一種高效擴增自體nk細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)基內含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α（TNFα）和抗CD3抗體，可以高效擴增和活化NK細胞，從而獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)相關疾病的治療中具有顯著療效。根據(jù)本發(fā)明的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，其由細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和添加于所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的添加因子構成，用于大量培養(yǎng)擴增自體活化的NK細胞，其特征在于，所述添加因子包含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α（TNFα）和抗CD3抗體。
【專利說明】一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞生物學領域，特別涉及一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]在我國惡性腫瘤已成為居民死亡原因的首位。腫瘤生物免疫療法是手術、放療和化療之外的治療手段，成為人類抗擊腫瘤最有希望的措施之一。NK細胞過繼性免疫療法是腫瘤生物免疫治療的一種，其原理是應用現(xiàn)代生物醫(yī)學技術，對人體NK細胞在體外進行活化與擴增培養(yǎng)后回輸，調整和激發(fā)機體抗腫瘤的免疫系統(tǒng)，從而殺傷腫瘤細胞。同時，NK細胞過繼免疫療法對病毒或細菌感染、免疫調節(jié)相關疾病以及抗衰老也有一定療效。
[0003]NK細胞被認為是機體抗感染、抗腫瘤的第一道天然防線，是機體重要的免疫細胞，與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)密切相關，NK細胞起源于骨髓來源的CD34+造血祖細胞，約占外周血淋巴細胞的5%-15%，免疫表型特點為⑶3TD16+⑶56+，主要分布于外周血、淋巴結、脾和骨髓，也可以在不同化學趨化因子作用下遷移到炎癥部位。因細胞體積大、包漿量多、電鏡下觀察胞內含有致密顆粒，故又稱為大顆粒淋巴細胞，可以通過分泌功能顆粒實現(xiàn)對靶細胞的殺傷。這些顆粒包括穿孔素和顆粒酶B，介導靶細胞凋亡和破壞胞內結構。NK細胞也能表達FasL和TRAIL，當與靶細胞上受體結合時，可以誘導靶細胞凋亡。NK細胞分泌TNF- α等細胞因子調節(jié)對靶細胞殺傷功能。NK細胞殺傷靶細胞不受MHC限制，也不需要預先與抗原接觸致敏或顯示任何記憶反應。其表面存在大量不同特異性和反應活性受體，通過和靶細胞的相應配體識別來激活NK細胞，產生細胞毒性作用。
[0004]因為NK細胞的種種特性，使其成為了過繼免疫治療研究和應用的熱點。但是，這種具有高度殺傷癌細胞功能的N`K細胞只占正常外周血淋巴細胞的5% -15%，數(shù)量較少，如何獲得大量高活性的NK細胞成為其制約臨床應用的瓶頸。總體來說，目前國內細胞免疫治療多以T細胞為主，NK細胞含量低，臨床療效有待提高，與國外技術相比有差距。其主要原因是NK細胞的培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基生產技術有待突破。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術中存在的問題。即，本發(fā)明目的是提供一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)基內含有白細胞介素2 (IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7 (IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子a (TNF α )和抗CD3抗體，可以高效擴增和活化NK細胞，從而獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)相關疾病的治療中具有顯著療效。
[0006]本發(fā)明的目的是采用如下技術方案實現(xiàn)的:
一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，包括細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和添加于所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的添加因子，用于高效擴增自體NK細胞，所述添加因子包含白細胞介素2(IL-2)、白細胞介15(IL-15)、白細胞介素7 (IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFa )和抗CD3抗體。
[0007]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有175-1750 IU/ml白細胞介素2。
[0008]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素15。
[0009]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素7。
[0010]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素12。
[0011]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml腫瘤壞死因子α。
[0012]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法采用10-100 μ g/ml抗⑶3抗體包被細胞培養(yǎng)瓶。
[0013]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基添加劑還包括5-20 ml來源于自體的血漿。
[0014]本發(fā)明的另一目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:采集并分離患者40ml外周血的單個核細胞，用含10 %自身血漿的培養(yǎng)基重懸細胞，加入到用抗⑶3抗體包被的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞因子組合IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNFa刺激，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中孵育，4天后轉瓶并補加含組合細胞因子的培養(yǎng)基，第6天轉袋并補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，即可得到高活性的NK細胞。
[0015]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果是:
1、本發(fā)明所述培養(yǎng)基中添加`多種生物因子，可以高效擴增和活化NK細胞，從而獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)相關疾病的治療中具有顯著療效；
