一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法。該方法包括以下操作步驟：藍莓花青素溶液的準備，藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化，藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離，透過液中藍莓花青素的分離，高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存。有益技術(shù)效果是：（1）采用集反應與分離于一體的膜反應器進行酶催化反應，既提高了酶的使用效率，降低了生產(chǎn)成本，又可以將反應產(chǎn)物連續(xù)地排出，降低甚至消除反應產(chǎn)物對酶的抑制作用、提高了催化反應的速度；（2）集成膜反應系統(tǒng)、反滲透系統(tǒng)、萃取系統(tǒng)制備高生物利用度的藍莓花青素，適用于工業(yè)化；（3）本發(fā)明制得的高生物利用度藍莓花青素生物利用度高于60%，具有更高的醫(yī)療保健價值和更寬的實際應用領域。
【專利說明】一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品功能成分的精深加工領域，具體涉及一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藍莓花青素是從藍莓(也叫越橘)果中提取獲得的以2-苯基苯并吡喃為母核的類黃酮化合物，它由飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥色素、錦葵色素、牽?；ㄇ嗨毓?種花青素苷元，以及各花青素苷元與葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、乙酰阿拉伯糖連接形成的花青素糖苷組成。藍莓花青素的抗氧化活性是\的20倍、Ve的50倍，具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗心血管疾病以及促進視紅素再合成、保護視力等生理功能。為此，藍莓花青素倍受消費者的青睞。研究證明，花青素苷元是藍莓花青素發(fā)揮生理功能的活性形式，它們是活性花青素；但活性花青素含量很低，不足藍莓花青素總量的10%，藍莓花青素主要是以花青素糖苷的形式存在，并且，現(xiàn)有的提取技術(shù)只能得到花青素糖苷；這些花青素糖苷需要經(jīng)過人體腸道微生物產(chǎn)生的糖苷酶水解成花青素苷元后才能在體內(nèi)發(fā)揮活性作用。盡管藍莓花青素對人體的健康功效受到高度關注，但由于活性花青素在藍莓花青素中所占比例少，分離純化難度大、成本高，所以，當前藍莓花青素產(chǎn)品仍是以從藍莓果中提取生產(chǎn)的花青素糖苷含量為5-40%的粗提物為主，加工水平初級，產(chǎn)品附加值不高，因為主要是糖苷形式，常因人群個體差異保健效果不明顯，生物利用度低，嚴重限制了藍莓花青素在醫(yī)藥、化妝品和保健品等領域的開發(fā)應用。
[0003]由于人體腸道微生物產(chǎn)生的糖苷酶的數(shù)量和活力有限，因此，在體外把藍莓花青素糖苷轉(zhuǎn)化為藍莓花青素苷元將是提高藍莓花青素生物利用度的有效途徑。當前，花青素糖苷轉(zhuǎn)化為花青素苷元的方法主要有酸水解法和酶水解法兩種。酸水解法要求溫度高，水解反應缺乏專一性，除水解糖 苷鍵外也能破壞母核上的其它基團，造成藍莓花青素活性的降低甚至消失，并且酸水解會對環(huán)境產(chǎn)生污染，應用效果并不理想。酶水解法是通過特異性糖苷酶控制性水解花青素糖苷的糖苷鍵而生成活性花青素苷元，具有糖苷鍵專一性、可控性強、活性苷元結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、效率高等優(yōu)勢?？梢姡瑧妹杆夥ù呋{莓花青素糖苷轉(zhuǎn)化為藍莓花青素苷元，將是提高藍莓花青素的生物利用度的理想方法。
[0004]超濾以超濾膜為過濾介質(zhì)、以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力，使原液流過超濾膜表面時，體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進液側(cè)，成為濃縮液；體積小于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被透過膜微孔，成為透過液；從而實現(xiàn)對原液的分離和濃縮等目的。反滲透是以半透膜為過濾介質(zhì)、以膜兩側(cè)的壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，可以達到分離、提取、純化和濃縮的目的。近年來，超濾、反滲透均已進入工業(yè)應用，具有耗能低、無污染、工藝簡單、操作簡便等優(yōu)點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是要提供一種生物利用度高的藍莓花青素的制備方法。[0006]本發(fā)明首先通過糖苷酶將藍莓花青素糖苷催化轉(zhuǎn)化為藍莓花青素苷元，再通過超濾膜將糖苷酶與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離，然后根據(jù)藍莓花青素溶于乙醇而糖不溶于乙醇的原理，通過乙醇萃取獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的藍莓花青素苷元，最后通過冷凍干燥獲得高生物利用度低的藍莓花青素。目前尚未見相關技術(shù)報道。
[0007]一種高生物利用度的藍莓花青素的具體制備操作步驟如下:
(1)藍莓花青素溶液的準備；取藍莓花青素提取物溶解于pH值為3-5的緩沖溶液中，配制成每100 ml緩沖溶液中含10-50g藍莓花青素提取物的藍莓花青素溶液；
