一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種主要產(chǎn)生慶大霉素C2a工程菌及其應(yīng)用。通過分析絳紅小單孢菌慶大霉素生物合成過程，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測，定向改造慶大霉素生物合成代謝流，提高慶大霉素C2a這一組分的積累，同時大大降低其它組分C1a、C1、C2的積累。采用基因框內(nèi)敲除的方法，滅活慶大霉素生物合成過程中的差向異構(gòu)酶基因genB2，包括穿梭質(zhì)粒pZB303的構(gòu)建，pZB303轉(zhuǎn)化至絳紅小單孢菌G1008，篩選阻斷工程菌，發(fā)酵生產(chǎn)，代謝產(chǎn)物檢測和組分分析。本發(fā)明主產(chǎn)慶大霉素C2a，填補(bǔ)了國內(nèi)外至今無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)慶大霉素C2a的空白，利用該工程菌生產(chǎn)C2a，工藝簡單、成本低，在抗生素制藥領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種主產(chǎn)慶大霉素C2a【圖1】工程菌及其應(yīng)用。利用基因工程和微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，闡明慶大霉素生物合成基因(GenBankaccession N0.:AJ628149，供《似；AY524043.\ ,gntL ；AJ575343.?>,gacj)的功能，并在絳紅小單孢菌G1008中敲除供》似，獲得一株主產(chǎn)慶大霉素C2a的工程菌，可用于工業(yè)化生產(chǎn)慶大霉素C2a。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物是生產(chǎn)藥物的主要來源。利用絳紅小單孢菌和棘孢小單孢菌來生產(chǎn)慶大霉素都是多組分復(fù)合物，如慶大霉素Cl，C2，Cla, C2a和ABX族，導(dǎo)致臨床使用的慶大霉素至今仍然是多組分復(fù)合物Cl、C2、Cla和C2a。慶大霉素C族以2-脫氧鏈霉胺為核心，分別在
4、6位上通過糖苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺而成。因絳紅糖胺C-6'上甲基化程度的差異，形成了 Cl、Cla、C2a和C2等不同組分。在C-6'位置上有甲基的為Cl，而Cla、C2和C2a沒有甲基，因此Cla、C2和C2a比Cl多了一個游離氨基，而C2a與C2是一對立體差向異構(gòu)體。多組分藥物，特別是差向異構(gòu)體藥物，對臨床用藥非常不便，也非常不利。世界衛(wèi)生組織，發(fā)達(dá)國家一直提倡臨床治療，采用單組份藥物，特別是非差向異構(gòu)體藥物。科學(xué)家通過傳統(tǒng)技術(shù)，現(xiàn)代技術(shù)，進(jìn)行菌株選育，期望得到慶大霉素單組分產(chǎn)生菌，但困難重重，至今未能如愿以償。
[0003]隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，新霉素和丁酰苷菌素生物合成過程已經(jīng)基本闡明。慶大霉素生物合成基因的研究也逐步取得突破，不同產(chǎn)生菌中的生物合成基因簇被陸續(xù)克隆出來。至2012年，本課題組公布了絳紅色小單孢菌G1008中的慶大霉素生物合成基因族(GenBank accession N0.:JQ975418),44181bp。隨著小單抱菌分子遺傳學(xué)操作體系的建立，慶大霉素系列單組份工程菌的構(gòu)建逐步展開，并取得了實(shí)質(zhì)性突破，為定向改造慶大霉素產(chǎn)生菌，獲得單組份工程菌奠定了基礎(chǔ)。
[0004]發(fā)明人首次完成了主產(chǎn)慶大霉素Cla工程菌的構(gòu)建，填補(bǔ)了國內(nèi)外研究空白，申請了發(fā)明專利(201110331534.9 ； 一株產(chǎn)慶大霉素Cla的工程菌及其應(yīng)用)，本發(fā)明是該授權(quán)專利的進(jìn)一步延伸與深化，屬系列性發(fā)明專利。
