專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量t-dna轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體，本發(fā)明還公開(kāi)了該毒性輔助載體的構(gòu)建方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一個(gè)借助農(nóng)桿菌將外源基因?qū)胫参锘蚪M的自然過(guò)程。在根癌農(nóng)桿菌中，存在一個(gè)大小約為150-M0 1Λ的大型質(zhì)粒，即Ti質(zhì)粒。在Ti 質(zhì)粒上存在兩個(gè)重要的區(qū)域T-DNA區(qū)和毒性區(qū)(virulence region，Vir區(qū))。當(dāng)農(nóng)桿菌受植物傷口分泌的乙酰丁香酮等酚類物質(zhì)誘導(dǎo)下，位于農(nóng)桿菌細(xì)胞膜上VirA蛋白被自體磷酸化和被激活，隨后將其磷酸基團(tuán)傳遞給具有轉(zhuǎn)錄因子功能的VirG蛋白，并由VirG蛋白特異結(jié)合Vir區(qū)基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)所有Vir區(qū)基因的表達(dá)。其中，表達(dá)的VirD2蛋白在VirCl和VirDl等蛋白的協(xié)助下，對(duì)T-DNA右邊界(RB)下鏈的5，端進(jìn)行切割，并共價(jià)結(jié)合，構(gòu)成ssT-DNA/VirD2復(fù)合物，ssT-DNA復(fù)合物迅速被VirE2蛋白包裹，以確保ssT_DNA 進(jìn)入植物后不被核酸酶降解。野生型農(nóng)桿菌中由VirG蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的VirE2蛋白數(shù)量有限，約有1000個(gè)分子， 通常只能使231Λ左右的T-DNA得到有效保護(hù)。當(dāng)T-DNA分子量大于25 1Λ時(shí)，由于農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有足量的VirE2蛋白，ssT-DNA/VirD2復(fù)合物得不到完全包裹，致使轉(zhuǎn)化大片段T-DNA時(shí)出現(xiàn)丟失、斷裂，而大分子量T-DNA不能完整的整合進(jìn)植物基因組中。為了使大分子量T-DNA能夠完整的整合進(jìn)植物基因組中，需要在農(nóng)桿菌中超表達(dá)VirE2蛋白。由于 VirE2蛋白不穩(wěn)定，必須有VirEl分子伴侶來(lái)維持其結(jié)構(gòu)。本發(fā)明將ftx)moter-VirEl-VirE2 片段與VirG-terminator拼接，構(gòu)成virE-virG嵌合操縱子，并構(gòu)建不含T-DNA區(qū)的、輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的載體。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了解決大分子量T-DNA完整整合進(jìn)植物基因組的問(wèn)題，提供農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體，該載體能夠介導(dǎo)分子量大于25 kb的T-DNA轉(zhuǎn)化；提供農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體的制備方法，利用本方法構(gòu)建毒性輔助載體方法簡(jiǎn)單。本發(fā)明目的之一在于提供上述制備方法獲得的毒性輔助載體，所述毒性輔助載體包括virE-virG嵌合操縱子，所述virE-virG嵌合操縱子核苷酸序列如SEQ ID NO 16所

優(yōu)選為，所述毒性輔助載體還包括oriV農(nóng)桿菌復(fù)制子和spec基因，所述oriV農(nóng)桿菌復(fù)制子核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示，所述spec基因核苷酸序列如SEQ ID NO 18 所示。更優(yōu)選為，所述毒性輔助載體核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。
本發(fā)明目的之二在于提供農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體的制備方法，為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
毒性輔助載體的制備方法，具體包括以下步驟
a.制備重組雙元表達(dá)載體；
al.制備Pnos::nptII片段并酶切，將Pnos: :nptll酶切片段插入pCAMBIA1302載體多克隆酶切位點(diǎn)處，得PVCT2020載體；
a2.酶切pEGFP-Nl載體，制備eGFP基因，將eGFP基因插入pET-32a(+)載體多克隆酶切位點(diǎn)，得PVCT2190載體；
a3.酶切所得pVCT2190載體，制備所述eGFP基因的片段，將酶切所得eGFP基因插入所得pVCT2020載體酶切位點(diǎn)處，得pVCT2210載體；
a4.酶切所得PVCT2210載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，將回收的片段連接，得 PVCT2212 載體；
a5.酶切所得PVCT2212載體，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含eGFP基因片段，將酶切所得eGFP基因插入pHells gate8載體酶切位點(diǎn)處，得重組雙元表達(dá)載體，命名為pVCT2268 載體；
