng)的突變體 F7(Q12L)、C8(E22G/T262A)、F8(A36V)、B3(A36E)、C6 (A164T)、A8 (T263S)、E2 (H248Q)(Hong YU 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. D0I10. 1007/s00253-008-1748_z，2009 和中國專利申 請 200810035067. 3)。本發(fā)明以它們?yōu)槟０暹M行 DNA 改組(DNA shuffling) (Crameri et al.，1998 ；Ness et al.，2002 ；Stemmer，1994)，通過熱穩(wěn)定性篩選獲得高穩(wěn)定性突變體。具體地說，合成以下引物對pet_DC_M3_U GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA(SEQ ID NO :27)pet_DC_M3_D TATGACACGTCAGATGATACTTGC (SEQ ID NO :28)用上述引物對擴增DCase突變體F7、C8、F8、B3、C6、A8、E2的基因。膠回收 后用DNaseI酶切，跑2 %瓊脂糖凝膠，回收50-100bp的DNA片段。先無引物PCR擴增 (94 V，30S ；55 °C, 30S ；72 °C, Imin ；30個循環(huán))，再用上述引物PCR擴增目的片段(94°C， 30S ;55°C，30S72°C，Imin ;15個循環(huán))。膠回收目的基因大小(915bp)的片段。通過 MegaprimerPCR(94°C, 30S ；55°C，30S ；68°C,7min ； 18 個循環(huán))克隆至表達載體 pET28b (+) (購自N0VAGEN)。電轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (E3)(購自N0VAGEN)中，涂平板，建立突變庫。選取突變體庫中的轉(zhuǎn)化子接種到含200μ 1 LB培養(yǎng)基的96孔深孔培養(yǎng)板中，含 100 μ g/ml卡那霉素，37°C培養(yǎng)過夜，加入IPTG，使IPTG的終濃度為0. 8mM，繼續(xù)37°C培養(yǎng) 4小時后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞板取出。將96孔細(xì)胞板置于-70°C冷凍lh，55°C熱激 5min, 68°C熱處理15min，然后轉(zhuǎn)移到96孔板顯色。取4 μ 1經(jīng)過以上高溫失活處理所得菌液 或粗酶液加入到96孔顯色反應(yīng)液中(5g/L的NC-D-HPG，ImM乙二胺四乙酸(EDTA)，0. 01% 酚紅，PH 5.8-6.0。)并置于37°C觀察顏色變化，將顏色變化的突變子從對應(yīng)的母板上檢 出。挑取突變體單菌落接種到4毫升試管LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 6的時 候，進行IPTG誘導(dǎo)(終濃度0. 8mM)。繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，SOOOrpm離心，收集菌體，菌體重 懸于Iml的0. 1M，ρΗ8· 0磷酸鈉緩沖液中，超聲波破碎(25X6秒)12000rpm離心30分鐘。取上清做為穩(wěn)定性分析的粗酶液。酶熱穩(wěn)定性的評價將以上所得粗酶液在不同的溫度(50-82°C )保溫15分鐘后在50°C測定其剩余酶 活。剩余酶活與初始酶活的比率為評價酶熱穩(wěn)定性的依據(jù)。酶活測定 1 %底物NC-D-HPG溶解到pH8. 00. IM磷酸鈉緩沖液。50 μ 1酶液與400 μ 1 底物溶液混勻，50°C，120rpm轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)20分鐘，加入等體積的10 %鹽酸終 止酶促反應(yīng)。反應(yīng)液稀釋10倍，12000rpm離心30分鐘，取上清進行高效液相色 譜(HPLC，Agilent Technologies 1100)分析，測定反應(yīng)液中產(chǎn)物D-HPG的含量。IU 酶活定義為每分鐘產(chǎn)生lymol D-HPG所需的酶量。其中，HPLC測定條件為使用 Z0RBAXEclipseXDB-C8(4. 6X150mm)柱子。以水甲醇1. % 乙酸=85 12 3 為流 動相，流速為1. Oml/min，監(jiān)測器波長設(shè)為230nm。由此篩得一 DCase突變體，其Tm(表觀半殘余酶活時處理溫度)比初始酶 (DCase-M3)提高 8°C，比 DNA Shuff ling 模版中穩(wěn)定性較好的 F7 0)12L) RkS (T263S)的 Tm 分別提高2°C和4°C (見圖1)。與初始酶相比，該突變體的比酶活及可溶性基本相同。經(jīng)測 序，該突變體的氨基酸序列及其編碼序列分別如SEQ ID NO 2和SEQ IDNO 1所示，將其標(biāo) 識為 DCase-E6 (T262A/H248Q)。實施例二 DCaSe-B5突變體的獲得以實施例一所得DCase-E6的編碼序列(SEQ ID NO 1)為模板通過定點誘變制造 以下突變Q23L、V40A、H58Y、G75S、C243A、C279A、A302C、A222C、M220L、M184L、M239L、M244L、 M5L、M73L、N173A、P295C、F304C、Q12L、E22G、A36V、A164T 或 T263S。然后，以所得各突變體的編碼序列為模板，按照實施例一所述方法進行DNA改組 和篩選。