[0005]慶大霉素的生物合成從X2開始，只對絳紅糖胺進(jìn)行修飾，通過對卡那霉素、妥布霉素和慶大霉素生物合成基因簇比較，推測#/^7取genB4為B型的氨基轉(zhuǎn)移酶基因，其中P?沈?可能與C-6'位差向異構(gòu)化有關(guān)，即慶大霉素C2a轉(zhuǎn)變成C2。本發(fā)明通過破壞絳紅色小單孢菌G1008中基因genB2的功能，得到主產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明通過微生物分子遺傳學(xué)操作體系，借助基因工程技術(shù)，敲除慶大霉素生物合成中的關(guān)鍵基因P?沈?，防止慶大霉素C2a被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為慶大霉素C2，從而構(gòu)建了一株主產(chǎn)慶大霉素C2a的工程菌，命名為絳紅色小單孢菌iMicromonospora purpurea) GB102。該工程菌遺傳性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生回復(fù)突變。已于2014年4月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏地址為北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為 CGMCC N0.9112。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種主產(chǎn)慶大霉素C2a的工程菌及其應(yīng)用。
[0008]在產(chǎn)慶大霉素放線菌的基因組中滅活供》似基因，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。敲除基因的DNA序列為供》似的DNA序列。滅活供》似基因的方法包括基因敲除和基因置換。
[0009]一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌的制備方法，其特征是，主要包括以下步驟:
(1)滅話genB2同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建；
(2)滅活#同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌；
(3)滅活供《沈?單交換菌株的篩選；
(4)滅活供基因工程菌的篩選；
(5)滅活genB2基因工程菌代謝產(chǎn)物的鑒定。
[0010]基因敲除的方法為PCR擴(kuò)增職/7似基因上下游序列大約2000bp的兩個片段作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質(zhì)粒PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒pZB303。
[0011]所述的轉(zhuǎn)化方法為大腸桿菌ET12567/PUZ8002介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移方法。 [0012]所述滅活#基因工程菌的篩選為先獲得阿泊拉霉素抗性菌株，松弛培養(yǎng)后再從中篩選到阿泊拉霉素敏感菌株，再通過PCR驗(yàn)證得到genB2基因阻斷工程菌。
[0013]所述的鑒定為采用薄層層析法、高效液相分析和MS分析其代謝產(chǎn)物。
[0014]一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌在制備抗菌藥物和抗生素藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明通過框內(nèi)敲除絳紅色小單孢菌中供《似的DNA序列，滅活其功能，主要包括以下步驟:
a)genB2同源重組質(zhì)粒pZB303的構(gòu)建；
基于PCR技術(shù)，分別獲得#/7似基因上下游序列，大約2000bp的兩個片段，作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質(zhì)粒PKC1139上，得到同源重組質(zhì)粒PZB303【圖2】。
[0016](2)泛同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌；
質(zhì)粒 pZB303 先轉(zhuǎn)入疋 col1.ET12567/pUZ8002,得到 B.col1.ET12567/ pUZ8002/PZB303，然后通過疋col1.ET12567/pUZ8002/pZB303介導(dǎo)，轉(zhuǎn)入絳紅色小單孢菌。
[0017](3)genB2單交換菌株的篩選；
以阿泊拉霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，獲得阿泊拉霉素抗性菌株。
[0018](4)供基因敲除工程菌的篩選；
單交換菌株于無抗生素平板培養(yǎng)三代后，從中篩得阿泊拉霉素敏感菌株，經(jīng)PCR初檢，提取染色體基因組，再通過PCR擴(kuò)增其特定位點(diǎn)的genB2序列，并對所擴(kuò)增的DNA測序，證明genB2基因的DNA序列被敲除，基因被滅活，獲得工程菌。
[0019](5)genB2基因阻斷工程菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確定；