b.制備含virE-virG嵌合操縱子的基本載體；
bl.制備 Promoter-VirEl-VirE2 基因，將所得 Promoter-VirEl_VirE2 基因連接 P^asj-Blant 載體，得 pVCT1213 載體；
b2.制備 VirG-terminator 基因，將所得 VirG-terminator 片段插入 pVCT1213 載體，得含virE-virG嵌合操縱子的基本載體，命名為pVCT1244載體；
c.制備毒性輔助載體；
cl.酶切所得PVCT1244載體，制備virE-virG嵌合操縱子，將所得virE-virG嵌合操縱子插入所得PVCT2268載體，得重組載體，命名為pVCT2270載體；
c2.酶切所得pVCT2270載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收含所述virE-virG嵌合操縱子片段、農(nóng)桿菌復(fù)制子oriV和所述抗性標(biāo)記基因片段，將回收pVCT2270載體的酶切片段再連接，得所述毒性輔助載體，命名為PVCT2272載體。優(yōu)選為，步驟al所述Pnos: :nptll片段的制備，具體包括如下步驟
以SEQ ID NO :1所示序列為上游引物，以SEQ ID NO :2所示序列為下游引物，以pBIN19 載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性20秒，50°C退火 20秒，72°C延伸2分鐘10秒，3個(gè)循環(huán)，60°C退火20秒，72°C延伸2分鐘10秒，27個(gè)循環(huán)， 72°C延伸10分鐘，得Pnos::nptII片段。優(yōu)選為，步驟bl所述ft~0m0ter-VirEl-VirE2基因的制備，具體步驟如下 以所述農(nóng)桿菌C58的pTiC58質(zhì)粒DNA為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID
NO :3所示，下游上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :4所示，采用I^rin^tar HS DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得VirE2基因片段，所述PCR擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性1分鐘， 98°C變性10秒，56 °C退火15秒，72 °C延伸2分鐘30秒，觀個(gè)循環(huán)，72 °C延伸10分鐘，得 Promoter-VirEl-VirE2 _@。優(yōu)選為，步驟1^2所述VirG-terminator基因的制備，具體步驟如下
以所述農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌C58的pTiC58載體為模板，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得VirG基因片段，所述PCR擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性1分鐘，98°C變性10秒，56°C退火 15秒，72°C延伸1分鐘，沘個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，得VirG-terminator基因。優(yōu)選為，步驟Cl所述virE-virG嵌合操縱子的制備，具體步驟如下
同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Spe I.Xba I和Emall05 I酶切所得pVCT1244載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收3465bp大小的片段，得virE-virG嵌合操縱子。本發(fā)明目的三在于提供毒性輔助載體在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。優(yōu)選為，用含有所述毒性輔助載體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)pBiBAC-CBF載體轉(zhuǎn)化煙草。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將Promoter-VirEl-VirEZ-VirG-iTerminator構(gòu)建到表達(dá)載體上，當(dāng)農(nóng)桿菌中被激活的VirG蛋白作用于該vir操縱子時(shí)，VirG蛋白將得到過(guò)量表達(dá)，而過(guò)量表達(dá)VirG蛋白將促進(jìn)VirE2蛋白的過(guò)量表達(dá)，滿足大分子量T-DNA包裝需求，促進(jìn)大分子量T-DNA對(duì)植物的遺傳轉(zhuǎn)化。VirEl蛋白是VirE2蛋白的分子伴侶，能維持VirE2蛋白處于可溶狀態(tài)，防止過(guò)量表達(dá)的VirE2蛋白形成包涵體。構(gòu)成的毒性輔助載體不含T-DNA區(qū)，防止農(nóng)桿菌中雙元表達(dá)載體在發(fā)生同源重組。同時(shí)構(gòu)建的毒性輔助載體農(nóng)桿菌復(fù)制子為oriV復(fù)制子，與pVSl復(fù)制子在桿菌中能夠兼容，實(shí)現(xiàn)大分子量T-DNA完整整合進(jìn)植物基因組中。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對(duì)下文的考察研究對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標(biāo)和其它優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)下面的說(shuō)明書(shū)，權(quán)利要求書(shū)，以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。