所不同的是，在轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達后的高溫失活處理為-70°C冷凍lh、55°C熱激 5min、70°C熱處理15min。由此，篩得另一 DCase突變體，比初始酶(DCase_M3)提高10°C， 比出發(fā)酶DCase-E6提高2°C (見圖2)。與初始酶相比，該突變體的比酶活及可溶性基本相 同。經(jīng)測序，該突變體的氨基酸序列及其編碼序列分別如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :3所 示，將其標(biāo)識為 DCase-B5(T263S/T262A/H248Q/Q23L/Q12L)。實施例三基于酶結(jié)構(gòu)共義性方法(structure guided consensus concept)的 DCase-突變體半理性設(shè)計以羅雷斯頓菌CGMCC1596的DCase氨基酸序列為調(diào)查模版通過PDB數(shù)據(jù)庫進行蛋 白序列比對(P-Blast)，各種來源的DCase序列同源性為34-99%。將氨基酸同源排比結(jié) 果倒入數(shù)據(jù)庫(http://coot. embl. de/Alignment/consensus. html)進行氨基酸共義性分 析。設(shè)定共義數(shù)值70%，并根據(jù)調(diào)查結(jié)果及共義排比表確定DCase上各個位置氨基酸的共 義性，確定氨基酸共義位點。以實施例二所得突變體DCase-B5為模板，在相應(yīng)位點制造定 點突變或半飽和突變(即采用兼并引物引入共義類氨基酸中任何一種構(gòu)建成某位點的一 小突變庫)，構(gòu)建突變庫。表1.定點突變位點及引物
權(quán)利要求
1.一種D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所含突變包括D-氨甲酰水解酶的第262 位和第248位上的氨基酸被取代，且所述突變體具有D-氨甲酰水解酶活性，其熱穩(wěn)定性高 于取代前。
2.如權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，第262位氨基酸是丙氨酸或其保守性取 代，第248位是谷氨酰胺或其保守性取代。
3.如權(quán)利要求1或2所述的突變體，其特征在于，還含有第263位、第23位和第12位 上的氨基酸取代。
4.如權(quán)利要求3所述的突變體，其特征在于，第263位是絲氨酸或其保守性取代、第23 位是亮氨酸或其保守性取代，第12位是亮氨酸或其保守性取代。
5.如權(quán)利要求3所述的突變體，其特征在于，還含有以下位點的取代第31位、第207 位、第242位、第271位、第273位，或它們的組合。
6.如權(quán)利要求5所述的突變體，其特征在于，所述組合是第31位和第207位，第271 位和第273位，第242位和第207位，第31位和第242位，第242位和第273位。
7.如權(quán)利要求5或6所述的突變體，其特征在于，第31位是亮氨酸或其保守性取代第 207位是谷氨酸或其保守性取代，第242位是甘氨酸或其保守性取代，第271位是異亮氨酸、 亮氨酸或它們的保守性取代，第273位是賴氨酸、精氨酸、脯氨酸或它們的保守性取代。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的突變體，其特征在于，它是源于皮氏羅雷斯頓菌 CGMCC1596、土壤桿菌KNK712、放射土壤桿菌NRRL Bl 1291或土壤桿菌IPI-671的D-氨甲酰 水解酶的突變體。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的突變體，其氨基酸序列如SEQID N0:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22 或 24 所示。
10.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-9中任一項所述的D-氨甲酰水解酶突變體，或與 編碼權(quán)利要求1-9中任一項所述的D-氨甲酰水解酶突變體的核酸分子互補。
11.如權(quán)利要求10所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、 15、17、19、21 或 23 所示，或者是 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 或 23 所示序 列的互補序列。
12.—種載體，含有權(quán)利要求10或11所述的核酸分子。
13.一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求10或11所述的核酸分子。
14.一種生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括用D-海因酶和權(quán)利要求1-9中任一項所 述的D-氨甲酰水解酶突變體水解混旋型對羥基苯海因。
全文摘要
本發(fā)明涉及高穩(wěn)定性尤其是熱穩(wěn)定性提高的D-氨甲酰水解酶突變體及其應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK102146365SQ20101010680
公開日2011年8月10日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 張大龍, 楊晟, 楊蘊劉, 范文超, 陶榮盛 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心