代謝產(chǎn)物分析:工程菌發(fā)酵液經(jīng)酸堿處理，樹脂吸附，洗脫液脫色，乙醇沉淀精制后，采用薄層色譜(TLC)法、高效液相色譜(HPLC)法和質(zhì)譜(MS)法，對代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。
[0020]本發(fā)明的工程菌，主要產(chǎn)生慶大霉素C2a，在抗菌藥物和抗生素制藥領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。通過框內(nèi)敲除基因的618bp堿基序列，滅活其功能，得到一株主產(chǎn)慶大霉素C2a的工程菌。通過擴(kuò)增供《似的上下游序列大約為2000bp作為同源交換臂，發(fā)生同源重組的概率大大提高，便于得到目的菌株。
[0021]基因genB2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:通過微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，在國際上，首次通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，而不是理論分析與預(yù)測，闡明了 genB2基因的功能與慶大霉素C2a轉(zhuǎn)化為慶大霉素C2有關(guān)。然后借助現(xiàn)代基因工程定向育種法，敲除慶大霉素生物合成的關(guān)鍵基因#?似，得到主產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌。該工程菌遺傳性狀穩(wěn)定，不易回復(fù)突變，產(chǎn)抗能力強(qiáng)，工藝簡單，成本低，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，制備單組份慶大霉素C2a，填補(bǔ)國內(nèi)外研究空白，具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1慶大霉素C2a的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0024]圖2同源重組質(zhì)粒pZB 303及其酶切驗(yàn)證圖。其中ZBl為上游交換臂，ZB2為下游交換臂；M: Λ -EcoT 14 I digest DNA Marker ；l/2:pZB303 / Xho I 酶切。
[0025]圖3敲除職似基因的同源重組原理圖，其中1:游離質(zhì)粒pZB303 ; I1:親株G1008染色體組；III:GB102染色體組；PB1/PB2上游交換臂引物，PB3/PB4下游交換臂引物，PB5/PB6雙交換驗(yàn)證引物。
[0026]圖4 工程菌 GB102 基因組的 PCR 驗(yàn)證圖。M:marker DL5000 ；1:G1008/(PB5/PB6)；2:GB21/(PB5/PB6) ；3:GB102/(PB5/PB6)。
[0027]圖5工程菌GB102代謝產(chǎn)物的TLC分析圖，1:慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品；2:GB102代謝產(chǎn)物。
[0028]圖6工程菌GB102的代謝產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，保留時間:5.126min為Cl ；
11.579min 為 Cla ；14.528min 為 C2a ；16.886 為 C2 ；6.501min 為過量衍生劑，14.502min 為
C2a。
[0029]圖7工程菌GB102的代謝產(chǎn)物質(zhì)譜(MS)分析結(jié)果，親株G1008主要為慶大霉素Cl和C2 ;突變株GB102主要為慶大霉素C2a，只有微量慶大霉素Cl和Cla。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1:
1、同源重組質(zhì)粒PZB303的構(gòu)建
根據(jù)2012年本研究室公布的絳紅色小單孢菌G1008慶大霉素生物合成基因族(GenBank accession N0.: JQ975418,44181bp),設(shè)訪 genB2 基因框內(nèi)缺失的方案(圖3)，合成引物(PB1/PB2)，用于擴(kuò)增上游交換ZBl ;引物(PB3/PB4)用于擴(kuò)增下游交換臂 ZB2。PBl (5 ' - TCTAGATGTAGAGCTCGTCCGCCGCCA-3 ; , XbaO, PB2 (5 ;-AAGCTTAAGGTCCCCGGCGATCTGCTC -3' ,HindIII)，PB3 (5' - AAGCTTAAGATGATCAGCACCCGCGATC-3/ ,Nin dill), PB4 (5' - GAATTCAATGTGGAGAACGGAGCAGACAG-3'boRI)。