壯觀霉素基因，簡(jiǎn)稱為spec，具有抗壯觀霉素(spe)的活性。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為本發(fā)明PVCT2020載體圖； 圖2為本發(fā)明PVCT2190載體圖； 圖3為本發(fā)明pVCT2210載體圖； 圖4為本發(fā)明pVCT2212載體圖； 圖5為本發(fā)明pVCT2268載體圖； 圖6為本發(fā)明pVCT1213載體圖； 圖7為本發(fā)明pVCT1244載體圖； 圖8為本發(fā)明pVCT2270載體圖； 圖9為本發(fā)明pVCT2272載體圖； 圖10為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草圖11為卡那霉素抗性煙草的AtCBFl基因PCR鑒定電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述；應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 和 Ε· Z. N. A. Gel Exteaction Kit 試劑盒購(gòu)自 Omega (USA)公司；PfuDNA 聚合酶、小牛小腸磷酸酶 CIAP、Wide Range DNAmarker, Lambda DNA / Hind III +EcoR I Marker, DL2000 Marker 購(gòu)自上海生工生物有限公司 (China) ；Taq DNA polymerase、PrimeStar HS DNA polymerase、dNTP、限制性內(nèi)切醇、 pfe紗-Blant載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司、T4 DNA Iigase購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司(Japan) ；pET-32a(+)載體購(gòu)自Novagen公司；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、 利福平(Rifampicin, Rif)、鏈霄素(Streptomycin, Str)、壯觀霄素(spectinomycin, Spe) 等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；PCAMBIA1302載體、pCAMBIA2300載體、BiBAC2載體和 pEGFP-m載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物的合成及DNA測(cè)序由上海生工生物有限公司完成。實(shí)施例1
重組雙元表達(dá)載體的構(gòu)建 al. pVCT2020載體的構(gòu)建
根據(jù)PBIN19載體序列(GenBank accession No :U09365)設(shè)計(jì)引物，上游引物如SEQ ID NO :1 所示，序列為5‘-cggaattcagggagtcacgttatgac-3‘(劃線處為 EcoR I 位點(diǎn))，下游引物如 SEQ ID NO 2 所示，序列為5’ —cgctcgagtcccgctcagaagaac—3，(劃線處為 Β ο I 位點(diǎn))。以pBIN19載體為模板，PfuDNA聚合酶、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性3 分鐘，94 V變性20秒，50 V退火20秒，72 °C延伸2分鐘10秒，3個(gè)循環(huán)，60 V退火20秒，72 °C 延伸2分鐘10秒，27個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定回收1116 bp片段，所得片段含有胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子Pnos和卡那霉素編碼區(qū)nptll，命名為Pnos: :nptll。 用EcoR I和Β ο I酶切Pnos::nptII片段，回收1107 bp的Pnos: :nptll片段；同時(shí)用相同的酶消化載體 pCAMBIA1302(GenBank accession AF234298)，回收 8425 bp 片段，將兩個(gè)回收片段用在T4連接酶作用下16°C過(guò)夜連接，得9532 bp的pVCT2020載體，如附圖1所不。a2. PVCT2190 載體的構(gòu)建。用EcoR I和Not I酶切pET_32a(+)載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收5874 bp片段的ρΕΤ-3^ι(+)載體骨架；同時(shí)用相同酶切pEGFP-Nl載體(GenBank accession No. U55762)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收772 bp的綠熒光蛋白突變系(命名為eGFP基因)編碼區(qū)；將回收的pET-32a(+)載體骨架與eGFP基因用T4 DNA連接酶于16°C過(guò)夜連接，得pVCT2190載體，如附圖2所示。a3. pVCT2210 載體構(gòu)建
用Β ο I酶切載體所得pVCT2190載體，Klenow Fragment酶補(bǔ)平后，再用Bgl II酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收含eGFP基因的833 bp片段；同時(shí)用PmaC I和)(ba I酶切pVCT2020載體，回收8788 bp的pVCT2020載體大骨架；將回收的eGFP基因與pVCT2020 載體大骨架用jM DNA連接酶于16 °C過(guò)夜連接，得pVCT2210載體，如附圖3所示。a4. pVCT2212 載體構(gòu)建
