專利名稱：調制激素或其受體活性的肽、抗體、疫苗及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肽、對所述肽特異性的免疫反應分子(IRM)、加入所述肽或IRM的藥用組合物，包括疫苗，并涉及這些在動物中的用途。
背景在過去的三十年，除了遺傳選擇和日糧操縱外，已經(jīng)尋找可供選擇的方法來提高/調節(jié)動物生產(chǎn)的效率；例如增重、提高食物的利用效率、產(chǎn)奶量、羊毛產(chǎn)量、存活率和體軀成分。實現(xiàn)獲得這類結果的技術是基于外源激素的給予和/或轉基因動物的產(chǎn)生。
動物保護的問題和增加的消費者以及政府對外源激素處理和轉基因技術使用的反感已導致研究者探索可供選擇的提高動物產(chǎn)生效率的“無藥物”方法。在過去的十年中，已將注意力集中在利用對操縱內分泌系統(tǒng)的免疫反應的可能性。
在抗體介導的促進或抑制生長、體軀成分、食欲和生殖生理學的科學文獻中已有報道的例子。這些包括黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH；Melmed等，1980)、抑制素(Scanlon等，1993)、生長激素(Pell和James,1995)、胰島素樣生長因子(Pell和Aston,1995)、催乳素(Lindstedt,1994)、生長激素釋放因子(Moore等，1992)、后葉加壓素(Kamoi等，1977)、促生長素抑制素(Westbrook等，1993)、胃泌素(Dockray和Taylor,1976)、縮膽囊素(CCK；Pekas和Trout,1993)、睪甾酮(Thomson等，1985)、孕酮(Kaushansky等，1977)、前列腺素F2α(PGF2α；Crowe等，1995)和促腎上腺皮質激素(ACTH；Wynn等，1995)。
嘗試誘出對“自身”激素的免疫反應的原因是多種多樣的。這包括提高家畜產(chǎn)量的努力；通過提高肉品質量、減少背脂、增進食欲、提高增重、提高產(chǎn)奶量、改變奶成分以及操縱增殖力。另外還有興趣減少與農(nóng)場經(jīng)營有關的勞動需求、克服疾病和獲得更多的內分泌和自分泌相互作用的認識。
在所有以上列出的肽、蛋白和類固醇抗原中，只有兩種基于內源激素的免疫操縱的商用制劑似乎是可用的。它們是Fecundin_和Vaxtrate_，前者為一種雄甾烯二酮抗原，導致生殖力的提高(Scaramuzzi等，1977)，后者為一種LHRH抗原，誘導LHRH的免疫中和作用并導致在牛的卵巢和睪丸中抑制類固醇生成(Hoskinson等，1990)。
發(fā)明概述在逐漸通向本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人生產(chǎn)了一些基于天然激素的肽或天然激素的受體，并將這些給予動物。與佐劑一起給予的所述肽在動物中產(chǎn)生一些顯著的經(jīng)濟效果，諸如提高增重、提高產(chǎn)奶量、提高羊毛產(chǎn)量、肉品質量、食物利用效率等。
因此，本發(fā)明提供一系列肽，它們具有不同氨基酸序列，能誘出特異性抗體，所述特異性抗體在動物中改變一系列生理功能。這些生理功能包括消化、營養(yǎng)吸收和吸收底物的代謝，導致免疫動物的生產(chǎn)能力的提高。特別值得注意的是，胃腸道的改變導致消化的增強以及與此相關的益處。
在第一方面，本發(fā)明提供一種非天然產(chǎn)生的肽，它具有得自或類似于天然的動物激素、載體蛋白、結合蛋白或所述激素受體的氨基酸序列，其中所述的肽在體內能誘出一種或多種能調制所述激素或受體活性的抗體。
術語“非天然產(chǎn)生的”指該肽與通過坦然蛋白合成產(chǎn)生的肽不同，而是由人工產(chǎn)生的肽?？赏ㄟ^標準的肽合成技術、或通過重組DNA技術等生產(chǎn)肽。
術語“肽”指形成至少部分氨基酸的任何分子，其中所述氨基酸通過肽鍵連接。所述肽可能僅由幾個氨基酸組成或可能是多肽。因此，該術語也包括蛋白和微蛋白。構成所述肽的氨基酸可以是天然產(chǎn)生的肽或合成的氨基酸。所述的肽可基本上是氨基酸序列，也可包括諸如碳水化合物或脂肪酸的非氨基酸成分，或包括非天然氨基酸樣結構。
以上用的術語“得自或類似的氨基酸序列”指可能是基于天然序列或類似于天然序列的氨基酸序列的事實。術語“得自”并不表示該肽的實際來源(因為它可能是合成或重組來源)，而是表示肽與所述天然激素或受體至少部分同源。該肽當然是與該天然的激素或受體不同，在于它可以包括其一個片段、或其兩個或更多的非鄰近片段。它也可以包括不存在于天然激素或受體中的其它氨基酸。
術語“天然的動物激素、載體蛋白、結合蛋白或所述激素的受體”指在動物中產(chǎn)生的激素、載體蛋白、結合蛋白或受體。這可以是任何類型的動物，但優(yōu)選脊椎動物，更優(yōu)選哺乳動物。
術語“能誘出一種或多種抗體”指所述肽誘出或刺激似乎主要是抗體介導的免疫應答的能力。也可以有涉及某些細胞介導的免疫。該肽可能本身不能刺激免疫應答，特別是在可能需要存在于載體分子上的小肽的情況下。盡管如此，這種肽仍然落在“能誘出一種或多種抗體”的定義中。
術語“在體內能調制所述的激素或受體的活性”指該抗體在活動物中改變、調節(jié)或變化激素或其受體的活性的能力。這種改變、調節(jié)或變化通常將以下調或抑制激素或受體的形式，雖然也設想諸如激素或受體活性增加的其它作用。
該肽最好沒有生物學活性。雖然它是基于天然激素或受體，但該肽最好沒有那種激素或受體的生物活性。
該肽可以基于任何參與調節(jié)生理功能的激素或受體。
最好是，該肽能誘出對以下激素或激素受體的活性促生長素抑制素、胰高血糖素、胃泌素、縮膽囊素、促生長素抑制素受體、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)。在一個實施方案中，該肽誘出對以下激素的抗體生殖道激素，特別是黃體生成素釋放激素(LHRH)；腎上腺激素，如促腎上腺皮質激素(ACTH)；或胃的激素，如胃泌素和縮膽囊素。
本發(fā)明人已產(chǎn)生了一些基于部分的促生長素抑制素(Patel,1992)、促生長素抑制素受體(SSTR)(Resme & Bell,l995)和胰島素樣生長因子結合蛋白1至4(IGFBP)(Cohick & Clemmons,1993)的肽。
在一個特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供一種氨基酸序列基于促生長素抑制素的非天然產(chǎn)生的肽(SRIF)。該推薦的序列產(chǎn)生優(yōu)先將SSTR2、SSTR3和SSTR5作為靶的抗體，這與促生長素抑制素相反，后者產(chǎn)生與包括SSTR1至6的受體結合的抗體。
本發(fā)明的肽在動物中能增加循環(huán)的胰島素、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的水平，并且增加合成代謝的水平、減少胃的活性、和/或促進消化。
更特別的是，本發(fā)明提供具有由單字母氨基酸密碼代表的以下序列的肽LCFWKTC(SEQ ID NO:1)該肽結合促生長素抑制素受體的SSTR2、SSTR3和SSTR5，并產(chǎn)生顯示出對它們有親和力的抗體。對觀察到的優(yōu)點不希望被任何提出的機制所束縛，但它顯示序列F-W-K-T是阻斷SSTR2、SSTR3和SSTR5的關鍵。
本發(fā)明也涉及SEQ ID NO:1的衍生物或變體，其中該抗原暴露環(huán)的大小和形狀是可能的最小直徑。
SEQ ID NO:1在無菌生理鹽水中是相對可溶的肽。
最好是，該肽以環(huán)化序列存在，如
(SEQ ID NO:2)或
(SEQ ID NO:3)包含核心序列FWKT的該肽也可以通過包括形成二硫鍵的半胱氨酸殘基以外的方式環(huán)化。本發(fā)明環(huán)狀肽的一種特別優(yōu)選的形式是其中連接基團或序列盡可能短的肽，并且該結構的構型是允許包含F(xiàn)WKT的分子的部分與促生長素抑制素受體結合的構型。在一個更特別優(yōu)選的實施方案中，在該環(huán)狀肽中，對應于FWKT序列的空間構型是它占據(jù)最小的空間。理想的是，在由序列FWKT形成的環(huán)狀肽中的弧盡可能的小，并且互補其靶受體。
特別推薦的是刺激對SSTR2、SSTR3和SSTR5具備親和力的抗體產(chǎn)生的環(huán)狀肽。
該肽也可以線性肽單獨存在，如F-W-K-T-S-G-G(SEQ ID NO:4)或以二聚體存在，如F-W-K-T-S-T-K-T-S-T-K-W-F(SEQ ID NO:5)而在再一個實施方案中，本發(fā)明提供免疫原性蛋白或分子，該蛋白或分子包含產(chǎn)生對SSTR2、SSTR3和SSTR5具備特殊親和力的抗體的序列。該蛋白或分子可以是任何類型，只要刺激抗體與受體結合即可。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供一種非天然產(chǎn)生的肽，其氨基酸序列與天然動物激素受體至少部分同源，其中所述的肽在體內能誘出一種或多種能調制所述受體活性的抗體。
在一個特別推薦的方面，本發(fā)明提供一種非天然產(chǎn)生的肽，其氨基酸序列與促生長素抑制素受體(SSTR)的氨基酸序列至少部分同源。這類肽具有提高選自以下的至少一種生物學活性的能力增重；初生重；生長速率；產(chǎn)奶量；循環(huán)胰島素、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的水平；纖維產(chǎn)量；產(chǎn)奶量和肌肉重量。
更特別優(yōu)選的是這樣一種肽，其氨基酸序列與SSTR氨基酸殘基1-11、30-57和/或第六與第七跨膜域同源。已報道所述跨膜域發(fā)生在殘基274-305。對于所有的脊椎動物物種，SSTR的該氨基酸位置對應于SSTR的NH3+末端。最好是基于來自人、豬、牛、小鼠和大鼠的SSTR的肽。所述肽可以基于來自諸如綿羊、山羊、駱駝、馬駝、羊駝、雞、鴨、火雞、鴕鳥、鴯鹋和魚的其它物種。
更特別的是，本發(fā)明提供具有以下由單字母氨基酸密碼代表的序列的肽和其衍生物以及變體SEQ 肽 基于 殘基號ID NO6 MFPNGTASSPS 人 SSTR1 1-117 QNGTLSEGQGS 人 SSTR1 47-578 AEQDDATV人 SSTR1 297-3059 MFPNGTASSPS 小鼠 SSTR1 1-1110QNGTLSEGQGS 小鼠 SSTR1 47-5711AEQDDATV小鼠 SSTR1 297-30512MFPNGTAPSPT 大鼠 SSTR1 1-1113QNGTLSEGQGS 大鼠 SSTR1 47-5714AEQDDATV大鼠 SSTR1 297-30515MDMADEPL人 SSTR2 1-816QTEPYYDLTSN 人 SSTR2 32-4217AISPTPAL人 SSTR2 282-29018MDLVSEL 牛 SSTR2 1-719QTEPYYDLASN 牛 SSTR2 31-4120AISPTPAL牛 SSTR2 281-28921MDMAYELL豬 SSTR2 1-822QTEPYYDLTSN 豬 SSTR2 32-4223AISPTPAL豬 SSTR2 282-29024MEMSSEQL小鼠 SSTR2 1-825QTEPYYDMTSN 小鼠 SSTR2 31-4126AISPTPAL小鼠 SSTR2 282-29027MELTSEQF大鼠 SSTR2 1-828QTEPYYDMTSN 大鼠 SSTR2 30-4029AISPTPAL大鼠 SSTR2 283-29130MDMLHPS 人 SSTR31-71-731AGPSPAGLAVS 人 SSTR3 31-4132PLPEEPAF人 SSTR3 283-29133MATVTYPS小鼠 SSTR3 1-834AGTSLAGLAVS 小鼠 SSTR3 32-4235PLPEEPAF小鼠 SSTR3 284-29236MAAVTYPS大鼠 SSTR3 1-837AGTSLAGLAVS 大鼠 SSTR3 32-4238PLPEEPAF大鼠 SSTR3 284-29239MSAPSTLPP 人 SSTR4 1-940GPGDARAAGMV 人 SSTR4 31-4141TSLDATV 人 SSTR4 282-29042MNTPATLPL 大鼠 SSTR4 1-943SDGTGTAGMV 大鼠 SSTR4 31-4144TSLDATV 大鼠 SSTR4 282-29045MEPLFPA 人 SSTR5 1-746VGPAPSAGAR 人 SSTR5 30-4047ALPQEPAS人 SSTR5 282-29048MEPLSLA 大鼠 SSTR5 1-749VGSASPMGAR 大鼠 SSTR5 33-4350TLPEEPTS大鼠 SSTR5 283-291術語其“衍生物和變體”指基本相同或相似的抗原活性、具有不同氨基酸序列的肽。這類衍生物或變體與以上所列的優(yōu)選序列相比，可以具有氨基酸置換、插入或缺失。典型的置換是那些按照以下表1制備的置換。