[0031]以絳紅小單孢菌G1008的基因DNA為模板，選擇高保真酶Extaq為DNA聚合酶，設(shè)計PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，65°C退火lmin，72°C延伸lmin, 72°C保持lOmin，4°C保存。擴(kuò)增genB2的上游序列為同源交換臂ZBl，克隆至pMD19_T，得到中間質(zhì)粒PZB301 (pMD19-T::ZB1);同樣，擴(kuò)增genB2的下游序列作為同源交換臂ZB2，克隆至 PMD-19T，得到中間質(zhì)粒 pZB302 (pMD19_T::ZB2).質(zhì)粒PZB301經(jīng)油a I /歷idIII雙酶切，回收大小為1910bp的交換臂ZBl ;質(zhì)粒pZB302經(jīng)歷/?dIII/^boR I雙酶切，回收大小為1990bp的交換臂ZB2 ;與此同時，穿梭質(zhì)粒pKC1139也經(jīng)油a I /EcoR I雙酶切，回收6500bp的載體片段。三個片段:載體、交換臂ZBl和ZB2經(jīng)混合，T4DNA連接酶酶連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌toplO感受態(tài)細(xì)胞，在含有阿泊拉霉素的LB平板上篩選陽性克隆，提取得到大小為10647bp的最終質(zhì)粒pZB303 (pKC1139:: ZB1-ZB2)。其酶切驗(yàn)證見圖3，質(zhì)粒pZB303存在三處通ο I酶切位點(diǎn)，可將質(zhì)粒切成5711bp、3126bp、1521bp三個片段，電泳條帶與理論預(yù)測相符，測序結(jié)果證明正確。
[0032]2、同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌
將重組質(zhì)粒PZB303轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002感受態(tài)細(xì)胞，在含有阿泊拉霉素、氯霉素和卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取抗性菌落，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證正確，得到大腸桿菌厶 coli ET12567/(pUZ8002/pZB303)供體菌。培養(yǎng)供體疋 co7iET12567(pUZ8002/pZB303)轉(zhuǎn)接到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)；當(dāng)0D600為0.6時收集菌體(約3~4h)，并用新鮮的LB培養(yǎng)基洗滌2次，再用LB液體培養(yǎng)基重懸備用；將絳紅色小單孢菌孢子懸浮于5mL ρΗ8.0的0.05mol/L TES (2-[(三(羥甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)緩沖液中，60°C水浴熱激2min，待其冷卻至室溫后加入等體積預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基，37°C振蕩(250r/min)培養(yǎng)3h ;離心收集孢子并重懸于適量的無菌水中，在混合器上振蕩打散孢子，按大約IO8:108與大腸桿菌細(xì)胞等量混合，涂布在絳紅色小單孢菌平板培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)24h后，用含阿泊拉霉素和萘啶酸溶液覆蓋，使兩種抗生素的終濃度分別為50 μ /mL和25 μ /mL,置37°C培養(yǎng)3-5天，直至長出接合子。 [0033]3、單交換菌株的篩選
根據(jù)同源重組原理(圖3 )，設(shè)計雙交換篩選引物(PB 5 /PB6 )，若在genB2特定位點(diǎn)發(fā)生單交換，對菌株基因組PCR，可以擴(kuò)增到1816bp和1156bp的兩個片段，回復(fù)突變株或親株可以擴(kuò)增出1816bp的片段，而#阻斷突變株只可以擴(kuò)增出1156bp。設(shè)計阿泊拉霉素抗性基因引物(PA I /PA2 )。PB5 (5 ' - GCCCGATCGGAACGTGACG -3 ' )，PB6(5 ' - TGCGCAACCTCCGGACCAC -3 ' ), PAl (5 ' - CATTCTTCGCATCCCGCCTCTG -3 ' ), PA2(5' -TCAGCGGTGGAGTGCAATGTCG-3')。
[0034]將接合子轉(zhuǎn)接到含有25 μ g/ml萘啶酸和50 μ g/ml阿泊拉霉素的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3代，徹底清除可能含有的大腸桿菌和絳紅小單孢菌親株。挑取其中長勢較好的一株，命名為絳紅小單孢菌GB21，簡稱為GB21。提取基因組DNA。用擴(kuò)增阿伯拉霉素抗性基因引物(PA1/PA2)擴(kuò)增到700bp左右條帶；用雙交換篩選引物(PB5/PB6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1816bp和1156bp兩個條帶,與預(yù)測吻合。