用Nco I酶切所得pVCT2210載體，電泳回收1679 bp和7838 bp大小的片段；將回收的兩個(gè)片段用T4 DNA連接酶于16°C連接，得pVCT2212載體，如附圖4所示。所得pVCT2212 載體含有由胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子Pnos、卡那霉素編碼區(qū)nptll和CaMV 35S基因終止子PA序列構(gòu)成的表達(dá)盒，命名為Pnos: :nptll: :pA ；由35S啟動(dòng)子、eGFP基因和胭脂堿合成酶基因終止子iTnos序列構(gòu)成的表達(dá)盒，命名為35S: :eGFP: Jnos基因。a5. pVCT2268 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Sph I單酶切pHells gateS載體，用洲的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含有農(nóng)桿菌復(fù)制子oriV的9370bp的大片段；同時(shí)用SphI酶切所得pVCT2212載體，用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含eGFP的1915bp的大片段，連接回收的1915bp片段和9370bp 的片段，在T4連接酶作用下16°C過(guò)夜連接，得重組雙元表達(dá)載體，命名為pVCT2268載體，如附圖5所示。本實(shí)施例以pHells gateS載體為例，經(jīng)過(guò)酶切連接得重組雙元表達(dá)載體。該重組雙元表達(dá)載體載體農(nóng)桿菌復(fù)制子為oriV復(fù)制子，與常用的雙元表達(dá)載體pCAMBIA系列所采用的PVSl農(nóng)桿菌復(fù)制子不同，含有這兩種復(fù)制子得載體在農(nóng)桿菌中可以兼容，因此還可以為其他雙元表達(dá)載體，選擇復(fù)制子的原則為重組雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌復(fù)制子與攜帶靶基因的雙元表達(dá)載體的復(fù)制子能夠兼容為宜。實(shí)施例2
含virE-virG嵌合操縱子的基本載體的構(gòu)建 bl.pVCT1213載體的構(gòu)建
根據(jù)報(bào)道的農(nóng)桿菌菌株C58的pTiC58載體序列(GenBank accession NC_003308),設(shè)計(jì)含啟動(dòng)子I^romoter，VirEl基因編碼區(qū)和VirE2基因編碼區(qū)(簡(jiǎn)稱為 Promoter-VirEl-VirE2)的PCR特異引物，其中上游引物如SEQ ID NO 3所示，序列為 5，-gaattacattcacacggcacc-3，，下游弓I 物如 SEQ ID NO 4 所示，序列為 5，-tcacacgtg gtggtggtggtggtgcagactgtttacggttgg-3，。以農(nóng)桿菌菌株 C58 的 pTiC58 載體為模板，利用PrimeStar HS DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性1分鐘，98°C 變性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸2分鐘30秒，觀個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定回收MSlbp目的片段，得ft~0m0ter-VirEl-VirE2片段。所得 Promoter-VirEl-VirE2片段，由啟動(dòng)子Promoter,VirEl基因編碼區(qū)和VirE2基因編碼區(qū)依次串聯(lián)構(gòu)成。如附圖2所示，將所得ft~0m0ter-VirEl-VirE2片段連接pfe^-Blant載體， Promoter-VirEl-VirE2片段與pfe紗-Blant載體按3 1比例混合后，用！"4 DNA連接酶于 16°C過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌五coli XLl-BLUE感受態(tài)細(xì)胞，篩選出Amp和Kan 抗性的陽(yáng)性克隆菌落，提取質(zhì)粒得含ftx)m0ter-VirEl-VirE2片段的pfe紗-Blant載體，命名為PVCT1213，如附圖6所示。b2. pVCT1244 載體的構(gòu)建
根據(jù)報(bào)道的農(nóng)桿菌菌株C58的pTiC58載體序列(GenBank accession :NC_003308),設(shè)計(jì)含VirG基因編碼區(qū)和VirG基因的終止子terminator (簡(jiǎn)稱VirG_terminator)的PCR 特異引物，其中上游引物如SEQ ID NO :5所示，序列為5，-ggagatctgttgagctgcaaatggctg_ 3，，下游引物如 SEQ ID NO 6 所示，序列為 5，-RctctaRataRRacccatccaatcac-3 (下劃線處為損a I酶切位點(diǎn))，以農(nóng)桿菌菌株C58的pTiC58載體為模板，利用I^rimeStar HS DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性1分鐘，98°C變性10秒，56°C退火15秒，72°C延伸1分鐘，觀個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定回收919 bp片段， 得VirG-terminator片段。