表1用于氨基酸置換的適合殘基原始殘基 典型的置換AlaSerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAlaGlyProHisAsn；GlnIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu當通過氨基酸置換衍生所述肽時，所述氨基酸通常被其它具有類似特性(如疏水性、親水性、電負性、大側鏈等)的氨基酸取代。氨基酸置換通常是單個殘基的置換。氨基酸插入通常是按照大約1-10氨基酸殘基的順序，而缺失的范圍是大約1-20殘基。最好是，以鄰近對制作缺失或插入，即兩個殘基的缺失或兩個殘基的插入。
例如，通過用相似氨基酸或氨基酸樣結構置換某些關鍵氨基酸，可變化成環(huán)化或環(huán)狀形式的本發(fā)明的肽。一個特別推薦的序列是NMe-Y-D-T-K-V-F-C-S(SEQ ID NO:51)雖然該序列在無菌的生理鹽水溶液中是非常難溶的。
在懷孕的最后三個月內，用這種分子接種的母畜哺乳的小豬從出生至斷奶比對應的非免疫哺乳障礙的小豬生長平均快40％。
可以以單獨的活性藥劑給予本發(fā)明的肽和免疫活性分子，或與一種或多種其它藥劑一起給予。例如，SEQ ID NO:1可與胃泌素和/或縮膽囊素、連同一種合適的載體一起給予。
在一個實施方案中，諸如SEQ ID NO:2至5的這種序列可以以單獨的肽或以包含特異性導向其它激素(如胃的激素)的序列的一種肽分子共同存在。這種序列的一個例子是A-Y-M-G-W-S-C-T-K-W-F(SEQ ID NO:52)當將該抗原以推薦的傳遞載體(油)注射到生長的羔羊3次時，在84天齡時可檢測到抗-SRIF和抗-縮膽囊素抗體。到此時，免疫羊羔已經(jīng)比未免疫羊羔生長平均多20％。
也可以導向生殖激素，與本發(fā)明推薦的肽一起給予的一個序列的例子是F-W-K-T-S-K-H-W-S-Y-G-L-R-D-G-C(SEQ ID NO:53)用這種肽免疫3次的公豬從12周齡至24周齡比未免疫豬生長平均快12周，并且免疫豬的睪丸大小是那些未免疫動物的睪丸大小的大約50％。
在一個特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供一種非天然產(chǎn)生的肽，其氨基酸序列與胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)至少部分同源。這種肽能調制碳水化合物代謝并因此促進動物的生長。所述肽在糖尿病的預防或治療中也可能有用。
更特別優(yōu)選的是一種肽，該肽在其序列中包括天然IGFBP結合胰島素樣生長因子的部分，最好是至少天然IGFBP的殘基1-10或1-13的某些區(qū)域。所述氨基酸殘基相應于IGFBP的NH3+端。最好是該肽基于來自人、豬、牛、小鼠或大鼠的IGFBP。該肽也可以基于來自其它物種的IGFBP，如綿羊、山羊、駱駝、馬駝、羊駝、雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥、鴯鹋和魚。
而更特別的是本發(fā)明提供具有由單字母氨基酸密碼代表的以下序列中一個的肽或其衍生物或變體。SEQ ID NO. 肽 基于 殘基號54 FRCPPCTERLAA 大鼠IGFBP 11-1255 EVLFRCPPCTPE 大鼠IGFBP2 1-1256 GAGAVGAPVV 大鼠IGFBP3 1-1257 DEAIHCPPCSEE 大鼠IGFBP4 1-12本發(fā)明的肽在本文中可以稱為例如“基于SSTR的肽或基于IGFBP的肽”。肽可以基于一種或多種激素、載體蛋白或激素受體。
此處考慮的肽可以是例如通過固相肽合成化學合成的，或可以通過將所述天然肽經(jīng)受水解或其它化學分裂方法以產(chǎn)生所述分子的片段?；蛘?，所述肽可以通過體內或體外重組DNA合成制備。在這種情況下，所述肽可能需要與其它蛋白一起合成，然后通過化學或酶切割進行后續(xù)分離，或可以多個重復單位合成所述肽或多價肽。產(chǎn)生題述肽的特定方法的選擇將取決于諸如需要的類型、肽的質量和純度以及生產(chǎn)的容易和方便程度等因素。
優(yōu)選本發(fā)明的肽是至少部分純化的。更優(yōu)選該肽為大體上純化的形式。
第二方面，本發(fā)明提供一種對本發(fā)明的第一方面的肽特異性的免疫學活性分子(IRM)。
術語“免疫學活性分子”指能與例如抗原的另一分子或當存在載體上時能作為抗原起作用的肽結合的分子。免疫學活性分子通常是抗體，包括天然產(chǎn)生的抗體、重組抗體、scantibody、包括抗體的融合物或嵌合物的合成抗體以及任何前述抗體的功能片段，例如Fab和F(ab’)2。當抗體IRM是重組形式時，該分子可以由天然產(chǎn)生的或合成的核苷酸序列編碼并在任何方便的表達系統(tǒng)中表達。當該分子是合成的，可通過分步加入單個氨基酸組或抗體的氨基酸片段的方便地制備。至于后者，該合成的抗體可以是包含得自其它抗體的輕鏈或重鏈的融合抗體或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體和其它IRM可以是任何動物來源的，包括來自哺乳動物如人、家畜、同伴動物(compamon animals)、野生動物和實驗室實驗動物(如小鼠、大鼠、兔和幾內亞豬)?！皠游铩笨贵w也可延伸至來自如鳥類的非哺乳動物物種的抗體，所述鳥類例如為雞和其它家禽、鴯鹋和鴕鳥。
所述肽或IRM的結合可以發(fā)生在靶激素受體位點(通常通過生物學活性抗原序列的使用)、或結合在鄰近靶受體位點的細胞膜區(qū)域，在這種情況下該抗原片段無生物學活性。
第三方面，本發(fā)明提供偶聯(lián)于一個適合載體以致形成肽/載體復合物的本發(fā)明第一方面的肽。
該肽/載體復合物是特別有利的，該肽相對較小(分子量不到10,000)并且當單獨給予時無特別的免疫原性。
合適的載體通常是能與所述肽偶聯(lián)的大分子。為了誘出免疫應答，所述肽通常需要與載體蛋白偶聯(lián)，以使該抗原具有顯著的“外來”性，并且以增加該抗原的分子量。通常，似乎載體蛋白對疫苗受者的外源性或免疫原性越強，則抗體應答似乎越大(Meloen,1995)。通常將大蛋白分子，特別是匙孔_血藍蛋白、牛血清白蛋白、細菌毒素、卵清蛋白和甲狀腺球蛋白(見Meloen,1995)用于與小分子量抗原綴合；然而，最好的是多重抗原提呈(MAP)系統(tǒng)，例如聚-L-賴氨酸。
第四方面，本發(fā)明提供藥用組合物，它包含免疫原性有效量的本發(fā)明第一方面的肽或足以賦予被動免疫量的本發(fā)明第二方面的IRM以及藥學上或獸醫(yī)上可接受的載體或賦形劑，并且可選擇地包含佐劑。
在以下的描述中，本發(fā)明的肽稱為“活性成分”。
預期該藥用組合物的活性成分當根據(jù)特定情況的量給予時，在刺激、增強或者促進動物中體液免疫應答方面顯示極好的活性。例如，可以以每天、每周或每月一次或多次或以其它合適的時間間隔給予每公斤體重每目大約0.5μg至大約20mg可以考慮的蛋白，或可以由病情的緊急性顯示的按比例減少劑量。該活性化合物可以通過以方便的方式注射給與、或病毒載體或細菌載體中的遺傳序列給予。
該活性成分也可以以在無菌生理鹽水、甘油、液體聚乙二醇和/或其混合物中、以及在油中制備的分散體給予。在通常的貯存和使用條件下，這些制劑含防腐劑以防止微生物生長。
適合體內給予的藥用形式包括無菌水溶液(當可溶于水時)或分散體，以及為用于無菌注射液或分散體的臨時制劑的無菌粉末。在所有情況下，所述劑型必須是無菌的并且必須是存在容易注射性能的流體。它在生產(chǎn)和貯存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須防止諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。所述載體可以是溶劑或含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的分散介質、其合適的混合物以及植物油。例如通過使用諸如卵磷脂的包衣、通過在分散體情況下維持所需顆粒大小以及通過使用表面活性劑，可以維持適當?shù)牧鲃有浴Ｍㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thormerosal)等可以產(chǎn)生防止微生物的作用。在許多情況下，最好包括等滲劑，例如蔗糖或氯化鈉；或膠凝劑，例如環(huán)糊精、明膠、海藻等。例如通過以藥物延遲吸收組合物使用，可以達到延長注射組合物的吸收作用。
通過在合適的溶劑加入需要量的活性成分與所需的以上列舉的各種其它成分制備無菌注射液，接著進行過濾除菌。通常，通過將各種滅菌的活性成分加入含基本分散介質和以上列舉的所需其它成分的無菌溶媒中制備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術，它產(chǎn)生活性成分加上來自其預先無菌過濾的溶液的任何另外需要成分的粉末。
此處用的“藥學上或獸醫(yī)上可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何和所有的溶劑、分散介質、水溶液、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。用于藥學上或獸醫(yī)上活性物質的這類介質和藥劑的用法是本領域公知的。除了在任何常規(guī)的介質或藥劑都與該活性成分不相容的情況下，設想了其在組合物的使用。也可以在組合物中加入輔助的活性成分。
優(yōu)選所述藥用組合物含與載體偶聯(lián)的所述蛋白。更優(yōu)選該藥用組合物為疫苗制劑形式。
許多物質都可用于運送本發(fā)明的肽或分子。用生理鹽水、弗氏完全佐劑(FCA)、胞壁酰二肽(MDP)、弗氏不完全佐劑(FIA和MDP)、DEAE-葡聚糖和Quill A中的SRIF免疫后，已產(chǎn)生了高水平的抗SRIF的循環(huán)體液抗體。
本發(fā)明也提供本發(fā)明肽的新的傳遞載體，它包含一種得自深海鯊魚的油。因此，在第五方面，本發(fā)明提供一種獸醫(yī)上或藥學上可接受的載體，包含具有免疫佐劑活性的鯊魚油。
所希望的該油是在肺、呼吸道、胃腸道或泌尿生殖道等的上皮表面刺激抗體產(chǎn)生的類型。在一個特別推薦的實施方案中，該油在乳腺粘膜中增強抗體分泌，因此產(chǎn)生免疫活性的初乳或奶。
該油通常包含以下成分烴類 0-2％蠟酯 0-2％游離脂肪酸 2％以下極性脂質 10-15％二酰甘油醚 30-50％三酰甘油 40-70％接近80％的存在的脂肪酸為單不飽和形式。典型的油的脂肪酸的碳鏈長度和比例如下典型分析C141％-2％C15＞1％C1618％-20％C171％-4％C1842％-65％C190.1％-2％C205％-15％C21＞1％C220.1％-18％C230C240％-5％該油最好富含烷氧基甘油，因為它包含通式為CH2OH.CHOH.CH2OR的三酰甘油，其中R是長鏈基，首先并優(yōu)選C16和C18。
在該一般結構中，特別推薦以下的甘油醚20-70％十八碳-9-烯基·甘油基醚3-25％ 十六烷基·甘油基醚1-15％ 十六碳-7-烯基·甘油基醚15-20％十八烷基·甘油基醚1-15％ 二十碳-9-烯基·甘油基醚以下是最好加入該油的成分1-25％ 卵磷脂1-25％ DLα-生育酚醋酸酯0-3％ 1,2,5-二羥基膽鈣化醇0-5％ 維生素A0-40％非礦物油(一般具有三酰甘油結構)第六方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生致免疫組合物的方法，包含將能誘出免疫應答的肽與油接觸并且使所述的肽和油產(chǎn)生適于給予形式的步驟，其中所述的油含30-50％的二酰甘油醚。最好是，該醚包括20-70％十八碳-9-烯基·甘油基醚3-25％ 1-十六烷基·甘油基醚1-15％ 十六碳-7-烯基·甘油基醚15-20％十八烷基·甘油基醚1-15％ 二十碳-9-烯基·甘油基醚1-25％ 卵磷脂1-25％ DLα-生育酚醋酸酯0-3％ 1,2,5-二羥基膽鈣化醇0-5％ 維生素A0-40％ 非礦物油在一個特別推薦的實施方案中，該致免疫組合物包含用該油乳化的一號肽(“FEEDMIZA”)。
術語“致免疫組合物”指能誘出免疫應答的藥用或獸醫(yī)用組合物。這包括疫苗等。可以將該組合物配制為各種給藥的形式，如注射(腹膜內、皮下、肌內或乳房內)、口服、鼻噴霧、皮膚貼劑等。
術語“能誘出免疫應答的肽”指在該組合物中自身為免疫原性的或一旦給予能誘導免疫應答的任何肽。最好是在組合物中使用本發(fā)明第一方面的肽，但諸如細菌和病毒抗原的其它肽也可考慮。
那些本領域的技術人員熟悉可以用來產(chǎn)生免疫原性組合物的方法。該組合物可以包括諸如其它活性成分、藥物或需要的佐劑的其它組分。
第七方面，本發(fā)明提供將能誘出免疫應答的肽輸送到動物的方法，包含給予所述的肽與含下列成分的有效量的油20-70％ 十八碳-9-烯基·甘油基醚3-25％ 1-十六烷基·甘油基醚1-15％ 十六碳-7-烯基·甘油基醚1.5-20％十八烷基·甘油基醚1-15％ 二十碳-9-烯基·甘油基醚1-25％ 卵磷脂1-25％ DLα-生育酚醋酸酯0-3％ 1,2,5-二羥基膽鈣化醇0-5％ 維生素A0-40％ 非礦物油該肽最好用有效量的所述油乳化。