[0035]4、供》似基因阻斷工程菌的篩選
將絳紅小單孢菌GB21轉(zhuǎn)接斜面，松弛培養(yǎng)3代后，開始分離單菌落，直至第八代。單菌落影印到含50 μ g/ml阿泊拉霉素的抗性平板上和無抗生素的普通平板上。根據(jù)同源重組原理，單交換菌發(fā)生第二次重組之后，會失去阿泊拉霉素抗性基因，對阿泊拉霉素敏感。因此，在阿伯拉霉素平板上不長，而對應(yīng)在普通平板上正常生長的菌株，可能為genB2缺失菌株或者回復(fù)突變株。
[0036]獲得的其中一株阿泊拉霉素敏感型菌株，命名為絳紅色小單孢菌GB102，簡稱GB102。提取基因組DNA，并以親株G1008和單交換菌株GB21的基因組DNA作對照，用雙交換篩選引物PB5/PB6進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物電泳檢測見圖4。GB102基因組只擴(kuò)增到1156bp左右的片段，經(jīng)測序，結(jié)果與預(yù)測吻合，因此，絳紅小單孢菌GB102為genB2敲除工程菌。
[0037]實(shí)施例2:
1、工程菌GB102的發(fā)酵
種子培養(yǎng)基:葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黃豆餅粉1.0%，KNO3 0.05%, CaCO3 0.5%, ρΗ7.0。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黃豆餅粉2.0 %，KNO3
0.01%, (NH4)2SO40.1%，CaCO3 0.5%,淀粉酶 0.025%, ρΗ7.5。
[0039]實(shí)例I中獲得的絳紅色小單孢菌GB102的發(fā)酵。工程菌GB102轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)8-9天，待斜面生成豐厚孢子，用接種針刮取I cm 2孢子至種子培養(yǎng)基。在280rpm/min, 37°C搖床培養(yǎng)28-36小時，深沉培養(yǎng)進(jìn)入對數(shù)生長期時，按10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝量為50mL/250mL三角瓶)，37°C搖床發(fā)酵120 h(轉(zhuǎn)速為280rpm)。
[0040]20000升發(fā)酵罐生產(chǎn)，攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量1:0.5~1.0 (M3 /M3.min),培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，接種量比例，發(fā)酵時間等，類似于搖瓶發(fā)酵。
[0041]2、代謝產(chǎn)物提取 A、粗提
發(fā)酵液稀釋后分別酸化、堿化后，用732-NH/樹脂靜態(tài)吸附4小時。收集吸附飽和樹月旨，用0.01M HCl溶液酸洗飽和樹脂,再用無離子水洗滌至中性,再用0.01%氨水進(jìn)行堿洗，當(dāng)流出液達(dá)PH 9.0以上時，串聯(lián)到等體積的711樹脂柱上，收集樹脫液。
[0042]B、精制、結(jié)晶
洗脫液經(jīng)薄膜濃縮到約300000ug/mL，用濃硫酸調(diào)至pH5.5飛.0，加5%活性炭脫色，透光度達(dá)92%以上，過濾去除固體物，得透明澄清溶液。在攪拌下，緩慢向濃縮液中滴加入95%以上乙醇，進(jìn)行過夜結(jié)晶，之后經(jīng)離心分離，85%乙醇溶液淋洗即得濕成品。經(jīng)真空干燥(真空度500mmHg以上，溫度60°C，干燥6小時)，得代謝產(chǎn)物精制品。
[0043]3、代謝產(chǎn)物分析
薄層色譜分析(TLC):按照中華人民共和國藥典(2010版)，展開劑系統(tǒng)配制如下，氯仿:甲醇:氨水(25%)=1:1:1，配制15ml混合溶液，靜置2h，取下層溶液作為展開劑。TLC檢測結(jié)果見圖5(1是慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，2是GB102代謝產(chǎn)物)，從中可以看出，工程菌GB102主產(chǎn)慶大霉素C2a，C2，少量Cla。