所得VirG-terminator片段，由VirG基因編碼區(qū)和VirG基因的終止子terminator依次串聯(lián)構(gòu)成。用限制性內(nèi)切酶損a I酶切回收所得VirG-terminator 片段，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶NotI酶切pVCT1213載體，經(jīng)Klenow Fragment酶補(bǔ)平，然后用限制性內(nèi)切酶)(bal酶切，得pVCT1213酶切片段；將酶切的VirG-terminator片段與 PVCT1213酶切片段連接，連接反應(yīng)在T4連接酶作用下16°C過(guò)夜連接，得含KirG基因的重組載體，命名為PVCT1244，如附圖7所示。pVCT1244載體中，Not I/Xbal酶切缺口位于VirE2基因編碼區(qū)的末端，因此VirG 基因片段插入PVCT1213載體時(shí)，VirG基因的編碼區(qū)和終止子拼接在VirE2基因編碼區(qū)的末端，構(gòu)成結(jié)構(gòu)為 Promoter-VirEl-VirE2-VirG-Terminator 序列，命名為 virE-virG 嵌合操縱子。實(shí)施例3
毒性輔助載體的構(gòu)建 cl.pVCT2270載體的構(gòu)建
如附圖5所示，用限制性內(nèi)切酶Nru I單酶切所得PVCT2268載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得PVCT2268載體骨架片段；同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Spe I.Xba I,Emal 105 I三酶切載體PVCT1M4，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含virE-virG嵌合操縱子的3465bp大小的片段， 將virE-virG嵌合操縱子與pVCT2268載體骨架片段在T4連接酶作用下16°C過(guò)夜連接，得重組載體，命名為PVCT2270，如附圖8所示。c2. pVCT2272 載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Sal I單酶切pVCT2270載體，切除pVCT2270載體上T-DNA區(qū)，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳回收virE-virG嵌合操縱子的11473bp的目標(biāo)條帶，得pVCT2270載體酶切片段，將回收的PVCT2270載體酶切片段在T4連接酶作用下16°C過(guò)夜連接，得農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體，具有如SEQ IDNO :7所示核苷酸序列，命名為 PVCT2272載體，如附圖9所示。SEQ IDNO 7所示核苷酸序列，其中22-462位核苷酸序列為根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒復(fù)制子，1323-2111位核苷酸序列為壯觀霉素抗性標(biāo)記基因，3215-3977 位核苷酸序列為大腸桿菌ColEl復(fù)制子，4133-75 位核苷酸序列依次為根癌農(nóng)桿菌C58 的VirG基因的終止子、根癌農(nóng)桿菌C58的VirG基因編碼區(qū)、根癌農(nóng)桿菌C58的VirE2基因編碼區(qū)、根癌農(nóng)桿菌C58的VirEl基因編碼區(qū)和根癌農(nóng)桿菌C58的VirE操縱子的啟動(dòng)子， 2277-918位核苷酸序列為T(mén)n7轉(zhuǎn)座子，7582-11473位核苷酸序列來(lái)源于pHellsgate 8載體的序列。4133-7528 位核苷酸序列構(gòu)成了 Promoter-VirEl-VirEZ-VirG-iTerminator 結(jié)構(gòu)的virE-virG嵌合操縱子。所得毒性輔助載體含有virE-virG嵌合操縱子，農(nóng)桿菌復(fù)制子為oriV復(fù)制子，抗性標(biāo)記基因和大腸桿菌復(fù)制子ColEl、Tn7轉(zhuǎn)座子；其中virE-virG嵌合操縱子結(jié)構(gòu)為Pro moter-VirEl-VirE2-VirG-Terminator，抗性標(biāo)記基因?yàn)閴延^霉素抗性基因，抗性標(biāo)記基因也可以為其他抗性標(biāo)記基因。PVCT2272載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，當(dāng)農(nóng)桿菌中被激活的VirG蛋白作用于該virE-virG嵌合操縱子時(shí)，VirG蛋白將得到過(guò)量表達(dá)，而過(guò)量表達(dá)VirG蛋白將促進(jìn)VirE2蛋白的過(guò)量表達(dá)，滿足大分子量T-DNA包裝需求，使大分子量T-DNA完整整合進(jìn)植物基因組中。
實(shí)施例4
載體pVCT2272的應(yīng)用
