用于野外采樣提取植物基因組dna、蛋白質(zhì)的組織固定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法。該方法將組織樣品切割為截面不大于0.5cm2的條塊放入組織固定劑浸泡后過夜保存，固定后的樣品用移液槍去除大部分固定劑并加入少許混合的組織固定干粉然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱保存數(shù)月或-20℃冰箱長(zhǎng)期保存。對(duì)野外作業(yè)中的植物組織進(jìn)行簡(jiǎn)單快速處理后的植物組織，可用于DNA、蛋白質(zhì)提取和后期實(shí)驗(yàn)。既方便了野外采集植物組織的作業(yè)流程，又大大節(jié)約了野外采集植物組織的勞動(dòng)成本。本發(fā)明是利用組織固定劑進(jìn)行植物種組織材料進(jìn)行固定的方法，為科技工作者處理固定植物組織，特別是野外采摘植物樣品提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法。
【專利說(shuō)明】用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物中有效成分包括植物營(yíng)養(yǎng)成分、藥用成分、香精、天然色素等成分，亦包括一些生物大分子如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等。一般藥用成分等這幾種成分的提取需要對(duì)材料進(jìn)行烘干預(yù)處理之后進(jìn)行，這樣植物組織才易于保存，不存在有效成分降解的問題，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)一般也不存在很大的影響。
[0003]但是在提取植物材料中某些活性成分(酶、維生素C或生物大分子如DNA、RNA或蛋白質(zhì)等)時(shí)，有時(shí)需要用新鮮植物樣品。新鮮植物樣品材料的采集和處理，是植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的極其重要環(huán)節(jié)。取樣時(shí)應(yīng)注意保鮮，通常取樣后應(yīng)立即進(jìn)行待測(cè)組分的提取以防止有效成分發(fā)生降解；也可采用液氮速凍后放在-80°C超低溫冰箱長(zhǎng)期保存；若只是提取植物基因組DNA，樣品也可置于O~4°C冰箱中短期保存。從田間采取新鮮植物材料樣品，在正式測(cè)定之前的一段時(shí)間里，如何正確妥善的保存和處理是很重要的，它影響到后續(xù)的一系列相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，也關(guān)系到測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0004]通常植物采樣回來(lái)會(huì)立即處理或者低溫保存，但是往往會(huì)存在各種困難，有些時(shí)候從田間或野外采樣回來(lái)會(huì)后，由于其他事情的耽擱或者采摘過多樣品回來(lái)無(wú)法立即處理，這樣便會(huì)導(dǎo)致樣品 有效成分的降解或損失。而一般的田間與實(shí)驗(yàn)室有一定的距離，有些甚至相隔甚遠(yuǎn)，特別是野外考察取樣后更是無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)處理保存好樣品。所以如何使植物組織固定，保證植物樣品的有效成分不被降解是一個(gè)極大的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種安全有效的用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法，該方法能安全有效地將野外采樣后的植物組織，提取到實(shí)驗(yàn)要求的基因組DNA和蛋白質(zhì)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法，包括以下步驟:
[0007]( I)組織固定劑配制
[0008]a、取 500 ~550g(NH4)2S04、2.5gTris 堿、3.7g Na2EDTA,將上述三種成分混均，獲得組織固定干粉；
[0009]b、混均后的組織固定干粉加入700~800mL熱開水充分?jǐn)嚢枞芑?V~4°C冷卻成飽和溶液有沉淀析出，PH為7.0~7.4 ;獲得組織固定劑；
[0010](2)植物組織樣品處理
[0011]a、將植物組織樣品切割為截面不大于0.5cm2的植物組織樣品條塊；[0012]b、將植物組織樣品條塊放入保鮮袋，往保鮮袋裝入5~10倍體積的組織固定劑，保鮮袋完全排除空氣后扎緊，置陰涼處固定12~24小時(shí)；
[0013]C、固定后的植物組織樣品，用移液槍去除保鮮袋中3/5~4/5比例的組織固定劑液體，并加入I~5g組織固定干粉；
[0014]d、然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱保存數(shù)月或-20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0015]本發(fā)明工藝流程簡(jiǎn)單，將植物樣品放入配制好的組織固定劑后，即可實(shí)現(xiàn)植物組織的有效固定和保存，為野外采取新鮮植物材料提取植物基因組DNA樣品、蛋白質(zhì)及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供安全快捷的材料，達(dá)到了節(jié)約能源、低炭環(huán)保和采摘后的植物組織材料的保存目的，實(shí)現(xiàn)了生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益三者的有機(jī)結(jié)合。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1中為CTAB法對(duì)木薯葉片進(jìn)行DNA提取，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外下成像示意圖；