術語“有效量的油”指使該肽能誘出免疫應答、特別是當該肽本身不是免疫原性的或僅誘導低水平的免疫時的有效油量。這個量通常為組合物總體積的大約50至80％，優(yōu)選總體積的60-70％，更優(yōu)選組合物總體積的大約66至67％。
第八方面，本發(fā)明提供在動物中調制一種或多種激素應答的方法，包含給予所述動物激素調制有效量的本發(fā)明第一方面的肽或本發(fā)明第二方面的IRM的步驟。
所述激素應答包括內分泌和/或旁分泌應答。
術語“調制一種或多種激素應答”指在涉及的動物中改變、調節(jié)或變化激素應答。
該動物可以是任何動物，優(yōu)選是脊椎動物，更優(yōu)選哺乳動物。術語動物包括人、反芻動物、鳥類和爬行動物。最好該動物是諸如豬、山羊、駱駝、綿羊、羊駝、馬駝、雞、鵝、鴨、火雞、鴕鳥、鴯鹋、魚的家畜或生產(chǎn)動物或其它經(jīng)濟上重要的動物。
優(yōu)選給予的肽是以上討論的該肽的復合物，優(yōu)選具有多于一個抗原。更優(yōu)選該肽以藥用制劑的形式給予該動物，再更優(yōu)選疫苗制劑。
在一個推薦的方面，本發(fā)明涉及通過給予本發(fā)明的肽或IRM調制對一種或多種的促生長素抑制素、胃泌素、胰島素、胰高血糖素、催乳素、molitin、縮膽囊素、促胰液素、前列腺素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、生長激素和甲狀腺激素的激素應答的方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及在動物中增強胃腸功能的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
術語“增強胃腸功能”指促進關鍵代謝底物的消化和吸收。
在另一方面，本發(fā)明提供在動物中增加合成代謝和/或體重的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
該肽最好是本發(fā)明先前描述的肽。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在動物中增加循環(huán)的胰島素、IGF-Ⅰ和/或IGF-Ⅲ的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在動物中抑制胃酶的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
優(yōu)選該肽是本發(fā)明先前描述的肽。更優(yōu)選該肽是基于SSTR的肽。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在產(chǎn)纖維動物中增加纖維產(chǎn)量并且可選擇地進一步改變次級毛囊與初級毛囊的比例的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
該肽最好是本發(fā)明先前描述的肽。
術語“產(chǎn)纖維動物”指任何產(chǎn)生諸如毛等有用的纖維的動物，并且包括綿羊、山羊、馬駝和羊駝。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在產(chǎn)奶動物中增加產(chǎn)奶量的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
該肽最好是本發(fā)明先前描述的肽。
術語“產(chǎn)奶動物”指任何產(chǎn)生奶為人類消費或為哺乳其幼仔的動物，包括牛、山羊、綿羊、駱駝等。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在動物中降低c-fos基因的性和/或增加c-jun基因活性的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
該肽最好是本發(fā)明先前描述的肽。
在另一個推薦的方面，本發(fā)明提供在動物中改變鈣代謝的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
該肽最好是本發(fā)明先前描述的肽。
我們不希望結合理論，但基于SSTR的肽的給予似乎影響c-fos和c-jun基因的活性并因此影向鈣代謝。這導致改變肌肉功能。例如，用該肽處理的動物在肌肉組織中顯示出保存水能力的提高。提高約為20％。
在一個相關的方面，本發(fā)明提供在動物中刺激對激素、載體蛋白、結合蛋白或激素受體的免疫應答的方法，其中所述的免疫應答調制激素活性，所述方法包含給予所述動物免疫應答誘導有效量的本發(fā)明第一方面的肽的步驟。
在另一個相關的方面，本發(fā)明提供在動物中刺激對激素、載體蛋白、結合蛋白或激素受體的抗體應答的方法，其中所述的應答調制激素或受體的活性，并且其中所述抗體應答導致抗體被分泌到該動物的粘膜上和/或分泌到所述動物的奶中，所述方法包含給予所述動物抗體刺激有效量的本發(fā)明的肽的步驟。
抗體分泌到的粘膜最好是肺、乳房、胃腸道或泌尿生殖道的粘膜。
在又一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，它包含本發(fā)明的新的肽或分子，還可選擇地包含本發(fā)明的免疫佐劑油。本發(fā)明的詳細描述現(xiàn)在將參考以下非限制性附圖和實施例來描述本發(fā)明。


圖1是顯示具有肽抗原的7個分支賴氨酸的多抗原肽(MAP)的圖解表示。
圖2是顯示具有36個肽抗原的16個分支賴氨酸的MAP的圖解表示。
圖3是實施例6中在懷孕和哺乳期的豬的體重的圖解。
圖4是實施例6中小豬體重的圖解。
圖5是實施例9中奶牛的產(chǎn)奶量的圖解。
圖6是實施例10中雞的體重的圖解。
圖7是實施例11中豬的體重的圖解。
圖8是實施例14中雞的體重的圖解。
圖9是實施例15中公豬的體重的圖解。
圖10是實施例15中母豬的體重的圖解。
圖11是實施例16中豬的體重的圖解。
圖12是實施例17中母豬的凈增重、總增重的圖解。
圖13是實施例17中母豬的體重的圖解。
圖14是實施例18中小豬的體重的圖解。
圖15是實施例19中孿生羊羔的體重的圖解。
圖16是實施例19中母羊產(chǎn)奶量的圖解。
圖17是實施例20中奶牛的體重的圖解。
圖18是實施例20中牛犢體重的圖解。
實施例1所述肽的制備用固相自動化肽合成儀(例如Advanced ChemTech ACT 396型、348型或90型)合成肽。
通過分析型HPLC和氨基酸分析儀測定這些肽的純度。通過氨基酸組成分析進一步保證本發(fā)明肽的質量。然后將所述肽凍干，并貯存在-20℃。實施例2酶聯(lián)免疫吸附測定開發(fā)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定在生物學液體；血漿、無脂肪的初乳、奶和胃粘膜中的抗-SSTR或抗-IGFBP抗體。用100μl的含5μgmL-1的SSTR和/或IGFBP抗原和卵清蛋白(Sigma Chemical Co.,StLouis,U.S.A)復合物的磷酸緩中鹽溶液(PBS；pH7.4)在4℃包被多孔板16小時。然后將該抗原包被的板用含5％(w/v)脫脂奶(“咖啡伴侶”；Camation,Nestle,Sydney,Australia)的PBS沖洗三次。為防止偶然的非特異性結合，在室溫下通過每孔分裝100μL的PBS加5％脫脂奶溶液封閉剩余的吸附位點2小時。在“封閉”期終止(2小時)時和以后的步驟中，用含0.1％(v/v)吐溫-20的PBS溶液(PBST)洗所述板三次。向每個孔加入100μL等份的稀釋樣品(1/400 v/v；在PBST中的血漿、無脂肪的初乳或胃粘膜)，并將所述板在室溫下再孵育2小時。然后，向每孔加入100μL等份的山羊抗豬IgG-Fc片段或山羊抗豬IgA-Fc片段(在PBST中1/400(v/v)；Nordic Immunological Laboratories,Tilburg，荷蘭)并將平板在室溫下再孵育2小時。每孔用辣根過氧化物酶綴合的兔抗山羊IgG-H+L片段(Nordic Immunological Laboratories,Tilburg,TheNetherands)在PBS中的100μL的1/400稀釋液加5％脫脂奶終止孵育2小時。在加入底物前，最好的洗滌包括用PBST洗2次然后用蒸餾水洗1次。每孔用100μL的底物[1mM 2,2’連氮基-雙(乙基苯并噻唑啉磺酸酯)的結晶二胺鹽(ABTS；Sigma Chemical Co.,St Louis，美國)和在10mL檸檬酸鹽緩沖液(0.1M檸檬酸，用0.5M Na2HPO4調pH至4.2)中的2.5mM H2O2]使所述板顯色，30分鐘和60分鐘后用Titertek MC讀板儀在450nm讀吸收值。每個樣品重復測試2次，并且每個ELISA板均應包括陽性和陰性對照。
以陽性對照樣品的光密度(OD)讀數(shù)對測試血清的OD讀數(shù)的比值表示在血漿、初乳、奶和消化道粘膜中的抗-SSTR或IGFBP抗體的效價(Steward和Lew,1985；Reynolds等，1990)。將該比值乘以每個樣品的稀釋系數(shù)建立每個產(chǎn)生的同型的相對量。
抗體效價=(測試血清的OD450)×(標準OD450)-1×樣品稀釋度-1用Hoist等(1992a)提出的scatchard圖分析測定抗-SSTR或IGFBP抗體的親和力。實施例3所述肽復合物的制備推薦將多抗原肽(MAP)系統(tǒng)用于將所述抗原提呈/攜帶給免疫系統(tǒng)。這種制備相對小分子量肽免疫原的方法克服了常規(guī)載體系統(tǒng)(即KLH、BSA甲狀腺球蛋白等)的不確定性(ambiguity)。MAP方法產(chǎn)生具有高度均一性的化學定義的肽抗原。結果通過MAP方法制備的免疫原在免疫動物中誘出高的和均一的對該免疫原的抗體應答。這樣，在本申請中描述的提呈抗原的MAP方法特別適于誘出均一的和位點特異性的、對需要的抗原的抗體應答。
歷史上，MAP系統(tǒng)由一個寡聚分支賴氨酸核心組成，通常包括3至7個賴氨酸、和4或8對樹狀臂的肽抗原(見圖1)。然而，在本申請中使用的MAP系統(tǒng)最好是由產(chǎn)生36至40對樹狀臂的肽抗原的18至20個分支賴氨酸核心組成(見圖2)。由于每個肽臂可以由5-20個氨基酸組成，因此該MAP系統(tǒng)的整體外觀是具有高密度表面肽抗原并且分子量超過40,000的大分子。
該MAP系統(tǒng)可用于提呈單獨的單個抗原或其任何抗原組合物。
此外，該抗原/載體系統(tǒng)沒有顯示出明顯的生物學活性，即使活性注射。
用固相自動化肽合成儀(例如Advanced ChemTech ACT 396型、348型或90型)合成在本申請中描述的MAP系統(tǒng)。
然后將該MAP/抗原懸浮于(理想的是乳化)非炎性傳遞載體或免疫刺激物(編碼為NSB-050)。以這種形式，通常通過腹膜內注射或皮下注射給予該產(chǎn)品。該產(chǎn)品也可以乳房內注射、肌內注射或通過口服傳遞。皮下或腹膜內注射后，淋巴系統(tǒng)快速吸收所述乳液，并且提呈給免疫系統(tǒng)。在這一點，在免疫系統(tǒng)的提呈細胞上有各種抗原附著于受體位點，導致產(chǎn)生高效價和親和力的特異性抗體。實施例4傳遞載體已鑒定了一種透明油狀液體在產(chǎn)生抗體中特別有用，所述抗體是在主動免疫動物的肺、胃腸道和泌尿生殖道的表皮表面、乳房的粘膜上分泌的，并且因此隨后在初乳和奶中分泌。而且，當嘗試同時誘出對許多不同抗原的免疫應答時，該傳遞系統(tǒng)(NSB-050)是一種特別有效的免疫刺激劑。
通常，該油具有以下組成二酰甘油醚 30-50％三酰甘油 40-70％極性脂質 10-15％游離脂肪酸 ＞2％烴類 ＞2％蠟酯 ＞2％特別是，該油是以下典型分析的油十八碳-9-烯基·甘油基醚45％(20-70)1-十六烷基·甘油基醚 11％(3-25)十六碳-7-烯基·甘油基醚5％(1-15)十八烷基·甘油基醚 7％(15-20)二十碳-9-烯基·甘油基醚5％(1-15)卵磷脂 13％(1-25)DLα-生育酚醋酸酯 7％(1-25)1,2,5-二羥基膽鈣化醇1％(0-3)維生素A 1％(0-5)非礦物油(植物或動物來源)5％(0-40)該傳遞載體，除了卵磷脂和非礦物油(植物或動物來源)，都是從深海鯊魚的肝中提取的油，特別是從太平洋睡鯊(Somniosus pacificus)和Plunket鯊魚(Centroscymnus plunketi)提取的油。在小于或等于125℃和壓力小于等于666.6Pa下從這些鯊魚的肝中回收所述油。