采用凍融法將所得毒性輔助載體PVCT2272載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，在含有壯觀霉素50mg/L、鏈霉素100mg/L和利福平100mg/L抗性的YEB固體培養(yǎng)基上篩選， 得含有PVCT2272載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105，命名為EHA105/ pVCT2272，采用凍融法將 PCAMBIA2300 (GenBank accession no. AF234315)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 EHA105/ pVCT2272，卡那霉素50mg/L、壯觀霉素50mg/L、鏈霉素100mg/L和利福平100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上篩選，得同時(shí)含有PCAMBIA2300載體和pVCT2272載體的EHA105，命名為EHA105/ pVCT2272/ PCAMBIA2300。培養(yǎng) EHA105/ pVCT2272/ pCAMBIA2300 三代，提取所得 EHA105/ pVCT2272/ PCAMBIA2300的質(zhì)粒，得pVCT2272載體和pCAMBIA2300載體混合物，用所得載體混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue，在含卡那霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上篩選，得含pCAMBIA2300 載體的XLl-Blue，命名為XLl-Blue/ pCAMBIA2300 ；在含壯觀霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上篩選，含 PVCT2272 載體 XLl-Blue，命名為 XLl-Blue/ pVCT2272。根據(jù)如 SEQ ID NO: 7所示的PVCT2272載體設(shè)計(jì)引物，上游引物位于VirG基因的上游，序列為5’-ggagatCtgt tgagctgcaaatggctg_3，(SEQ ID NO :8)，下游引物位于大腸桿菌復(fù)制子ColEl的上游，序列為 5，-tccttctagtgtagccgtag-3，(SEQ ID NO :9)，以 XLl-Blue/ pVCT2272 菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性20秒，53 °C退火20秒，72°C延伸1分鐘30秒，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到1675 bp大小的條帶，表明該菌株中有VirG基因與ColEl復(fù)制子相連的結(jié)構(gòu)。根據(jù)pCAMBIA2300載體序列設(shè)計(jì)引物，上游引物位于35S啟動(dòng)子內(nèi)部，序列為5，-ggatagtgggattgtgcgtca-3‘ (SEQ ID NO :10)，下游引物位于位于35S終止子內(nèi)部，序列為5，-catgagcgaaaccctataggaacc_3， (SEQ ID NO 11),以含XLl-Blue/ pCAMBIA2300菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94 V變性20秒，56 V退火20秒，72 °C延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸10分鐘，電泳檢測(cè)得到預(yù)期1064 bp大小的產(chǎn)物，表明該菌株中有35S啟動(dòng)子和終止子及其控制的nptll基因。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，PVCT2272載體與pCAMBIA2300載體同時(shí)存在于根癌農(nóng)桿菌EHA105中沒(méi)有發(fā)生同源重組，在根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中具有兼容性。在擬南芥中含有冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(C-i^peat binding factor，AtCBF)，該家族中有AtCBFl、AtCBF2和AtCBF3三個(gè)成員已經(jīng)報(bào)道，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因成連鎖排列， 排列順序?yàn)镃BFl — CBF3 — CBF2。擬南芥Columbia生態(tài)型的gDNA為模板，用BamHI部分酶切，電泳回收50 -100 Kb大小的DNA片段；同時(shí)用BamHI酶切BiBAC2載體，經(jīng)小牛小腸磷酸酶CIAP脫磷后過(guò)柱純化；BiBAC2載體酶切片段與gDNA酶切片段按1 5的比例混合，經(jīng) T4 DNA連接酶于16°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue，在含50mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上篩選，得Kan抗性的重組子。根據(jù)報(bào)道的擬南芥基因組序列(GenBank accession No: CP002687. 1)，設(shè)計(jì)擬南芥冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子AtCBFl基因引物，上游引物序列為=AtCBFl F :5，-cttggatccttcgcttagtcctgtcctgg-3，(SEQ ID NO 12)，下游引物為AtCBFl R :5， -tggaaaatagaaagtaaagagtgaagtgac-3，(SEQ ID NO 13),以 Kan 抗性的重組子為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸2分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，篩選電泳檢測(cè)得到2102 bp大小的產(chǎn)物，即Kan抗性的重組子含有AtCBFl基因；根據(jù)報(bào)道的擬南芥基因組序列(GenBank accession No :CP002687. 