[0044]高效液相色譜分析(HPLC):參照中國人民共和國藥典2005版。用碳十八硅膠為填充劑；以水-冰醋酸-甲醇(25: 5: 70)配制的庚烷磺酸鈉溶液(0.02mol/L)為流動相；檢測波長為330nm.取樣品適量，加入適量的鄰苯二甲醛和異丙醇，混勻后置于60°C水浴中加熱15min，冷卻，過濾，量取10 μ I注入高效液相色譜儀。HPLC分析結(jié)果見圖6，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品各組分的保留時間:Cl (5.13min)，Cla (11.58min),C2a (14.53min),C2 (16.89min)；GB102的粗制樣品則存在兩個主峰，其中14.50min與C2a的保留時間一致，確定為C2a組分，而6.50min的峰 為衍生劑的峰；在5.13min和11.58min存在微小峰，是微量的Cl和Cla。C2 (16.98min)則完全沒檢測到。
[0045]質(zhì)譜分析(MS):安捷倫6520四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀，參數(shù)設(shè)置:ESI ( + ),100 ~800m/z ;流速，8.0 L.mirT1 ;溫度，350°C;噴霧器壓力，2.07X105 Pa ；Vcap 3500 V ;碰撞電壓，135 V.MS檢測結(jié)果見圖7，主要分子量為464的物質(zhì)，以及其雙電荷峰232，對應(yīng)于HPLC中主峰C2a ;少量的分子量為450和478物質(zhì)，對應(yīng)于HPLC中的Cla和Cl。322.6為碎片峰。
[0046]綜合TLC、HPLC和MS分析結(jié)果表明，工程菌GB102主要積累慶大霉素C2a，微量Cla和Cl，而檢測不到C2。
[0047 ]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌，其特征在于:所述工程菌為絳紅色小單孢菌GB102，該菌株已于2014年4月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.9112。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌，其特征在于，在產(chǎn)慶大霉素放線菌的基因組中滅活供《似基因，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于，敲除基因的DNA序列為genB2的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于，滅活基因的方法包括基因敲除和基因置換。
5.一種如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌的制備方法，其特征是，主要包括以下步驟: (1)滅話genB2同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建； (2)滅活#同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅小單孢菌； (3)滅活供《沈?單交換菌株的篩選； (4)滅活供基因工程菌的篩選； (5)滅活genB2基因工程菌代謝產(chǎn)物的鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述工程菌的制備方法，其特征是，基因敲除的方法為PCR擴(kuò)增供《似基因上下游序列大約2000bp的兩個片段作為同源交換臂，按順序連接到穿梭質(zhì)粒PKC1139中，得到同源重組質(zhì)粒PZB303。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌的制備方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)化方法為大腸桿菌ET12567/pUZ8002介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述工程菌制備方法，其特征是，所述滅活基因工程菌的篩選為先獲得阿泊拉霉素抗性菌株，松弛培養(yǎng)后再從中篩選到阿泊拉霉素敏感菌株，再通過PCR驗(yàn)證得到genB2基因阻斷工程菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌的制備方法，其特征在于:所述的鑒定為采用薄層層析法、高效液相分析和MS分析其代謝產(chǎn)物。
10.一種如權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)慶大霉素C2a工程菌在制備抗菌藥物和抗生素藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/00GK104004681SQ201410247211
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】洪文榮 申請人:福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司