理想的是，最好從這些鯊魚中新鮮收集肝，因為所述油沒有或含最少量的烴和蠟酯。將切下的肝在新鮮海水或自來水中清洗，然后浸解。將該浸解的團塊放置在室溫(最好是25℃)3小時，然后輕輕倒出該油。通過首先離心，然后用水洗，接著通過用膨潤土或類似材料去蛋白作用的步驟進行油的澄清。再洗該油，然后將其貯存在4℃幾周以沉淀出任何可凍的材料。然后將透明的上清液輕輕倒出，與卵磷脂乳化劑混合，并與任何需要的油溶性維生素混合形成油性傳遞載體。將其貯存在適當?shù)娜萜髦胁⒂玫獨馓幚硪苑乐寡趸?。實施?疫苗的制備將構建的蛋白分子用超聲波攪拌分散到磷酸緩沖鹽溶液(pH7.4)中。(如果該抗原在水相中不溶，并且如果將該蛋白在液體中分散成單個分子，這有助于免疫原的實現(xiàn))。最好將該抗原在鹽水(水相)中混合并用油相以2份油對1份水的比例乳化以產(chǎn)生穩(wěn)定的油包水乳液。理想的是，抗原在水相中的濃縮液是含100μg抗原大分子的3ml劑量的乳液。通常在該劑量中油的量是2ml(大約是疫苗總體積的66.6％)，剩余的1ml是由含磷酸緩沖鹽溶液和抗原的水相構成。實施例6疫苗的給予可通過腹膜內或皮下途徑注射該疫苗(喜歡的話)，但也可以通過乳房內、肌內或口服途徑給予。通常在初次接種后的2周或更長時間給予加強注射(最好為2次)。實施例7給予豬SEQ ID NO:12、14、21、22、36、38、42和44的肽小母豬將30只初產(chǎn)的豬(當?shù)仄贩N×大白豬)與雜種公豬自然交配。在分娩前近10天，將小母豬轉移到維持在接近24℃的封閉的小屋中的產(chǎn)小豬箱中，并通過以12小時黑/光周期的熒光燈人工照明。小豬在嘗試減少一窩產(chǎn)仔數(shù)對產(chǎn)奶量和未成熟小豬隨后生長(King等，1993)的影響，將每窩小豬數(shù)標準化為8只。實驗方法交配前，將小母豬隨機分為六組，每組5只，第一組小母豬接受安慰劑注射，而第2、3、4、5和6組分別對SSTR1(12號和14號肽)、SSTR2(21號和22號肽)、SSTR3(26號和38號肽)、SSTR4(42號和44號肽)和SSTR5(48號和50號肽)免疫。在懷孕期，免疫組和非免疫組在交配后約40、65和90天均在頸部皮下注射3ml對應的疫苗(與MAP偶聯(lián)并在NBS-050中乳化的SSTR1(12號和14號肽)、2(21號和22號肽)、3(26號和38號肽)、4(42號和44號肽)和5(48號和50號肽))。
從交配到分娩，從那時起至分娩后3周出現(xiàn)的斷奶，每周測定小母豬/大母豬的體重。分娩后，立即記錄小豬的初生重，并且此后以每周間隔測定體重直至斷奶，由此至5周齡。
在分娩后第3天通過母畜將8只小豬被動免疫，而將另外8只對照小豬用外科手術修正以確定胃的酸度、入口血流、血漿激素和響應以10μg體重-1小時的速度靜脈內輸注的五肽胃泌素的MCA。來自每組的另外8只小豬在分娩后第21天作類似的處理。結果對大母豬免疫的作用在注射部位沒有明顯的損傷或任何可能導致影響免疫組或對照組大母豬的接種方式損害的副作用。體重大母豬如圖3所示，那些對SSTR2(21號和22號肽)、SSTR3(36號和38號肽)、SSTR4(42號和44號肽)和SSTR5(48號和50號肽)抗原免疫的小母豬在分娩時明顯比對應的對照組大母豬更重并且在接著的哺乳期趨于失去更多的體重。小豬對免疫的或對照的大母豬，小豬的總數(shù)(死的或活的)和每窩中生下的雌性和雄的數(shù)量沒有明顯區(qū)別。
來自用SSTR2(21號和22號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)免疫的大母豬的小豬，出生時明顯比對應的來自對照組大母豬或用SSTR1(12號和14號肽)和SSTR4(42號和44號肽)免疫的大母豬的小豬重(見表2)。
小豬生長的數(shù)據(jù)總結在表2和圖4。從出生3周后，來自在懷孕期用SSTR1(12號和14號肽)、SSTR2(21號和22號肽)、SSTR3(36號和38號肽)、SSTR4(42號和44號肽)和SSTR5(48號和50號肽)免疫的大母豬的小豬比對應的來自未免疫母畜的小豬明顯生長快。這種來自免疫大母豬的小豬在生長速率上的區(qū)別在整個實驗過程中維持，以致于在五周齡時，來自免疫母畜的小豬比那些來自對應的對照大母豬的小豬重20-30％。
在整個實驗過程中，對兩種性別小豬的上述區(qū)別都是明顯的。因此，免疫大母豬的雄性和雌性小豬比來自對照大母豬的小豬的生長明顯快(P＜0.01)。在血液、初乳和消化道刮屑中的抗體免疫和對照的大母豬初乳中抗SSTR1(12號和14號肽)、SSTR2(21號和22號肽)、SSTR3(36號和38號肽)、SSTR4(42號和44號肽)和SSTR5(48號和50號肽)抗體的平均效價顯示在表3中。表3總結了在胃灌注前和后收集的小豬的血漿和消化道刮屑中，在第3天和第21天研究的抗-SSTR抗體的效價。在整個研究中，在未免疫大母豬的初乳中或在對照母畜哺乳的小豬的血漿和胃粘膜中均未檢測到對SSTR的抗體。相反，在分娩后第3天和第21天，在所有免疫大母豬的初乳和免疫母畜哺乳的小豬的血漿和粘膜的刮屑中均檢測到高效價的SSTR抗體。
在分娩時或接近分娩時，從免疫大母豬收集的初乳中的抗-SSTRIgG抗體的效價明顯比檢測到的抗-SSTR IgA抗體的水平高(P＜0.01)。在免疫母畜哺乳的小豬的粘膜刮屑中記錄到與IgA抗-SSTR抗體相比的IgG抗SSTR抗體水平具有相似的差異；這在21天齡的小豬比3天齡的小豬更明顯。相反，在第3天第21天免疫的小豬的血漿中測定的IgG和IgA抗-SSTR抗體的效價沒有明顯的區(qū)別。而且，在分娩后的3天和21天，在免疫小豬胃粘膜中測定的IgG抗體的水平與在血漿中檢測的水平?jīng)]有明顯不同(P＞0.1)。然而在所有的時間，對那些來自免疫大母豬的小豬血漿中的抗-SSTR IgA抗體的效價均比在胃粘膜中檢測的水平高(P＜0.05)。大母豬的飼料吸收從分娩到斷奶的全過程，免疫的和對照的大母豬均吃完了所有提供的飼料。因此，免疫大母豬用于哺乳小豬生長和/或產(chǎn)奶量的食物利用效率明顯比對照組大母豬高(P＜0.05)。激素和胃的功能收集的來自超過3周直至斷奶的小豬的血漿樣品顯示免疫的或對照的大母豬哺乳的小豬在生長激素、甲狀腺激素或胰高血糖素的濃度上沒有明顯區(qū)別。然而，免疫小豬的胰島素和IGFⅠ和Ⅱ的循環(huán)濃度的水平明顯比相應的對照組小豬高。
對那些免疫大母豬哺乳的小豬，觀察到的五肽胃泌素刺激后的胃酸分泌量的水平明顯比對照的母畜哺乳的小豬延遲。而且，在這些小豬中，關鍵的胃酶的活性被抑制。從這些研究中獲得的結果提示阻斷SSTR1至5的抗體改變消化道功能并因此增強消化。實施例8給予綿羊SEQ ID NO:18、20、36、38、48和50的肽在懷孕的40天隨機選擇20只懷孕的美利奴羊，并劃分成10只的兩組；免疫組和對照組。在懷孕過程中，在懷孕的約第90、110和132天在頸部皮下給予免疫母羊3m1的NSB-050中的抗原乳液。對對照組母羊在相應的時間給予安慰劑注射。包含SSTR2(#18和20號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)的用于免疫的抗原分別與MAP系統(tǒng)偶聯(lián)并相伴給予。
在斷奶時(分娩后3個月)，對免疫母羊和相應的對照的母羊，在體重上沒有明顯區(qū)別。那些免疫母羊哺乳的羊羔的體重比那些對照母羊哺乳的羊羔的體重重大約20％。
在懷孕期和以后的哺乳期，免疫母羊的羊毛產(chǎn)量比對照的母羊高大約10％。而且，吃來自免疫母畜的初乳/奶的羊羔的羊毛產(chǎn)量比相應的對照組羊羔提高大約20％。另外，從免疫羊羔的收獲的羊毛明顯比從對照組的羊羔收獲的羊毛細。假設那些免疫母畜哺乳的羊羔的營養(yǎng)狀態(tài)的改善導致初級和次級毛囊的群體更大，從而導致在羊毛特征上的變化(見表4)。實施例9給予牛SEQ ID NO:18、20、36、38、48和50的肽從一個牧群選擇20只懷孕的肉用小母牛，并分為10只的兩組；免疫組和對照組。在懷孕的約5、7和8個月，在免疫母牛的頸部皮下注射與在NSB-050中乳化的MAP系統(tǒng)偶聯(lián)的SSTR2(#18和20號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)抗原的復合物。剩余的10只牛在相應的時間在頸部皮下給予安慰劑注射。在出生時，來自免疫母牛的小牛明顯比對應的來自未免疫母牛的小牛重(38對46kg；P＜0.05)。在10周中，對SSTR 2(18號和20號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)免疫母畜哺乳的小牛明顯比來自對照母牛的小牛生長快(達約10-15％)。實施例10給予綿羊SEQ ID NO:18、20、36、38、48和50的肽將24只雜種母羊(美利奴羊×陶賽特有角羊)分為2個處理組；免疫的(n=12)和對照的(n=12)。在免疫母羊的頸部皮下注射與在NSB-050中乳化的SSTR2(#18和20號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)肽的復合物和MAP，剩余的母羊接受安慰劑注射。在懷孕的大約90、110和130天給予母羊相應的注射。在從分娩時起的6周時間內，免疫母羊明顯比未免疫母羊產(chǎn)生更多的奶(20％)(見圖5)?！略黾拥氖秤荒芤饘γ庖吣秆蛴^察到的產(chǎn)奶量的增加，因此免疫母羊比對照的母羊能更有效地利用它們的飼料。實施例11給予雞SEQ ID NO:27、29、36、38、48和50的肽將40天大的雞隨機分成2個處理組；免疫組和對照的。免疫雞在1天齡進行腹膜內注射，接著在7天齡和14天齡口服給予加強接種的與在NSB-050中乳化的MAP系統(tǒng)偶聯(lián)的SSTR2(#27和29號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)的復合物。對照組的雞在對應的部位和時間接受安慰劑注射。
在初次接種后的前4周，免疫雞明顯比對應的對照組雞重，以至在實驗終止時免疫雞比對照的雞重約24％(見圖6)。
在21天齡和42天齡從每組雞中隨機選擇代表部分的雞(n=5)安樂死以進行肌肉分析。解剖來自每只雞的翼部肌肉。在21天齡和42天齡從免疫雞獲得的濕肌肉的產(chǎn)量比對照的雞分別重23％和30％。雖然觀察到的免疫雞的翼肌質量比對應的對照雞重，但每克其肌肉組織的RNA的總得率明顯低于相應的對照雞。當對來自兩組雞翼肌的等量回收的DNA測定c-fos和c-jun基因時，觀察到相對于對照組的雞，c-fos基因的拷貝數(shù)被明顯抑制，而c-jun基因增加。
本研究的結果表明，抗SSTR2(27號和29號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)的接種增加免疫雞的增重。而且，顯然免疫后明顯改變了關鍵肌肉系統(tǒng)的細胞間機制。所述免疫方法導致轉錄調節(jié)基因c-fos的抑制并放大c-jun基因的活性。假設對相對于對照組的免疫組觀察到的這些基因活性的變化與導致信號轉導途徑變化的蛋白轉錄與蛋白結合關系的改變相關，并因此增加鈣代謝。實施例12給予豬SEQ ID NO:21、23、36和38的肽將20只6周大的雜種公豬隨機分成2個處理組，免疫組和對照的組。在42天齡、63天齡和84天齡在豬的頸部皮下或者注射與在NSB050中乳化的MAP系統(tǒng)偶聯(lián)的SSTR2(21號和23號肽)、SSTR3(36號和38號肽)和SSTR5(48號和50號肽)抗原的混合物，或者注射安慰劑。在實驗終止時(20周齡)，對SSTR免疫的豬明顯比對應的對照的豬重(91.5對83.5kg)(見圖7)。實施例13給予大鼠SEQ ID NO:54至57的肽將20只實驗室大鼠隨機分成2個處理組；免疫組和對照的組。將免疫大鼠在股內側皮下注射與懸浮在NSB050中的MAP系統(tǒng)偶聯(lián)的3ml含100μg的本專利描述的IGFBP1(47號肽)、IGFBP2(55號肽)、IGFBP3(56號肽)和IGFBP4(57號肽)抗原混合物的乳液。對照的大鼠接受在股內側皮下給予的安慰劑注射。所述大鼠以21天的間隔用相應的疫苗給予3次加強注射。在該研究期間收集血液樣品，進行抗體效價測定和關鍵代謝物和激素濃度的測定。在該研究期間，那些用IGFBP抗原免疫的大鼠明顯比對應的對照的大鼠生長快，并且葡萄糖(2.5對4mM)和胰島素(20對30ng/ml)的濃度被抑制。以上的接種疫苗制度可能對Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的葡萄糖代謝具有意義深遠的影響。實施例14給予雞SEQ ID NO:1(LCFWKTC)的肽所述肽和傳遞載體在下文稱為FEEDMIZA方案將剛出殼1天大的小雞隨機分成以下的組。A組未免疫的(n=30)B組皮下免疫(n=30)C組腹膜內免疫(n=30)在出殼時和21天齡時進行免疫。該FEEDMIZA劑量是在0.1ml乳液中的80μg的肽。
在49天，將每個實驗組的動物處死。除收集血液外，還收集膽汁和消化道刮屑進行以下的抗體分析。結果在實驗的終末記錄小雞的最重平均體重。對C組，該重量為2.19±0.057kg。對B組和A組平均體重分別為2.07±0.049kg和1.95±0.047kg。每組間的差異為統(tǒng)計學顯著的(P＜0.05)。通過腹膜內途徑免疫的雞比未免疫雞大約重12.3％。那些通過皮下途徑免疫的雞比未免疫雞平均重7.2％。分別在100％和60％的得自C組和B組的膽汁樣品中檢測到對FEEDMIZA抗原的抗體。在A組雞的膽汁中沒有檢測到對該抗原的抗體。在100％的C組雞和50％的B組雞的消化道刮屑中檢測到抗體，而在A組雞的消化道刮屑中沒有檢測到抗體。