1 )，擬南芥冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子AtCBF2基因和AtCBF3基因共同檢測(cè)引物 AtCBF2/ AtCBF3，上游引物位于AtCBF3編碼區(qū)內(nèi)，引物序列為AtCBF2/ AtCBF3 F :5，-ggtgattatattccgacgcttgcga-3‘ (SEQ ID NO 14)，下游引物位于 AtCBF2 基因下游，引物序列為:AtCBF2/ AtCBF3 R 5'- ttaatagctccataaggacacgtcatc -3' (SEQ ID N0:15)，以含有AtCBFl基因的Kan抗性的重組子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘， 95 °C變性10秒，58 °C退火20秒，72 °C延伸3分鐘40秒，35個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘，篩選電泳檢測(cè)得到3502 bp大小的產(chǎn)物，因此篩選出同時(shí)含有AtCBF3、AtCBF3和AtCBF2 三個(gè)基因的重組子，重組子含有重組載體，該重組載體命名為pBiBAC-CBF。采用電擊法將pBiBAC-CBF載體轉(zhuǎn)化EHA105/ pVCT2272，在含卡那霉素50mg/L、 壯觀霉素50mg/L、鏈霉素100mg/L和利福平100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得含 pBiBAC-CBF 載體的 EHA105/pVCT2272 的工程菌，命名為 EHA105/pVCT2272/pBiBAC_CBF。所得 EHA105/pVCT2272/pBiBAC-CBF 葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，在含 2. 5 mg/L 6-BA 和 150mg/L 卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)生芽，獲得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草，如附圖10所示。以卡那霉素抗性煙草基因組DNA為模板，以SEQ ID NO 12所示序列為上游引物，SEQ ID N0:13所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)AtCBFl基因，如附圖11所示。結(jié)果顯示，在卡那霉素抗性煙草在2102bp處能夠檢測(cè)到AtCBFl擴(kuò)增，結(jié)果表明pBiBAC-CBF質(zhì)粒的T-DNA區(qū)整合進(jìn)煙草基因組。進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明獲得的毒性輔助載體PVCT2272載體能夠?qū)崿F(xiàn)使大分子量 T-DNA完整整合進(jìn)植物基因組中。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體，其特征在于所述毒性輔助載體包括virE-virG嵌合操縱子，所述virE_virG嵌合操縱子核苷酸序列如SEQ ID NO 16所7J\ ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述毒性輔助載體，其特在于所述毒性輔助載體還包括oriV農(nóng)桿菌復(fù)制子和spec基因，所述oriV農(nóng)桿菌復(fù)制子核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示，所述 spec基因核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述毒性輔助載體，其特征在于所述毒性輔助載體具有如SEQID NO :7所示核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1、2或3所述毒性輔助載體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟a.制備重組雙元表達(dá)載體；al.制備Pnos: :nptll片段并酶切，將Pnos: :nptll酶切片段插入pCAMBIA1302載體多克隆酶切位點(diǎn)處，得PVCT2020載體；a2.酶切pEGFP-Nl載體，制備eGFP基因，將所述eGFP基因插入pET-32a(+)載體多克隆酶切位點(diǎn)，得PVCT2190載體；a3.酶切所得pVCT2190載體，制備所述eGFP基因的片段，將酶切所得eGFP基因插入所得pVCT2020載體酶切位點(diǎn)處，得pVCT2210載體；a4.酶切所得PVCT2210載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，將回收的片段連接，得 PVCT2212 載體；a5.酶切所得pVCT2212載體，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收含eGFP基因片段，將酶切所得eGFP基因插入pHells gate8載體酶切位點(diǎn)處，得重組雙元表達(dá)載體，命名為pVCT2268 載體；b.制備含VirEiirG嵌合操縱子的基本載體；bl.制備 Promoter-VirEl-VirE2 基因，將所得 Promoter-VirEl_VirE2 基因連接 P^asj-Blant 載體，得 pVCT1213 載體；b2.制備 VirG-terminator 基因，將所得 VirG-terminator 片段插入 pVCT1213 載體，得含virE-virG嵌合操縱子的基本載體，命名為pVCT1244載體；c.制備毒性輔助載體；cl.酶切所得PVCT1244載體，制備virE-virG嵌合操縱子，將所得virE-virG嵌合操縱子插入所得PVCT2268載體，得重組載體，命名為pVCT2270載體；c2.酶切所得pVCT2270載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收含所述virE-virG嵌合操縱子片段、農(nóng)桿菌復(fù)制子oriV和所述抗性標(biāo)記基因片段，將回收pVCT2270載體的酶切片段再連接，得所述毒性輔助載體，命名為PVCT2272載體。