2、本發(fā)明所述NK細胞的培養(yǎng)方法安全、穩(wěn)定，所需時間較短，大大提高了NK細胞的培養(yǎng)周期，有利于大規(guī)模生產；
3、使用本發(fā)明的方法擴增的NK細胞，抗腫瘤效果顯著，實驗表明得到的NK細胞對K562的殺傷率40:1效靶比時達到60%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為表示根據(jù)本發(fā)明的NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)之后的免疫細胞數(shù)變化的示意圖；
圖2為表示根據(jù)本發(fā)明的NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)之后的免疫細胞表型分析示意圖；
圖3為表示采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定NK細胞對靶細胞K562的殺傷活性分析圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例來具體說明本發(fā)明的方法。但本發(fā)明并不受其限制。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。
[0018]實施例1
一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，包括細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和添加于所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的添加因子，用于高效擴增自體NK細胞，所述添加因子包含白細胞介素2(IL-2)、白細胞介15(IL-15)、白細胞介素7 (IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子a(TNFa )和抗CD3抗體。
[0019]所述培養(yǎng)基可以是RPM1-1640培養(yǎng)基、X-VIVO無血清培養(yǎng)基或GT-T551培養(yǎng)基等常見細胞培養(yǎng)基。
[0020]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有175-1750 IU/ml白細胞介素2。
[0021]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素15。
[0022]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素7。
[0023]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml白細胞介素12。
[0024]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有1(T100 ng/ml腫瘤壞死因子α。
[0025]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法采用10-100 μ g/ml抗⑶3抗體包被細胞培養(yǎng)瓶。
[0026]進一步的，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基添加劑還包括5-20 ml來源于自體的血漿。
[0027]—種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:采集并分離患者40ml外周血的單個核細胞，用含10 %自身血漿的培養(yǎng)基重懸細胞，加入到用抗⑶3抗體包被的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞因子組合IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNFa刺激，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中孵育，4天后轉瓶并補加含組合細胞因子的培養(yǎng)基，第6天轉袋并補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，即可得到高活性的NK細胞。
[0028]本實施例所用的原料和試劑除特別說明外，均為市售可得。
[0029]實施例2:
本實施例是在實施例1的基礎上的優(yōu)選化方案，提供了一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。本實施例中與實施例1相同的部分，請參照實施例1中公開的內容進行理解，實施例1公開的內容也應當作為本實施例的內容，此處不作重復描述。
[0030]本實施例的擴增自體NK細胞的培養(yǎng)方法為:
I)細胞刺激因子包被
⑶3mAb(10 ug/ml)用無菌PBS稀釋，取5 mL加入到75 cm2細胞培養(yǎng)瓶內，輕磕，使液體鋪滿瓶底，然后將細胞培養(yǎng)瓶放平，置于室溫條件下過夜，然后轉入4 °C冰箱內保存待用。
[0031]2)外周血單個核細胞(PBMC)的制備
采集患者肝素抗凝外周血40 ml，將全血細胞混懸液小心注入事先加入的淋巴細胞分離液的淋巴細胞分離管內，2500 rpm/min離心15 min ;吸出最上層的血漿，置于56 °C的恒溫水浴內滅活30 min, 3000 rpm/min離心5 min待用；吸取白膜層細胞到15 ml離心管內，無菌PBS加滿離心管，2000 rpm/min離心10 min，棄上清；用PBS洗滌細胞兩次后得到外周血單個核細胞。
[0032]3) NK細胞的誘導活化擴增
將75 cm2細胞培養(yǎng)瓶內包被液倒掉，上述得到的PBMC細胞重懸到50 ml加有組合細胞因子IL-2 (終濃度為1750 IU/ml)、IL-7 (終濃度為10 ng/ml)、IL-15 (終濃度為10 ng/ml)、IL-12 (終濃度為10 ng/ml),TNF α (終濃度為10 ng/ml)的培養(yǎng)基中，并加入5 ml自體血漿(10%),至溫度37 V、CO2含量5%的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；
培養(yǎng)4天，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，拍照；當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁后，將75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中的細胞輕輕震蕩讓其懸浮后，吹打混勻，細胞計數(shù)，直接倒入225 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，然后再加入150 ml加有組合細胞因子IL-2 (終濃度為1750 IU/ml), IL-7 (終濃度為 10 ng/ml)、IL-15 (終濃度為 10 ng/ml)、IL_12 (終濃度為 10 ng/ml)、TNFa (終濃度為10 ng/ml)的培養(yǎng)基中，并加入5 ml自體血漿，至溫度37 °C、CO2含量5%的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；