在100％的B組雞和40％的C組雞的血液中檢測到抗體，而在A組雞的血液中沒有檢測到抗體。結論和討論用FEEDMIZA制劑免疫后在宰殺時，觀察到體重明顯增加，最重的組是那些通過腹膜內途徑接受免疫接種的組。所有來自腹膜內免疫組的測試雞在膽汁和消化道刮屑中均顯示有抗體，但在血液中只有其中40％顯示有抗體，這具有潛在的重要性。
相反來自B組的雞明顯比未免疫雞增重多，但明顯比通過腹膜內注射免疫的雞增重少，所有的組的雞在血液中都顯示有抗體，但僅其中的半數(shù)在膽汁和消化道刮屑中有抗體。
這提示通過腹膜內途徑免疫的雞具有與那些通過皮下途徑接種的雞不同的免疫應答。腹膜內免疫刺激抗體通過膽汁(分泌的抗體)流到腸的表面。需注意的是在腸粘膜的表面有許多由FEEDMIZA靶向的激素的受體，并且這些受體比在血液中循環(huán)的抗體更適合于或有利于抗體阻斷。
這個實驗強調，在血液中依賴于對特定激素的高水平抗體的測定的免疫調節(jié)可能是把重點放在錯誤測定上。如果在本實驗中僅收集血液樣品來監(jiān)測免疫刺激，那么可能可論證在腹膜內免疫的雞中沒有免疫刺激的爭論，因為沒有測定到循環(huán)的抗體。然而，在膽汁和消化道刮屑中存在的抗體則表明結果正相反。值得注意的是，在具有100％陽性發(fā)生率的抗體的組中在宰殺時體重最重，而在接近50％的雞膽汁和消化道刮屑中顯示抗體的組介于兩組的中間，而沒有消化道和膽汁抗體的未免疫組表現(xiàn)出最低的重量。實施例15給予豬SEQ ID NO:1的肽方案將來自12窩的小豬在4周齡斷奶并隨機分成4個處理組，每組包括12只雄性和12只雌性小豬。每只小豬單獨在耳朵標記并稱重。處理組是A組對照組-傳遞載體的安慰劑注射B組通過皮下途徑免疫C組通過腹膜內途徑免疫D組通過肌內途徑免疫用于以下實驗的抗原是與實施例14中用的抗原相同的抗原。在有機化學實驗室構建微蛋白。將它保持在-20℃直至將它溶解在pH=7的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，在用于豬前將其乳化在油性佐劑中。
用于本實驗疫苗的所有劑量均是含80μg抗原的3ml乳液。隨意選擇該劑量，并且堅持使用，由于照這樣已獲得成功。
免疫組接受含80μg抗原的FEEDMIZA。安慰組接受無抗原的3ml乳液。在5、8和12周齡給豬注射。
將豬在常規(guī)斷奶、生長和肥育豬圈中飼養(yǎng)。給它們無限量地提供斷奶期、生長期和肥育期飼料。
該實驗進行至豬達到161天齡(21周)。在4、8、10、12、15、16和21周齡將豬單獨稱重。結果各處理組在21周齡的體重和平均每日增重列在表5(雄性)和表6(雌性)中。
圖9和10顯示在實驗過程中不同齡的公豬和母豬的各自的體重。討論與安慰劑注射的豬比較，通過皮下途徑免疫的豬在21周齡的體重更重(公豬21.69％，母豬13.04％)，在統(tǒng)計學上是顯著的。從圖9和10顯示，對公豬直至12周齡左右在每日增重上都沒有可檢測的傾向。在6周齡時，通過肌內和腹膜內途徑免疫的豬明顯比通過皮下免疫的或安慰劑注射的組輕。然而，到了10周齡時，在任何組的重量上均沒有明顯差別。
在母豬的情況中觀察到相同的傾向，除了在6周齡(第一次免疫/注射2周后)時安慰劑組豬明顯比所有其它處理組均重。在10周齡時，皮下免疫組明顯比肌內和腹膜內免疫組重，就象它們相應處理的公豬一樣，與安慰劑組重量相似。在12周齡時，所有的雌性處理組重量幾乎相同，在公豬中發(fā)生這一現(xiàn)象要早幾周。
結論是，用FEEDMIZA疫苗對豬的免疫，特別是通過皮下和腹膜內途徑免疫在公豬和母豬中均產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著的應答，主要在該實驗的最后6-8周測定到該益處。實施例16SRIF和SEQ ID NO:1肽在小母豬中的作用設計該實驗以測定在首次懷孕時，通過皮下途徑用FEEDMIZA接種懷孕的豬的作用。利用機會比較對FEEDMIZA的應答與對SRIF綴合疫苗的應答，SRIF綴合疫苗在與No.1肽相同的傳遞載體中傳遞。對這個比較，抗原的量標準化為100μg的以SRIF綴合物的SRIF，和100μg的FEEDMIZA抗原。方案選擇24只當?shù)仄贩N×大白母豬雜交的豬，交配并置于常規(guī)的干燥豬圈中。將它們隨機分成3個處理組，即A組未免疫對照組B組用FEEDMIZA免疫組C組用SRIF綴合物免疫組在交配時將小母豬通過在頸部皮下注射3ml相應的抗原免疫。
將所述動物置于常規(guī)的單個干燥豬圈中。在懷孕30天時，處理組減少至每組5個證實懷孕的動物。在懷孕的第6、9和12周進行隨后接種。從交配至分娩，每只小母豬每天喂3kg飼料(Breedmore大母豬日糧，Barastoc,Melbourne)。每只動物在交配時及以3周的間隔稱重直至分娩。結果任何的免疫不論是作為在注射點的組織反應還是在健康和行為上的一般影響，均未發(fā)現(xiàn)不良的作用。用FEEDMIZA免疫的豬到懷孕中期(mid-pregnancy)時基本上更大，特別是更高。
不同處理組的平均重量和標準差見圖11。直至懷孕的12周在任何組間沒有統(tǒng)計學差異。在12和15周，B組的動物在統(tǒng)計學上明顯比未免疫的和SRIF免疫的組重(P＜0.05)。從懷孕的9周起，SRIF免疫組有比未免疫大母豬重的傾向，但在任何點，該區(qū)別都沒有顯著的統(tǒng)計學差異(更大量的動物可能監(jiān)測到統(tǒng)計學差異)。
在分娩時，未免疫大母豬平均每頭增加60kg，已吃了115×3kg的飼料(345kg)，并且以5.75∶1的比例將飼料轉換為增重。FEEDMIZA免疫的大母豬也消耗了345kg飼料，但在懷孕中平均每頭增加138kg，效率比為2.5∶1。SRIF免疫組在試驗期間平均每頭增加75kg，飼料轉換為增重的效率比為4.6∶1。討論和結論SRIF結合的疫苗不能成功地調制有統(tǒng)計學意義的生長，但FEEDMIZA制劑明顯提高增重。顯然FEEDMIZA抗原和SRIF結合抗原在調制懷孕大母豬生長的作用上非常不同。
用FEEDMIZA制劑免疫的大母豬基本上比SRIF免疫的和未免疫的大母豬更好地將飼料轉化為增加。
這個實驗顯示，在尚未達到成熟體重的懷孕母豬中主動產(chǎn)生的對FEEDMIZA的抗體，誘導對增重速率和飼料轉化率的改善。值得注意的是，在每日基礎上喂這些豬測定量的飼料，因此這些抗體對自動飼料攝入的作用將不影響觀察的結果。這個改善必須或者來自增強的消化或吸收，或者來自吸收營養(yǎng)的利用。
提供給這些大母豬的4種免疫可能多于取得成功的免疫調節(jié)的需要。選擇該制度以保證在所有的時間在所有動物中均存在高水平的抗體，因為目的是測定在調節(jié)所述性能中抗體的效力。一個更實際的制度可能是在選擇、在懷孕的證實和在轉移至產(chǎn)房時接種。進一步的實驗可以表明每次懷孕少于3次的接種產(chǎn)生可接受的結果。實施例17SRIF和SEQ ID NO:1肽對小豬的作用這個實驗是實施例16的實驗的繼續(xù)。它設法觀察在哺乳期直至斷奶小豬增重的速率，所述小豬是那些在懷孕時用FEEDMIZA免疫或用SRIF結合疫苗免疫的母畜的小豬，用未免疫大母豬飼養(yǎng)的小豬作為對照。方案來自實施例16的大母豬沒有任何進一步的免疫或操縱繼續(xù)飼養(yǎng)，除了a)從分娩至斷奶21天后，每日提供的飼料增加至每頭6kg。
b)分娩后3天，將每頭大母豬的小豬數(shù)目減至8只，以保證在實驗中的每窩豬得益于產(chǎn)奶量和吸收可能存在于奶中的任何抗體的聯(lián)合作用，避免不同的一窩產(chǎn)仔數(shù)、社交相互作用和乳頭的競爭的混雜影響。在斷奶時給大母豬稱重。
在出生時分別鑒別小豬，在出生時和每7天稱重直至在21天齡斷奶。在3天齡所有小豬接受常規(guī)口服劑量的廣譜抗菌素(Tribrissen小豬懸液，Intervet,Melbourne)，以及肌內補充鐵注射(Pignaemia,Intervet,Melbourne)。
在所有時間無限量地給予大母豬和小豬水。結果在3周的哺乳期內未免疫的大母豬的平均體重下降10.8kg，與之相比，在懷孕期間用SRIF結合疫苗免疫的大母豬同樣下降12kg。在懷孕期間用FEEDMIZA免疫的組平均喪失33.8kg，具有顯著的統(tǒng)計學差異，結果見圖12。
在分娩和斷奶時大母豬的重量為
斷奶時的重量(kg) 產(chǎn)仔時的重量(kg)重量損失未免疫大母豬 157.6±24.2 146±33.3 6.8SRIF免疫大母豬 166.4±26154±27.68 7.2FEEDMIZA免疫大母豬 219.8±20.44 186±18.05 15.4
該結果也表示在圖13a和13b。
注意到用FEEDMIZA疫苗免疫的大母豬產(chǎn)奶量多，如乳頭不斷地漏出大量的奶證明的，特別是在哺乳的第一周。討論和結論在哺乳期大母豬失去重量，不管在懷孕期間它們是否被接種。這明顯是對哺乳要求的反應，這與供給的增加的日糧不充分符合。然而，在懷孕期間用FEEDMIZA免疫并如先前實驗報道的在懷孕期體重明顯增加的哺乳期大母豬，失去的重量大小是在未免疫的或SRIF結合免疫的大母豬的兩倍。如圖13所示，這是一個與用任何其它兩種處理制度觀察到的形式驚人不同的形式。對這種重量的顯著喪失的一個可能的解釋是，通過作用于腦垂體或乳腺的抗-FEEDMIZA抗體、或通過正常存在的抑制機制的抑制、或通過這兩者激發(fā)另外的哺乳刺激。在本實驗中不可能測定這些大母豬的產(chǎn)奶量，但是乳房的觀察提示產(chǎn)生了大量的奶。在綿羊中的平行研究已證實，因為在哺乳期間測定到奶輸出量增加20％是與在懷孕期間用FEEDMIZA免疫的種相關。懷孕期間用FEEDMIZA免疫可能導致在所述動物中從分娩至斷奶的3周期間產(chǎn)生抗體，并且這是通過直接或間接的方式造成刺激產(chǎn)奶量增加的原因，因此在大母豬從保留的儲備再分配營養(yǎng)到奶產(chǎn)品中時產(chǎn)生生理需要。
懷孕/哺乳的豬潛在的生產(chǎn)特征(增重或產(chǎn)奶量)的提高似乎與所述FEEDMIZA抗體相關。因為這些功能都涉及鈣、碳水化合物和特別是蛋白質的代謝，這些結果表明，產(chǎn)生的對SRIF-綴合物的抗體在促進增重方面不如抗-FEEDMIZA抗體有效。假設用FEEDMIZA對懷孕的豬免疫，導致涉及這些關鍵代謝物正常代謝途徑效率的提高。尚不清楚所述抗體的作用是否是刺激，或它是否通過正常抑制機制的消除而發(fā)生。實施例18分娩前的大母豬免疫后SRIF和SEQ ID NO:1肽的作用本實驗設法研究分娩前大母豬用SRIF綴合疫苗或FEEDMIZA疫苗免疫，對隨后其吃奶仔豬至3周齡斷奶時和斷奶后時期增重形式的作用。
本實驗監(jiān)測先前實驗的被試小豬。方案將處理組(未免疫需、SRIF綴合物免疫組和FEEDMIZA免疫組)中的5只大母豬中每頭的小豬(每窩8只)單獨耳朵標記以便識別，在出生時、7、14、21天(斷奶的天數(shù))和35天齡(斷奶后2周)稱重。
在哺乳期間，小豬已準備利用由紅外線燈溫暖的爬行區(qū)，在18-21天齡期間利用無限量的飲水和爬行飼料顆粒(Barastoc,Melboume)。在哺乳期間它們沒有利用它們母親的飼料。
在斷奶時，將每窩小豬放在50％的地板作睡眠區(qū)和50％編織絲網(wǎng)的平板斷奶籠中。給該籠裝備含與斷奶前3天提供給小豬的飼料同樣的爬行/斷奶飼料的小筒喂食器。無限量供給飼料和新鮮的飲水。結果小豬的平均初生重為ⅰ)未免疫大母豬產(chǎn)下的1.22±0.61kgⅱ)SRIF免疫大母豬產(chǎn)下的1.40±0.29kgⅲ)FEEDMIZA免疫大母豬產(chǎn)下的1.58±0.21kg由FEEDMIZA免疫大母豬產(chǎn)下的小豬在統(tǒng)計學上比其它組大母豬產(chǎn)下的那些小豬(彼此無統(tǒng)計學差異)重(P＜0.05)。
在斷奶時小豬的體重為ⅰ)未免疫大母豬哺乳的小豬6.05±0.63kgⅱ)SRIF-免疫大母豬哺乳的小豬7.32±1.30kgⅲ)FEEDMIZA免疫大母豬哺乳的小豬8.30±1.13kg每個處理組間平均體重的差別為統(tǒng)計學顯著性的(P＜0.05)。
斷奶后2周小豬的體重為ⅰ)未免疫大母豬哺乳的小豬7.58±0.66kgⅱ)SRIF-免疫大母豬哺乳的小豬8.89±1.33kgⅲ)FEEDMIZA免疫大母豬哺乳的小豬10.62±0.81kg這些平均體重相互間都有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
每個處理組小豬的平均體重見圖14。討論和結論與未免疫大母豬比較，用SRIF綴合抗原或用FEEDMIZA免疫懷孕的大母豬，導致由這些母畜哺乳的小豬的增重速率增加。這提示以增加產(chǎn)奶量為目的的動物的免疫操縱是可能的。在出生、斷奶和斷奶后2周的觀察點，用FEEDMIZA疫苗對懷孕大母豬免疫，產(chǎn)生的哺乳3周的小豬比由或者未免疫大母豬或者SRIF-免疫大母豬哺乳的小豬更重，具有統(tǒng)計學顯著性。這個觀察提示，用FEEDMIZA取得的免疫操縱方法比用SRIF綴合物的方法更有效。實施例19給予綿羊SEQ ID NO:1的肽綿羊已成為用種類繁多的激素免疫調控的大量公開嘗試的被試者。綿羊具有許多類似于豬生產(chǎn)周期的生產(chǎn)特征，即相對短的懷孕期、吃奶幼仔增重速率快、以及相對短的哺乳期。它們是相對容易測定產(chǎn)奶量的動物，并且它們容易屈從為測定抗體、循環(huán)激素或代謝物的血液收集。