5.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求4所述毒性輔助載體的制備方法，其特在于步驟al所述 Pnos: :nptll片段的制備，具體包括如下步驟以SEQ ID NO :1所示序列為上游引物，以SEQ ID NO :2所示序列為下游引物，以pBIN19 載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性20秒，50°C退火 20秒，72°C延伸2分鐘10秒，3個(gè)循環(huán)，60°C退火20秒，72°C延伸2分鐘10秒，27個(gè)循環(huán)， 72°C延伸10分鐘，得Pnos: :nptll片段。
6.6.根據(jù)權(quán)利要求4所述毒性輔助載體的制備方法，其特征在于，步驟bl所述Promoter-VirEl-VirE2基因的制備，具體步驟如下以所述農(nóng)桿菌C58的pTiC58質(zhì)粒DNA為模板，上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :3所示，下游上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO :4所示，采用I^rin^tar HS DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得VirE2基因片段，所述PCR擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性1分鐘， 98°C變性10秒，56 °C退火15秒，72 °C延伸2分鐘30秒，觀個(gè)循環(huán)，72 °C延伸10分鐘，得 Promoter-VirEl-VirE2 _@。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述毒性輔助載體的制備方法，其特征在于，步驟1^2所述 VirG-terminator基因的制備，具體步驟如下以所述農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌C58的pTiC58載體為模板，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO 5 所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得VirG基因片段，所述PCR擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性1分鐘，98°C變性10秒，56°C退火 15秒，72°C延伸1分鐘，沘個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘，得VirG-terminator基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述毒性輔助載體的制備方法，其特征在于，步驟cl所述 virE-virG嵌合操縱子的制備，具體步驟如下同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Spe I.Xba I和Emall05 I酶切所得pVCT1244載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收3465bp大小的片段，得virE-virG嵌合操縱子。
9.權(quán)利要求1所述毒性輔助載體在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于用含有所述毒性輔助載體的農(nóng)桿菌介導(dǎo) pBiBAC-CBF載體轉(zhuǎn)化煙草。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)大分子量T-DNA轉(zhuǎn)化的毒性輔助載體，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建含有virE-virG嵌合操縱子和農(nóng)桿菌復(fù)制子oriV的載體，在農(nóng)桿菌中能過(guò)量表達(dá)VirE2蛋白；本發(fā)明還公開(kāi)了該載體的制備方法，本發(fā)明公開(kāi)的載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，使長(zhǎng)度超過(guò)25kb的T-DNA轉(zhuǎn)進(jìn)植物基因組時(shí)有足夠量的VirE2蛋白包裹大分子量T-DNA，使大分子量T-DNA不被核酸酶降解，能夠使大分子量T-DNA完整整合進(jìn)植物基因組中，實(shí)現(xiàn)多基因的遺傳轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102321667SQ20111030644
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者張興國(guó), 杜小兵, 蘇承剛, 錢(qián)春, 陳吉裕, 高啟國(guó), 黃國(guó)棟 申請(qǐng)人:西南大學(xué)