[0017]圖2為采用脂肪酸脫飽和酶基因的引物對(duì)轉(zhuǎn)基因木薯基因組DNA的可靠性進(jìn)行PCR驗(yàn)證，用質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照的模板，采用用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離在紫外下成像結(jié)果示意圖；圖中1-7分別對(duì)應(yīng)1-7植物樣品DNA為模板的PCR結(jié)果，其中M為marker ；陽(yáng)性對(duì)照以質(zhì)粒為模板；陰性對(duì)照以水為模板；
[0018]圖3中的圖A為直接提取植物樣品蛋白后2-D結(jié)果；圖B為用本發(fā)明組織固定劑固定植物樣品之后提取蛋白后的2-D結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖作進(jìn)
一步說(shuō)明 。
[0020]本發(fā)明一種用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法，包括組織固定劑配制、植物組織樣品處理兩個(gè)步驟:
[0021](1)、組織固定劑配制
[0022]a、取 500 ~550g(NH4)2S04、2.5gTris 堿、3.7g Na2EDTA,將上述三種成分混均獲得組織固定干粉；
[0023]b、混均后的組織固定干粉加入700~SOOmL熱開水充分?jǐn)嚢枞芑?V~4°C冷卻成飽和溶液有沉淀析出，PH為7.0~7.4 ;獲得組織固定劑；
[0024](2)、植物組織樣品處理
[0025]a、將植物組織樣品切割為截面不大于0.5cm2的植物組織樣品條塊；
[0026]b、將植物組織樣品條塊放入保鮮袋，往保鮮袋裝入5~10倍體積的組織固定劑，保鮮袋完全排除空氣后扎緊，置陰涼處固定12~24小時(shí)(固定過夜)；
[0027]C、固定后的植物組織樣品，可用移液槍去除保鮮袋中大部分的組織固定劑液體，并加入I~5g組織固定干粉；去除的組織固定劑液體占原有組織固定劑液體的60 %~80 % ；
[0028]d、然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱保存數(shù)月或_20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0029]對(duì)于水分過多或體積過大的植物組織樣品，可采用未切割后直接將樣品包埋在組織固定劑中的方式保存。
[0030]野外轉(zhuǎn)基因木薯DNA提取及其模板的驗(yàn)證
[0031]經(jīng)過上述固定劑固定過夜后的木薯葉片約0.2~0.3g洗凈，再采用CTAB法對(duì)木薯葉片進(jìn)行DNA提取，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外下成像結(jié)果如圖1所示，用組織固定劑固定后用CTAB法提取的木薯基因組DNA沒有發(fā)生降解等變化，可以看出DNA的完整性。
[0032]采用該基因(脂肪酸脫飽和酶基因)的引物對(duì)轉(zhuǎn)基因木薯基因組DNA的可靠性進(jìn)行PCR驗(yàn)證，用質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照的模板，采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離在紫外下成像結(jié)果如圖2所示，可以看到在1200bp處能檢測(cè)到該基因的目的條帶，經(jīng)過驗(yàn)證說(shuō)明所提的木薯DNA可用。
[0033]野外木薯蛋白質(zhì)的提取
[0034]經(jīng)過上述固定劑固定過夜后的木薯葉片0.5~1g洗凈，再采用苯酚提取法對(duì)木薯葉片的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，用酶標(biāo)儀定量之后跑聚丙烯酰胺凝膠2-D結(jié)果如圖3B所示，用該方法提取的蛋白質(zhì)在質(zhì)量上不發(fā)生變化，可以用來(lái)做2-D等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0035]由以上結(jié)果可以看出，用本發(fā)明的組織固定劑進(jìn)行植物組織材料進(jìn)行固定后對(duì)植物基因組DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，并不影響基因組DNA和蛋白質(zhì)的質(zhì)量，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也不發(fā)生影響，為野外采摘植物樣品提供了一種非常簡(jiǎn)單有效的方法。
[0036]本發(fā)明的用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法適用于任何的植物樣品組織固定，不僅限于本發(fā)明實(shí)施例中的野外轉(zhuǎn)基因木薯。
[0037]以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【權(quán)利要求】
1.用于野外采樣提取植物基因組DNA、蛋白質(zhì)的組織固定方法，其特征在于包括以下步驟: (1)組織固定劑配制 a、取500~550g(NH4)2S04、2.5gTris堿、3.7g Na2EDTA,將上述三種成分混均，獲得組織固定干粉； b、混均后的組織固定干粉加入700~SOOmL熱開水充分?jǐn)嚢枞芑?°C~4°C冷卻成飽和溶液有沉淀析出，PH為7.0~7.4 ;獲得組織固定劑； (2)植物組織樣品處理 a、將植物組織樣品切割為截面不大于0.5cm2的植物組織樣品條塊； b、將植物組織樣品條塊放入保鮮袋，往保鮮袋裝入5~10倍體積的組織固定劑，保鮮袋完全排除空氣后扎緊，置陰涼處固定12~24小時(shí)； C、固定后的植物組織樣品，用移液槍去除保鮮袋中3/5~4/5比例的組織固定劑液體，并加入I~5g組織固定干粉； d、然后轉(zhuǎn)入4°C 冰箱保存數(shù)月或_20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103898091SQ201310378734
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】歐文軍, 羅秀芹, 劉斌, 李開綿 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所