以下的實驗比較FEEDMIZA免疫動物與未免疫對照動物的應答。
由于奶排出的刺激(因此可測定產(chǎn)奶量)依賴于用力的吸吮和所產(chǎn)生的奶完全排出，因此最好是用有孿生羊羔的母羊。在一種已知高孿生系的成年母羊中進行涉及測定產(chǎn)奶量的研究，保證有足夠數(shù)目的懷雙胞胎的母羊可用于實驗。實驗1設計本實驗以測定在懷孕期間免疫3次懷孕的美利奴母羊的影響，并與未被免疫相應母羊羊羔比較在第一次免疫時、產(chǎn)羔時和在產(chǎn)羔后6周“斷奶”時母羊的重量。方案將在用陰道內海綿(Repromap；Upjohn,Australia)同步化后預先交配的20只美利奴母羊，給予肌內注射的孕馬血清促性腺激素(Folligon,Intervet,Melbourne，澳大利亞)。取出海綿時，在懷孕60天時隨機將動物分成10只的兩組(待免疫組和保持不免疫的組)。用超聲波掃描儀證明動物懷雙胞胎羊羔。
懷孕期間將懷孕的母羊作為單群羊保持在草地上。在懷孕的最后4周期間，提供紫花苜蓿干草自由選擇。所述羊產(chǎn)羔后立即將它們移至室內，并提供每天2.5Kg的4∶1的切細的紫花苜蓿秸稈和碾碎大麥的混合物直至6周齡，在這時總結實驗并將母羊和羊羔放到牧場。
在懷孕的90、110和132天將待免疫母羊在脅腹皮下注射3ml的FEEDMIZA。
在第一次免疫時、出生時和6周齡斷奶時記錄母羊的體重。在出生時和斷奶時記錄羊羔的體重。
如Wynn等(1988)描述的，在母羊的第一次免疫、產(chǎn)羔和斷奶時，以及羊羔斷奶時以中間一側小塊收集羊毛樣品(100平方厘米)。通過組織學檢查在出生、1周齡和斷奶時收集的核心樣品，分析毛囊密度和類型。
在哺乳的最初6周每周1天通過將阻止羊羔接近母羊6小時，測定產(chǎn)奶量。阻止羊羔6小時后，將母羊人工擠奶，記錄奶的總量。取10ml該奶樣品用于分析，并且將剩余的奶用與連接到排出含該奶小袋的豬圈的乳頭人工喂給羊羔。結果免疫組在第一次免疫時母羊的重量是57.3±2.4kg，而未免疫對照組母羊重量為57.5±2.7kg。在出生時，免疫母羊重53.2±3.0kg，而未免疫組重51.8±2.7kg。在斷奶時，免疫母羊重55 2±3.1kg，而未免疫組重52.7kg。在本實驗的任何階段，所述母羊重量之間沒有統(tǒng)計學顯著的差異，在羊羔的初生重上也沒有任何顯著差異(免疫組為4.4±0.11kg，與之比較那些未免疫組為4.4±0.08kg)。在斷奶時，未免疫母羊的羊羔重量為6.72±0.8kg，而免疫母羊的羊羔重量為8.07±1.0kg，如圖15所示。這個體重上的差異為統(tǒng)計學顯著(P＜0.05)。
記錄的母羊產(chǎn)奶量表示在圖16，并且顯示免疫母羊的產(chǎn)奶量在每個觀察中都多大約20％。
每次收集奶時，在從處理組收集的樣品中測定的奶脂肪、奶乳糖或奶蛋白水平均沒有顯著的統(tǒng)計學差異。在分析上一周一周地有微小的差異。
在懷孕期和哺乳期間，來自免疫母羊的羊毛產(chǎn)量比來自未免疫母羊的羊毛產(chǎn)量重大約10％。吃免疫母羊奶的羊羔的羊毛產(chǎn)量比吃未免疫母羊奶的羊羔產(chǎn)生的多20％。另外，從免疫母羊的羊羔收獲的羊毛明顯比未免疫母羊的羊羔觀察到的細。免疫母羊的羊羔具有更大密度的次級和初級毛囊。討論和結論用FEEDMIZA免疫懷孕母羊，導致羊羔以比觀察到的通過未免疫母羊產(chǎn)生的羊羔更快的增重速率生長。這明顯與通過母羊產(chǎn)生的奶量更大有關。免疫母羊產(chǎn)生的奶與未免疫母羊的奶比較分析正常，并且因此營養(yǎng)價值相等。在懷孕期和哺乳期，免疫母羊產(chǎn)生更多的凈毛，提示在懷孕期(提高羊毛產(chǎn)量)和哺乳期(提高羊毛產(chǎn)量和產(chǎn)奶量)免疫母羊的營養(yǎng)狀態(tài)得到有效的提高。這些對生產(chǎn)率有利的改變與免疫母羊產(chǎn)生的抗體對羊毛毛囊和生乳的乳房細胞施加作用是一致的。
免疫母羊哺育的羊羔生長速率的提高可以解釋為這些羊羔可得到更多的奶，因此假設它們喝了更多的奶。因為這些奶是分析正常的，因此這些羊羔得到更多的營養(yǎng)并因而接受的營養(yǎng)水平更高。這可能不是完全的解釋，因為初乳和奶也含有更多的對FEEDMIZA的抗體。這些抗體可能對通過羊羔的飼料利用具有調節(jié)作用。
對美利奴綿羊具有巨大的商業(yè)重要性的觀察是，免疫母羊哺育的羊羔顯示出在皮膚內羊毛毛囊的密度明顯增加。這個變化可能是持續(xù)一生的變化。甚至更明顯地提高有利于次級毛囊的次級毛囊對初級毛囊的比例，次級毛囊是那些已報道與產(chǎn)生細(fine)羊毛纖維有關的毛囊。這可能提示，這些羊羔已被永久地改良有利于產(chǎn)生質量更好的羊毛，僅僅因為它們在生命的最初6周吃了大量含抗-FEEDMIZA抗體的奶。實施例20給予牛SEQ ID NO:1的肽設計本實驗是作一個簡單的測試，看看在懷孕期間接種放牧區(qū)繁育的(range-bred)飼養(yǎng)肉用牛是否導致體重更重的。又一個觀察是了解在懷孕期間用FEEDMIZA免疫的母牛哺乳的小牛的生長。方案選擇一個品系的50只海福特?！涟哺袼古５男∧概２⒎诺交钴S生長的牧場。用Lutalyse(Upjohn,Rydalmere，澳大利亞)注射使小母牛發(fā)情期同步化，并與海福特公牛自然交配。在同步化的時候，將這些動物隨機劃分為2組，20只動物的一組為免疫組，而第二組的20只動物是未免疫小母牛。
在交配時、懷孕3個月和分娩前2周，將待免疫動物在頸部皮下注射3ml的乳液。
在交配時、分娩時和分娩后3個月將動物稱重。產(chǎn)出的小牛在出生時和此后每28天稱重直至3個月大。結果在交配時，未免疫組小母牛的平均重量為360±8.5kg，而待免疫組為355±12.8kg。
在分娩時，未免疫對照組動物的平均重量為385±15.5kg，免疫組免疫母牛的平均重量為440kg(平均有22％的差別)。分娩后3個月，未免疫母牛的平均重量為375±20.5kg，免疫母牛重415±24.5kg(平均相差10.6％)。結果顯示于圖17。
未免疫小牛的平均初生重為35±3.5kg，免疫組小牛為40±4.5kg(平均相差14％)。出生后3個月，未免疫對照組小牛的平均重量為116.2±6.4kg，免疫組為145.0±7.5kg(平均相差20％)。1-84天未免疫小牛的平均增重為81.2kg，免疫組為105kg(平均相差23.8kg，或29.3％)，如圖18所示。
從交配至產(chǎn)犢后84天，對于總的凈增重(母牛+小牛)，未免疫組為131.2Kg，免疫組為205Kg。討論和結論在懷孕期間用FEEDMIZA對放牧區(qū)繁育和放牧區(qū)飼養(yǎng)的肉用小母牛免疫已導致這些動物在懷孕期間增重更多的發(fā)生，并且導致在出生時產(chǎn)下更重的小牛。在出生時，不論免疫母牛產(chǎn)下的小牛還是未免疫母牛產(chǎn)下的小牛都是母牛重量的大約9％。接種疫苗的母畜哺乳的小牛在出生后的最初84天以更快的速度生長。這與在懷孕大母豬或懷孕母羊免疫后觀察到的形式相似，并提供進一步的旁證，證明FEEDMIZA具有有益地改變肉用牛育種效率的潛力。實施例21不同類型的佐劑的作用在35kg體重時將羊羔用各種傳遞載體(佐劑)中的0.5mg與BSA(牛血清白蛋白)綴合的SRIF在第0、21和42天免疫(n=6只動物每組)。
在84天期間測定的生長反應為未免疫對照2.0±1.37kgFCA免疫的 4.5±1.60kgMDP免疫的 7.0±1.3kgFIA和MDP免疫的5.0±1.3kgDEAE免疫的3.5±0.6kgQill A免疫的 4.0±1.5kg油免疫的 7.5±1.2kg結論是，使用的佐劑類型可能與產(chǎn)生的抗體的效力有關(baring)。
當本發(fā)明的油用作佐劑時觀察到明顯的反應。免疫動物沒有顯示出任何膿腫形成的跡象，表明它是一種潛在的商業(yè)制劑。
可想象的能用作佐劑、或用作傳遞載體中作為佐劑的添加物的其它材料是鋁鹽、脂多糖、山梨聚糖三油酸酯、Pluronics、Tetronics、角鯊烯、脂質體、免疫刺激復合物、霍亂毒素、大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素、白細胞介素等。實施例22抗原結果變化的作用對產(chǎn)生的抗三種提呈產(chǎn)生的超免疫綿羊和豬的血清測定抗體對SRIF、推薦序列(SEQ ID No2-3)的環(huán)狀形式和線性形式(SEQ ID No.4)的親和力。對促生長素抑制素的抗血清的抗體親和力用以前由Holst JJ,Jorgensen PN,Rasmussen TN和Schmidt P(1992)描述的Scatchard圖分析(“單克隆抗體免疫中和揭示的在豬中胃泌素分泌的促生長素抑制激素抑制”American journal of Physiology263:G908-G912)，確立抗體對促生長素抑制激素的親和力。識別并結合促生長素抑制素的綿羊抗體和豬抗體的親和力總結在下面抗原 抗體 對促生長素抑制素的親和力抗-SRIF綿羊 1.5×1011±1.2×101lmol-1抗-SRIF豬 2.0×1010±1.4×101lmol-1環(huán)狀 綿羊 1.9×108±2.2×101lmo1-1環(huán)狀 豬 3.0×108±1.0×101lmol-1線性 綿羊 1.3×107±0.2×102lmol-1線性 豬 1.4×107±1.6×101lmol-1從這些數(shù)據(jù)證實，在綿羊和豬中產(chǎn)生的抗-SRIF抗血清比用該構建物的環(huán)狀或線性等價物免疫的動物中產(chǎn)生的抗血清的締合常數(shù)更高。
用SRIF和胰高血糖素的抗體研究，揭示在兩個分子間發(fā)生某些交換作用。SRIF的結構包含與胰高血糖素分子部分同源的序列S-T-F-T。對推薦的肽產(chǎn)生的抗體與胰高血糖素沒有交叉反應。
在懷孕的最后三個月用與推薦油一起提呈的SEQ ID No3、4、5和SRIF14(天然的促生長素抑制激素)綴合物免疫2次的懷孕豬全部在大母豬的初乳和奶中、以及在3天齡和21天齡小豬的血液和消化道刮屑中產(chǎn)生抗-SRIF抗體。
從出生至斷奶小豬的絕對生長速率為來自未免疫對照大母豬的小豬每天165gn=40來自用SEQ ID No:3免疫的大母豬的小豬 每天275gn=42來自用SEQ ID No:4免疫的大母豬的小豬 每天240gn=44來自用SRIF綴合物免疫的大母豬的小豬 每天180gn=42實施例23 SEQ ID No3在小豬中的作用在對推薦的油中傳遞的環(huán)狀肽應答產(chǎn)生的抗體類型與以同樣方式傳遞的SRIF14綴合物相比，對免疫動物的生長具有意義。
在懷孕的最后3個月用SEQ ID No3免疫2次的大母豬產(chǎn)下的小豬在斷奶時(在21天齡)比用SRIF結合疫苗免疫的大母豬的子代平均重27％。測定的抗-SRIF抗體的水平如下處理第3天 第21天消化道IgG(OD @ 405nm±SD)SRIF/BSA 0.684±0.5480.259±0.18SEQ ID NO:3 0.51±0.21 0.123±0.09消化道IgASRIF/BSA 0.189±0.1330.037±0.05SEQ ID NO:3 0.12±0.157 0.10±0.087血漿IgGSRIF/BSA 1.38±0.44 1.779±0.13SEQ ID NO:3 0.9±0.13 2.12±0.23血漿IgASRIF/BSA 1.067±0.4690.798±0.49SEQ ID NO:3 1.43±0.217 0.567±0.21母豬的奶IgGSRIF/BSA 1.6±0.22SEQ ID NO:3 1.4±0.162
奶/初乳IgASRIF/BSAO.029±0.035SEQ ID NO:3 O.026±O.028在用乳化于本發(fā)明油中的SRIF/BSA或SEQ ID No:3免疫的大母豬哺乳的小豬的血漿和消化道刮屑中檢測到大量的對SRIF的抗體。
所述結果表明，雖然在初乳、奶、消化道刮屑或直至斷奶的小豬血清中測定的對SRIF的抗體量是相似的，但是抗體的功能性是不同的，正如在生長速率中觀察到的差異的證明的。
當與或不與任何佐劑或免疫刺激系統(tǒng)聯(lián)合給予(通過肌內、皮下、乳房內、口服或腹膜內)疫苗接受者的該肽時，將誘出直接或間接改變與消化和隨后的營養(yǎng)代謝相關的內分泌系統(tǒng)的特定抗體。然而，抗原傳遞的優(yōu)選形式涉及在一種非巨噬細胞刺激系統(tǒng)中將免疫原混合、懸浮或最好是乳化，或可通過皮下注射，或可腹膜內注射。推薦的傳遞系統(tǒng)的重要特征是它促進對多抗原的體液免疫應答的表達，好象單獨提呈每個抗原一樣。而且，由于該傳遞系統(tǒng)主要誘出體液應答，不涉及巨噬細胞刺激，所以所述抗體極有效(高效價和親和力)，并且包括整套同種型，特別是那些與粘膜表面有關的抗體(IgA和IgM)。