(2)藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化；取步驟(1)制備的藍莓花青素溶液放入酶反應器中，按藍莓花青素溶液:糖苷酶為100 ml: l_5g的比例加入糖苷酶，進行酶的催化轉(zhuǎn)化反應，獲得藍莓花青素轉(zhuǎn)化液；
(3)藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離；取步驟(2)制備的藍莓花青素轉(zhuǎn)化液，使其通過截留分子量為3000-5000 Da的超濾膜，在溫度不高于40°C、流速不低于10 ml/min、操作壓力
0.5-1.0MPa的條件下超濾分離，截留液返回酶反應器中，收集透過液；
(4)透過液中藍莓花青素的分離；取步驟(3)制備的透過液，使其通過反滲透膜系統(tǒng)，在溫度不高于40 °C、操作壓力1.0-2.0MPa的條件下進行反滲透濃縮；反滲透的透過液可以用于緩沖溶液的配制，收集反滲透的截留液；將反滲透的截留液在溫度40-50 °C、真空度0.09-0.1MPa的條件下減壓濃縮至膏狀，收集膏狀物；取膏狀物，按膏狀物:無水乙醇=Iml: 30-50ml的比例加入無水乙醇，均勻攪拌3_5分鐘，然后在轉(zhuǎn)速5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度4-10 °C的條件下離心10-15分鐘，收集離心上清液，即得到高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存:取步驟(4)制備的高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液，在溫度30-40 °C、真空度0.09-0.1MPa的條件下減壓濃縮，得到乙醇和膏狀的高生物利用度藍莓花青素；乙`醇可重復使用，膏狀的高生物利用度藍莓花青素通過冷凍干燥，即得到高生物利用度的藍莓花青素粉末；高生物利用度的藍莓花青素粉末中總花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素總量的30%以上、生物利用度大于60%。
[0008]步驟(1)中所述的藍莓花青素提取物為深紫色粉末或膏狀，微溶于水，總花青素含量3 20%，花青素糖苷占總花青素含量的95%以上。
[0009]步驟(1)中所述緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。
[0010]步驟(2)中所述糖苷酶為活力不低于100 U/mg的糖苷酶，即β -葡萄糖苷酶或α-阿拉伯糖苷酶或β-半乳糖苷酶的一種或幾種的混合物。
[0011]所述幾種的混合物為β -葡萄糖苷酶、α -阿拉伯糖苷酶和β -半乳糖苷酶的混合物，且三者的質(zhì)量比為2:1:1。
[0012]步驟(2)中所述的酶催化轉(zhuǎn)化反應的條件為反應溫度30_40°C，攪拌轉(zhuǎn)速50-100轉(zhuǎn)/分鐘，反應時間為2-5小時、避光。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點:(1)本發(fā)明采用膜反應器進行藍莓花青素的酶催化反應，集反應與分離于一體，酶可以回收循環(huán)使用，提高了酶的使用效率，降低了生產(chǎn)成本，同時，反應產(chǎn)物可以連續(xù)地排出，降低甚至消除了產(chǎn)物對酶的抑制作用、提高了催化反應的速度，縮短了生產(chǎn)周期；(2)本發(fā)明集成膜反應系統(tǒng)、反滲透系統(tǒng)、萃取系統(tǒng)制備高生物利用度的藍莓花青素，適用于工業(yè)化；(3)本發(fā)明生產(chǎn)出的高生物利用度藍莓花青素中總花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素總量的30%以上、生物利用度高于60%，具有更高的醫(yī)療保健價值和更寬的實際應用領域。
[0014]生物利用度(bioavailability, F)是指藍莓花青素被機體吸收進入體循環(huán)的相對量，用F表示，F(xiàn)= (D/A) X 100%。A為靜脈注射藍莓花青素進入體循環(huán)所能達到的濃度，D為口服相同藍莓花青素劑量后體循環(huán)所能達到的濃度。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步地描述。
[0016]以下實施例所用原料的來源說明如下:
藍莓花青素提取物的生產(chǎn)單位為寶雞市普蘭特生物工程有限公司，為深紫色粉末，微溶于水，總花青素含量3 25%，花青素糖苷占總花青素含量的95%以上；
醋酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉為國產(chǎn)分析純，醋酸和檸檬酸鈉的生產(chǎn)廠家均為天津市博迪化工有限公司，檸檬酸和醋酸鈉的生產(chǎn)廠家均為西隴化工股份有限公司，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的配制參考高俊鳳編寫的《植物生理學實驗指導書》第178頁配制而成。無水乙醇生產(chǎn)廠家為上海永銘化工有限公司。葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶均購于天津希恩思生化科技有限公司，α-阿拉伯糖苷酶的生產(chǎn)單位為西化儀(北京)科技有限公司。
[0017]實施例1:
一種高生物利用度的藍莓 花青素的具體制備操作步驟如下:
(I)藍莓花青素溶液的準備；取市售的藍莓花青素提取物，溶解于PH值為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，配制成每100 ml緩沖溶液中含30g藍莓花青素提取物的藍莓花青素溶液；