培養(yǎng)2天后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，拍照；當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶壁后，將225cm2細胞培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉移至含有IL-2 (175 U/mL) 1000 mL培養(yǎng)基的CO2透氣培養(yǎng)袋中，同時再加入10 ml自體血漿，在37°C CO2細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)；
培養(yǎng)6天后收獲細胞，細胞計數(shù)，培養(yǎng)前后免疫細胞增殖變化數(shù)目如圖1所示，由培養(yǎng)前的1-3X107增殖到3-5X109。至此，就可以獲得活化擴增的自體NK細胞，滿足臨床免疫細胞治療的需要。
[0033]4)活化擴增培養(yǎng)后免疫細胞表型分析
采用微量直接標記免疫熒光染色及流式細胞儀檢測法進行分析。即培養(yǎng)收獲的細胞懸液中加入CD3、CD4、CD8、CD56熒光標記單抗20 μ 1，室溫孵育20 min, 1500 rpm/min離心
5min，棄上清液，用PBS洗滌2次，加1%甲醛0.5 ml, FACS流式細胞儀(BD公司)進行分析，每次樣品收集IO6個細胞。對照組標本以同樣方法制備。用Cell Quest軟件解析數(shù)據(jù)。
[0034]如圖2所示，培養(yǎng)后的細胞中⑶56+細胞占62.50%,其中⑶56+⑶3_的NK細胞占 34.45%, CD56+ CD3+的 NKT 細胞占 28.05%, CD3+ CD8+細胞和 CD4/CD8 結果用于參考。
[0035]5)活化擴增培養(yǎng)后NK免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷實驗` 取傳代細胞株K562細胞進行計數(shù)，制成I X IO5 cells/ml細胞懸液，加入96孔板，每孔50 μ I ;培養(yǎng)12天的NK細胞分別按照效:革巴=10:1、20:1、40:1加入96孔板中，同時設效應細胞和靶細胞自然釋放孔，培養(yǎng)基自然釋放孔，靶細胞最大釋放孔，體積校正對照孔，每孔體積100 μ I，均設3個復孔，250g離心4 min，置于37 V、濃度為5%的CO2中孵育
4h ,在反應結束前45 min靶細胞最大釋放孔每孔加入10 μ I裂解液。反應結束后,每孔吸取50 μ I上清與50 μ I LDH酶反應液置于另一新的96孔板，室溫避光反應30 min，加入反應終止液50 μ 1，酶標儀檢測其OD值。自然殺傷活性％ =(測定管OD值-靶細胞自然釋放管OD值-效應細胞自然釋放管OD值)/ (靶細胞最大釋放管OD值-靶細胞自然釋放管OD值)X 100 %。
[0036]結果如圖3所示顯示，圖中的縱坐標為殺傷率，橫坐標為不同效靶比，可見使用本發(fā)明的方法擴增的NK細胞對Κ562的殺傷率40:1效靶比時達到60%以上。
[0037]實施例3
本實施例是在實施例1的基礎上的優(yōu)選化方案，提供了一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基。本實施例中與實施例1相同的部分，請參照實施例1中公開的內容進行理解，實施例1公開的內容也應當作為本實施例的內容，此處不作重復描述。所述培養(yǎng)方法請參照實施例2。
[0038]本實施例所用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基為RPM1-1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的組成為: RPM1-1640 培養(yǎng)基10 ml
白細胞介素2 (IL-2)20000 IU
白細胞介 I5GL-15)500 ng
白細胞介素7 (IL-7)500 ng白細胞介素12 (IL-12)500 ng
腫瘤壞死因子a (TNF α ) 500 ng。
【權利要求】
1.一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，包括細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和添加于所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的添加因子，其特征在于，所述添加因子包含白細胞介素2(IL-2)、白細胞介15(IL-15)、白細胞介素7 (IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子a (TNFa)和抗CD3抗體。
2.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有175-1750 IU/ml白細胞介素2。
3.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有10-100 ng/ml白細胞介素15。
4.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有10 "100 ng/ml白細胞介素7。
5.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有10-100 ng/ml白細胞介素12。
6.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基含有10-100 ng/ml腫瘤壞死因子a。
7.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法采用10-100 μ g/ml抗CD3抗體包被細胞培養(yǎng)瓶。
8.如權利要求1所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基添加劑還包括5-20 ml來源于自體的血漿。
9.一種如權利·要求1-8所述的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為: 細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基IOml 白細胞介素2(IL-2)17500IU 白細胞介 I5GL-15)IOOng 白細胞介素7 (IL-7)100 ng 白細胞介素12(IL-12)IOOng 腫瘤壞死因子a (TNF a ) 100 ng。
10.一種高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟:采集并分離患者40 ml外周血的單個核細胞，用含10 %自身血漿的培養(yǎng)基重懸細胞，加入到用抗⑶3抗體包被的細胞培養(yǎng)瓶中，細胞因子組合11-2、11^-7、11^-15、11^-12、了即(1刺激，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中孵育，4天后轉瓶并補加含所述細胞因子組合的培養(yǎng)基，第6天轉袋并補充含有IL-2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，即可得到高活性的NK細胞。
【文檔編號】C12N5/0783GK103849599SQ201410099607
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權日:2014年3月18日
【發(fā)明者】吳海濤, 周麗麗 申請人:加思葆（北京）醫(yī)藥科技有限公司