通過本發(fā)明提高動物生產(chǎn)量的機制極其復雜并且尚不完全清楚。然而，已確定所述抗體改變特別是促生長素抑制激素、胃泌素、胰島素和胰高血糖素的代謝；并且增加胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ和Ⅱ)的循環(huán)濃度。與改變這些激素代謝相關的內分泌分支是龐大的，并且包括在至少胃泌素、縮膽囊素、motilin、促胰液素、甲狀腺激素、胰高血糖素、胰島素、IGF-Ⅰ和Ⅱ、促生長素抑制素、前列腺素、組胺和血管活性腸肽的循環(huán)濃度的變化。從得自我們實驗室的結果已證實對所述肽的免疫誘導胃腸功能和代謝功能的變化。例如對免疫后的化學和生理刺激應答而明顯阻滯胃酸分泌速率和許多胃蛋白酶的活性。另外，明顯改變通過胃腸道各段消化的能動性，并且必然增強關鍵代謝物的吸收和代謝。而且，所述抗體使許多細胞特別是那些與內分泌系統(tǒng)有關的細胞對Ca2+離子的應答性更強，因此增加與促生長軸(somatotropic axis)和胃腸道有關的激素的分泌。對于細胞有一種提高的能力以最佳實施，即使Ca2+水平是次佳的。這個的作用是增加在細胞中、特別是增強肌肉纖維中的mRNA產(chǎn)生、促乳腺和促生長。
假設觀察到的對免疫應答中的事件組合增強食料的消化和吸收，以及隨后的關鍵代謝物的代謝，導致免疫動物生產(chǎn)能力的提高。
雖然為清楚的目的已詳細描述了本發(fā)明，但應當理解，本領域技術人員可以進行各種修改而不脫離本發(fā)明的范圍。
表2來自懷孕期間用SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5抗原免疫、或用安慰劑注射液免疫的大母豬的小豬的初生重處理 初生重SSTR11.5±0.2kSSTR21.65±0.1kgSSTR31.7±0.15kgSSTR41.5±0.2kgSSTR51.7±0.1kg對照 1.35±0.2kg
表3在免疫大母豬的初乳和在21天齡的吃奶仔豬的血漿和消化道刮屑中抗-SSTR抗體的平均效價樣品對照SSTR1 SSTR2SSTR3 SSTR4 SSTR5血漿 0 3025 5412 256412486458消化道 0 2000 1895 365414784785初乳 0 5002 8425 784557848563表4在出生和6周齡時用SSTR2、3和或安慰劑注射液免疫的母羊哺乳的羔羊的初級和次級毛囊的平均數(shù)量年齡 測定 對照 免疫的次級毛囊 57 67B初級毛囊 13 17i總毛囊 70 84r次級密度 36cm-238cm-2t初級密度 8cm-210cm-2h總密度 44cm-248cm-2S/P比值 5 4.56次級毛囊 95 118初級毛囊 5 10w總毛囊 100128e次級密度 55 70e初級密度 3 4k總密度 58 74sS/P比值 17 20
表5用FEEDMIZA通過不同注射途徑免疫母豬和安慰劑注射的豬(雄性)的增重和平均每日增重處理(kg) n 在21周的體重安慰劑注射90.8±3.21 12 583±24.1皮下免疫110.5±3.22 12 650±24.2腹膜內免疫104±2.7912 625±21.0肌內免疫96±2.61 12 600±19.6最重的組是皮下免疫組。它們明顯比所有其它處理組重(P＜0.05)。通過腹膜內途徑免疫的豬明顯比那些肌內免疫的豬和給予安慰劑注射液的豬重(P＜0.05)。在肌內免疫組和安慰劑組之間沒有明顯區(qū)別。
表6用FEEDMIZA通過不同注射途徑免疫母豬和安慰劑注射的豬的增重和平均每日增重處理 n 在21周的體重(kg)平均每日增重(克)安慰劑注射92±2.49 12575±18.79皮下免疫104±2.79 12650±21.05腹膜內免疫9.5±2.1 12597±15.79肌內免疫98.7±2.4912617±18.79在通過皮下途徑免疫的組中記錄到最重的體重。它們明顯比肌內免疫組的體重重(P＜0.05)。這些組的體重均明顯比注射安慰劑的組重(P＜0.05)。在其它處理組重量間沒有明顯差異。
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序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人NORTHSTER BIOLOGICALS PTY LTD(ⅱ)發(fā)明名稱肽、抗體、疫苗及其用途(ⅲ)序列數(shù)57(ⅳ)通信地址(A)收信人GRIFFITH HACK(B)街道509 ST KILDA ROAD(C)城市MELBOURNE(D)州VICTORIA(E)國家澳大利亞(F)郵政編碼3004(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本1.30(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朅U PN9990(B)提交日期1996年5月22日(C)分類(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名SANTER,VIVIEN(C)參考/檔案號JMW/SW:FP4656(ⅸ)電訊資料(A)電話+61392438300(B)傳真+61392438333
(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:
Leu Cys Phe Trp Lys Thr Cys1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:
Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Phe Cys1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ) 順序描述SEQ ID NO:3:
Cys Phe Trp Lys Thr Cys Ser Gly1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4:
Phe Trp Lys Thr Ser Gly Gly1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)傾序描述SEQ ID NO:5:
Phe Trp Lys Thr Ser Thr Lys Thr Ser Thr Lys Trp Phe1 5 10(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6:
Met Phe Pro Asn Gly Thr Ala Ser Ser Pro Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7:
Gln Asn Gly Thr Leu Ser Glu Gly Gln Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8:
Ala Glu Gln Asp Asp Ala Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:9:
Met Phe Pro Asn Gly Thr Ala Ser Ser Pro Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:10:
Gln Asn Gly Thr Leu Ser Glu Gly Gln Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:11:
Ala Glu Gln Asp Asp Ala Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ) 順序描述SEQ ID NO:12:
Met Phe Pro Asn Gly Thr Ala Pro Ser Pro Thr1 5 10(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)順序特征
(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:13:
Gln Asn Gly Thr Leu Ser Glu Gly Gln Gly Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:14:
Ala Glu Gin Asp Asp Ala Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:15:
Met Asp Met Ala Asp Glu Pro Leu1 5(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:16:
Gln Thr Glu Pro Tyr Tyr Asp Leu Thr Ser Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:17:
Gln Ile Ser Pro Thr Pro Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:18的信息
(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:18:
Met Asp Leu Val Ser Glu Leu1 5(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:19:
Gln Thr Glu Pro Tyr Tyr Asp Leu Ala Ser Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:20:
Ala Ile Ser Pro Thr Pro Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:21:
Met Asp Met Ala Tyr Glu Leu Leu1 5(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ) 順序描述SEQ ID NO:22:
Gln Thr Glu Pro Tyr Tyr Asp Leu Thr Ser Asn1 5 10
(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:23:
Ala Ile Ser Pro Thr Pro Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:24:
Met Glu Met Ser Ser Glu Gln Leu1 5(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:25:
Gln Thr Glu Pro Tyr Tyr Asp Met Thr Ser Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:26:
Ala Ile Ser Pro Thr Pro Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:27:
Met Glu Leu Thr Ser Glu Gln Phe1 5(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:28:
Gln Thr Glu Pro Tyr Tyr Asp Met Thr Ser Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:29:
Ala Ile Ser Pro Thr Pro Ala Leu1 5(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:30:
Met Asp Met Leu His Pro Ser1 5(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31:
Ala Gly Pro Ser Pro Ala Gly Leu Ala Val Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:32:
Pro Leu Pro Glu Glu Pro Ala Phe1 5(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:33:
Met Ala Thr Val Thr Tyr Pro Ser1 5(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:34:
Ala Gly Thr Ser Leu Ala Gly Leu Ala Val Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)順序特征