(2 )藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化；取藍莓花青素溶液放入酶反應器中，按藍莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:1g的比例加入活力為500 U/mg的β -葡萄糖苷酶，在溫度為40°C、攪拌轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘、避光的條件下進行酶催化轉(zhuǎn)化反應5小時，獲得藍莓花青素轉(zhuǎn)化液；
(3)藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離；取藍莓花青素轉(zhuǎn)化液，使其通過截留分子量為4000Da的超濾膜，在溫度40°C、流速30 ml/min、操作壓力0.5MPa的條件下超濾分離，截留液返回酶反應器中，收集透過液；
(4)透過液中藍莓花青素的分離；取透過液，使其通過反滲透膜系統(tǒng)，在溫度35°C、操作壓力1.0MPa的條件下進行反滲透濃縮；反滲透的透過液可以用于緩沖溶液的配制，收集反滲透的截留液；將反滲透的截留液在溫度45°C、真空度0.09-0.1Mpa的條件下減壓濃縮至膏狀，收集膏狀物；取膏狀物，按膏狀物:無水乙醇=1 ml: 30 ml的比例加入無水乙醇，均勻攪拌5分鐘，然后在轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度10°C的條件下離心15分鐘，收集離心上清液，即得到高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存:取高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液，在溫度35°C、真空度0.09-0.1MPa的條件下減壓濃縮，得到乙醇和膏狀的高生物利用度藍莓花青素；乙醇可重復使用，膏狀的高生物利用度藍莓花青素通過冷凍干燥，即得到總花青素含量為60.50%、花青素苷元占花青素總量的41.60%、生物利用度為70.8%的藍莓花青素粉末，密封、避光、4°C保存。
[0018]實施例2:
一種高生物利用度的藍莓花青素的具體制備操作步驟如下:
(1)藍莓花青素溶液的準備；取藍莓花青素提取物溶解于pH值為3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配制成每100 ml緩沖溶液中含50g藍莓花青素提取物的藍莓花青素溶液；
(2)藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化；取藍莓花青素溶液放入酶反應器中，按藍莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:5g的比例加入活力分別為100 U/mg和150 U/mg的α -阿拉伯糖苷酶和β -半乳糖苷酶，在溫度為35°C、攪拌轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/分鐘、避光的條件下進行酶催化轉(zhuǎn)化反應3小時，獲得藍莓花青素轉(zhuǎn)化液；
(3)藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離；取藍莓花青素轉(zhuǎn)化液，使其通過截留分子量為5000Da的超濾膜，在溫度30°C、流速10 ml/min、操作壓力0.SMPa的條件下超濾分離，截留液返回酶反應器中，收集透過液； (4)透過液中藍莓花青素的分離；取透過液，使其通過反滲透膜系統(tǒng)，在溫度不高于30°C、操作壓力1.5MPa的條件下進行反滲透濃縮；反滲透的透過液可以用于緩沖溶液的配制，收集反滲透的截留液；將反滲透的截留液在溫度40°C、真空度0.09-0.1Mpa的條件下減壓濃縮至膏狀，收集膏狀物；取膏狀物，按膏狀物:無水乙醇=1 ml: 50 ml的比例加入無水乙醇，均勻攪拌3分鐘，然后在轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度4°C的條件下離心10分鐘，收集離心上清液，即得到高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存:取高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液，在溫度30°C、真空度0.09-0.1MPa的條件下減壓濃縮，得到乙醇和膏狀的高生物利用度藍莓花青素；乙醇可重復使用，膏狀的高生物利用度藍莓花青素通過冷凍干燥，即得到總花青素含量為55.89%、花青素苷元占花青素總量的33.74%、生物利用度為63.8%的藍莓花青素粉末，密封、避光保存于冰箱冷藏室。
[0019]實施例3:
一種高生物利用度的藍莓花青素的具體制備操作步驟如下:
(1)藍莓花青素溶液的準備；取藍莓花青素提取物溶解于pH值為4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配制成每100 ml緩沖溶液中含IOg藍莓花青素提取物的藍莓花青素溶液；
(2)藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化；取藍莓花青素溶液放入酶反應器中，按藍莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:3g的比例加入活力100 U/mg的β-葡萄糖苷酶、活力200 U/mga-阿拉伯糖苷酶、活力200 U/mg的β -半乳糖苷酶，在溫度為30°C、攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘、避光的條件下進行酶催化轉(zhuǎn)化反應2小時，獲得藍莓花青素轉(zhuǎn)化液；其中β -葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和β-半乳糖苷酶的加入量的比例為2:1:1;