(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:35:
Pro Leu Pro Glu Glu Pro Ala Phe1 5(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:36:
Met Ala Ala Val Thr Tyr Pro Ser1 5(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:37:
Ala Gly Thr Ser Leu Ala Gly Leu Ala Val Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:38:
Pro Leu Pro Glu Glu Pro Ala Phe1 5(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:39:
Met Ser Ala Pro Ser Thr Leu Pro Pro1 5(2)SEQ ID NO:40的信息
(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:40:
Gly Pro Gly Asp Ala Arg Ala Ala Gly Met Val1 5 10(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:41:
Thr Ser Leu Asp Ala Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)順序特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:42:
Met Asn Thr Pro Ala Thr Leu Pro Leu1 5(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)順序特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:43:
Ser Asp Gly Thr Gly Thr Ala Gly Met Val1 5 10(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:44:
Thr Ser Leu Asp Ala Thr Val1 5
(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:45:
Met Glu Pro Leu Phe pro Ala1 5(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)順序特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:46:
Val Gly Pro Ala Pro Ser Ala Gly Ala Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:47:
Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ala Ser1 5(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)順序特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:48:
Met Glu Pro Leu Ser Leu Ala1 5(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)順序特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:49:
Val Gly Ser Ala Ser Pro Met Gly Ala Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:50:
Thr Leu Pro Glu Glu Pro Thr Ser1 5(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學環(huán)狀(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型無相關的(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:51:
X Tyr Asp Thr Lys Val Phe Cys Ser1 5其中X為Nme(2)SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)順序特征(A)長度11個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:52:
Ala Tyr Met Gly Trp Ser Cys Thr Lys Trp Phe1 5 10(2)SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)順序特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:53:
Phe Trp Lys Thr Ser Lys His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg1 5 10Asp Gly Cys15(2)SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:54:
Phe Arg Cys Pro Pro Cys Thr Glu Arg Leu Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:55:
Glu Val Leu Phe Arg Cys Pro Pro Cys Thr Pro Glu1 5 10(2)SEQ ID NO:56的信息(ⅰ)順序特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型無相關的(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:56:
Gly Ala Gly Ala Val Gly Ala Pro Val Val1 5 10
(2)SEQ ID NO:57的信息(ⅰ)順序特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:57:
Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu Glu1 5 10
權利要求
1．一種非天然產(chǎn)生的肽，其氨基酸序列得自或類似于天然動物激素、載體蛋白、結合蛋白或所述激素的受體，其中所述的肽能誘出一種或多種在體內能調制所述激素或受體活性的抗體。
2．按照權利要求1的肽，其中所述天然動物激素是促生長素抑制激素。
3．按照權利要求1或權利要求2的肽，選自一種或多種本文定義的No.1至53的肽。
4．按照權利要求3的肽，其中所述肽是選自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:51的一種肽。
5．按照權利要求2至4的任何一項的肽，其中所述抗體調制選自SSTR2、SSTR3和SSTR5的一種或多種激素受體的活性。
6按照權利要求1的肽，其中所述結合蛋白是胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)。
7．按照權利要求6的肽，所述肽選自No.54至57的肽。
8．按照權利要求1至7的任何一項的肽，其中所述的激素、載體蛋白結合蛋白或其受體是人類來源的。
9．按照權利要求1至8的任何一項的肽，所述肽與載體偶聯(lián)形成肽/載體復合物。
10．按照權利要求9的肽，其中所述載體是多抗原肽(MAP)系統(tǒng)。
11．按照權利要求10的肽，其中所述MAP系統(tǒng)包含寡聚分支賴氨酸核心。
12按照權利要求11的肽，其中所述MAP系統(tǒng)包含至少18個分支賴氨酸核心。
13．對權利要求1至12的任何一項的肽特異性的免疫反應分子(IRM)。
14．按照權利要求13的免疫反應分子，所述分子選自天然產(chǎn)生的抗體、重組抗體、scantibodies、合成抗體、融合抗體、嵌合抗體和其功能片段。
15．藥用組合物，包含免疫原性有效量的按照權利要求1至14的任何一項的肽或分子以及藥學上或獸醫(yī)上可接受的載體。
16．疫苗制劑，包含按照權利要求1至15的任何一項的肽或分子。
17．獸醫(yī)或藥學上可接受的載體，包含具有免疫佐劑活性的鯊魚油。
18．按照權利要求17的載體，其中所述的油是來自深海鯊魚，并且在上皮表面或粘膜表面刺激抗體產(chǎn)生。
19．按照權利要求17或18的載體，其中所述的油包含30-50％的二酰甘油醚。
20．按照權利要求19的載體，包含20-70％ 十八碳-9-烯基·甘油基醚3-25％ 1-十六烷基·甘油基醚1-15％ 十六碳-7-烯基·甘油基醚1.5-20％十八烷基·甘油基醚1-15％ 二十碳-9-烯基·甘油基醚1-25％ 卵磷脂1-25％ DLα-生育酚醋酸酯0-3％ 1,2,5-二羥基膽鈣化醇0-5％ 維生素A0-40％ 非礦物油
21．一種生產(chǎn)免疫原性組合物的方法，包含將能誘出免疫應答的肽與按照權利要求17至20的任何一項的載體接觸的步驟。
22．按照權利要求21的方法，其中所述的肽是按照權利要求1至12的任何一項的肽。
23．傳遞給動物能誘出免疫應答的肽的方法，包含與給予所述的肽以及有效量的按照權利要求17至20的任何一項的載體的步驟。
24．在動物中調制一種或多種激素應答的方法，包含給予所述動物激素調制有效量的按照權利要求1至15的任何一項的肽或分子的步驟。
25．按照權利要求24的方法，其中所述的激素應答是對選自促生長素抑制素、胃泌素、胰島素、胰高血糖素、催乳素、molitin、縮膽囊素、促胰液素、前列腺素、IGFBP、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、生長激素、甲狀腺激素、黃體生成素(LHRM)和腎上腺激素的一種或多種激素的應答。
26．在動物中增強胃腸功能的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
27．在動物中增加合成代謝和/或體重的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
28．在動物中增加循環(huán)的胰島素、IGF-Ⅰ和/或IGF-Ⅲ的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
29．在動物中抑制胃酶的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
30．在產(chǎn)纖維動物中增加纖維產(chǎn)量并可選地進一步改變次級毛囊對初級毛囊的比例的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
31．在產(chǎn)奶動物中增加產(chǎn)奶量的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR和/或IGFBP的肽的步驟。
32．在動物中降低c-fos基因活性和/或增加c-jun基因活性的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
33．在動物中改變鈣代謝的方法，包含給予所述動物有效量的基于SSTR的肽的步驟。
34．在動物中刺激對激素、載體蛋白、結合蛋白或激素受體的免疫應答的方法，其中所述的免疫應答調制激素活性，所述的方法包含給予免疫應答誘導有效量的按照權利要求1至13的任何一項的肽。
35．刺激對激素、載體蛋白、結合蛋白或激素受體的抗體應答的方法，其中所述的抗體應答在動物中調制激素或受體活性，并且其中所述的抗體應答導致抗體被分泌到所述動物的粘膜和/或所述動物的奶中，所述方法包括給給予抗體刺激有效量的本發(fā)明肽。
36．包含按照權利要求1至13的任何一項的肽的試劑盒。
37．包含按照權利要求13或14的分子的試劑盒。
38．按照權利要求36或權利要求37的試劑盒，還包含具有免疫佐劑活性的鯊魚油。
全文摘要
本發(fā)明涉及非天然產(chǎn)生的免疫原性肽和免疫反應分子,它們調制激素或其受體的活性。這些肽基于促生長抑制素、促生長抑制素受體和胰島素樣生長因子結合蛋白的部分。也設想了在動物中調制激素活性的方法和用于它們的組合物。
文檔編號C12N15/09GK1226896SQ97196524
公開日1999年8月25日 申請日期1997年5月22日 優(yōu)先權日1996年5月22日
發(fā)明者N·L·格雷蒂, S·L·韋斯特布魯克, D·J·金斯頓 申請人:北星生物有限公司