(3)藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離；取藍莓花青素轉(zhuǎn)化液，使其通過截留分子量為3000Da的超濾膜，在溫度20°C、流速50 ml/min、操作壓力1.0MPa的條件下超濾分離，截留液返回酶反應器中，收集透過液；
(4)透過液中藍莓花青素的分離；取透過液，使其通過反滲透膜系統(tǒng)，在溫度20°C、操作壓力2.0MPa的條件下進行反滲透濃縮；反滲透的透過液可以用于緩沖溶液的配制，收集反滲透的截留液；將反滲透的截留液在溫度50°C、真空度0.09-0.1Mpa的條件下減壓濃縮至膏狀，收集膏狀物；取膏狀物，按膏狀物:乙醇=1 ml:40 ml的比例加入無水乙醇，均勻攪拌4分鐘，然后在轉(zhuǎn)速8000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度6°C的條件下離心12分鐘，收集離心上清液，即得到高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存:取高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液，在溫度40 °C、真空度0.09-0.1MPa的條件下減壓濃縮，得到乙醇和膏狀的高生物利用度藍莓花青素；乙醇可重復使用，膏狀的高生物利用度藍莓花青素通過冷凍干燥，即得到總花青素含量69.13%、花青素苷元占花青素總量的50.67%、生物利用度為81.7%的藍莓花青素粉末，密封、避光保存于冰箱`冷凍室。
【權(quán)利要求】
1.一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于包括如下操作步驟: (1)藍莓花青素溶液的準備；取藍莓花青素提取物溶解于PH值為3-5的緩沖溶液中，配制成每100 ml緩沖溶液中含10-50g藍莓花青素提取物的藍莓花青素溶液； (2)藍莓花青素的糖苷酶催化轉(zhuǎn)化；取步驟(1)制備的藍莓花青素溶液放入酶反應器中，按藍莓花青素溶液:糖苷酶為100 ml: l_5g的比例加入糖苷酶，進行酶的催化轉(zhuǎn)化反應，獲得藍莓花青素轉(zhuǎn)化液； (3)藍莓花青素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的膜分離；取步驟(2)制備的藍莓花青素轉(zhuǎn)化液，使其通過截留分子量為3000-5000 Da的超濾膜，在溫度不高于40°C、流速不低于10 ml/min、操作壓力0.5-1.0 MPa的條件下超濾分離，截留液中主要成分為糖苷酶，返回酶反應器中重復使用，收集透過液； (4)透過液中藍莓花青素的分離；取步驟(3)制備的透過液，使其通過反滲透膜系統(tǒng)，在溫度不高于40 °C、操作壓力1.0-2.0 MPa的條件下進行反滲透濃縮；反滲透的透過液可以用于緩沖溶液的配制，收集反滲透的截留液；將反滲透的截留液在溫度40-50 °C、真空度0.09-0.1 MPa的條件下減壓濃縮至膏狀，收集膏狀物；取膏狀物，按膏狀物:無水乙醇=Iml: 30-50ml的比例加入無水乙醇，均勻攪拌3_5分鐘，然后在轉(zhuǎn)速5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度4-10 °C的條件下離心10-15分鐘，收集離心上清液，即得到高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液； (5)高生物利用度藍莓花青素的干燥與保存:取步驟(4)制備的高生物利用度的藍莓花青素乙醇溶液，在溫度30-40 °C、真空度0.09-0.1 MPa的條件下減壓濃縮，得到乙醇和膏狀的高生物利用度藍莓花青素；乙醇可重復使用，膏狀的高生物利用度藍莓花青素通過冷凍干燥，即得到高生物利用度的藍莓花青素粉末；高生物利用度的藍莓花青素粉末中總花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素總量的30%以上、生物利用度大于60%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的藍莓花青素提取物為深紫色粉末或膏狀，微溶于水，總花青素含量3 20%,花青素糖苷占總花青素含量的95%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述糖苷酶為活力不低于100 U/mg的糖苷酶，即葡萄糖苷酶或α-阿拉伯糖苷酶或β_半乳糖苷酶的一種或幾種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于:所述幾種的混合物為葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和半乳糖苷酶的混合物，且三者的質(zhì)量比為2:1:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高生物利用度藍莓花青素的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的酶催化轉(zhuǎn)化反應的條件為反應溫度30-40°C，攪拌轉(zhuǎn)速50-100轉(zhuǎn)/分鐘，反應時間為2-5小時，避光。
【文檔編號】C12P17/06GK103509834SQ201310483928
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】潘利華, 賀元康, 羅建平, 樊基圣 申請人:合肥工業(yè)大學