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      用于治療溶酶體病癥的組合物和方法與流程

      文檔序號(hào):11281292閱讀:1961來(lái)源:國(guó)知局
      用于治療溶酶體病癥的組合物和方法與流程

      相關(guān)申請(qǐng)

      本專利申請(qǐng)要求于2014年11月19日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/081,696的申請(qǐng)日的權(quán)益,該申請(qǐng)的內(nèi)容特此通過(guò)引用的方式并入本文。

      本發(fā)明一般而言涉及用于治療溶酶體貯積癥(lysosomalstoragedisorders)的組合物和方法。

      背景

      溶酶體是含有大量在酸性環(huán)境中具有高度活性的水解酶的膜結(jié)合型細(xì)胞器(1-3)。傳統(tǒng)上被認(rèn)定為廢物管理細(xì)胞器,已表明溶酶體參與主要的細(xì)胞進(jìn)程,包括降解發(fā)展、程序性細(xì)胞死亡和營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)(2,4-8)。溶酶體對(duì)不同刺激物的不同作用和反應(yīng)表明協(xié)同調(diào)控溶酶體基因的表達(dá)(9,10)。近期研究提供了適度的關(guān)于溶酶體基因調(diào)控的信息(11,12),但是對(duì)溶酶體基因的模式發(fā)現(xiàn)分析揭示了協(xié)同溶酶體表達(dá)和調(diào)控(clear)成分的存在,該成分是轉(zhuǎn)錄因子eb(tfeb)(bhlh(基本螺旋-環(huán)-螺旋)因子的小眼畸形–轉(zhuǎn)錄因子e(mit/tfe)亞家族的成員)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。該研究報(bào)告了tfeb和溶酶體生物生成之間的潛在聯(lián)系(9,10,12)。

      tfeb的調(diào)控看起來(lái)是復(fù)雜的并且依賴于細(xì)胞類型和刺激物。在分化的破骨細(xì)胞中,rankl-依賴型信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)了tfeb激活誘導(dǎo)的溶酶體生物生成(13)。饑餓或應(yīng)激條件也可以激活tfeb,其否則保持為被mtorc1滅活的狀態(tài)(14,15)。一項(xiàng)研究也表明饑餓誘導(dǎo)的tfeb活性可在脂類代謝中起關(guān)鍵作用以及激活的tfeb也可自調(diào)控其自己的基因表達(dá)(16)。

      溶酶體貯積病(lsd)是一組大約50種罕見(jiàn)的由溶酶體功能缺陷導(dǎo)致的遺傳性代謝病癥。lsd的癥狀隨具體病癥和其他變量(如發(fā)病年齡)而變化,并且可為輕度至重度的。它們可包括發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇、癡呆、聾和/或盲?;加衛(wèi)sd的一些人具有增大的肝(肝腫大)和增大的脾(脾腫大)、肺部和心臟問(wèn)題,以及生長(zhǎng)異常的骨骼。

      優(yōu)選實(shí)施方式概述

      本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療lsd的方法。該方法可以包括向需要這種治療的受試者施用一種組合物,該組合物包括治療有效量的介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子eb(tfeb)上調(diào)的藥劑。

      在一個(gè)實(shí)施方式中,該藥劑為他汀類藥物。例如,他汀類藥物可以是阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素伐他汀或辛伐他汀。該藥劑還可以是例如降脂藥物,如貝特類藥物。在一些實(shí)施方式中,貝特類藥物是吉非羅齊或非諾貝特。在其他實(shí)施方式中,該藥劑是鎮(zhèn)痛劑、退熱劑、阿司匹林、肉桂代謝物、肉桂酸、苯丁酸鈉或苯甲酸鈉。在另一些實(shí)施方式中,該組合物可以包括至少兩種上述藥劑的組合。

      該組合物還可以包括全反式維甲酸或維生素a。例如,該組合物可以包括他汀類藥物或貝特類藥物和全反式維甲酸或維生素a。該制劑與全反式維甲酸或維生素a的這種組合與單獨(dú)施用全反式維甲酸、維生素a或貝特類藥物相比可以為受試者提供更大的療效。該組合可以是協(xié)同組合。tfeb也可以通過(guò)增加轉(zhuǎn)錄因子ebmrna水平、增加轉(zhuǎn)錄因子eb蛋白水平或激活ppara-rxra異源二聚體而上調(diào)。

      lsd可以是神經(jīng)退行性病癥,例如,神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronalceroidlipofuscinosis)、阿爾茨海默氏病(alzheimer'sdisease)、亨廷頓氏舞蹈病(huntington'sdisease)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis,als)、帕金森氏病(parkinson'sdisease),包括帕金森氏附加病(parkinson'splusdiseases),如多系統(tǒng)萎縮癥(multiplesystematrophy,msa)、進(jìn)行性核上性麻痹(progressivesupranuclearpalsy,psp)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(corticobasaldegeneration,cbd)或路易體癡呆(dementiawithlewybodies,dlb)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,lsd是自噬途徑障礙,并且其中所述藥劑增加溶酶體的生物生成。

      在其他實(shí)施方式中,lsd是tay-sachs病、法布里病(fabrydisease)、尼曼-匹克病(niemann-pickdisease)、戈謝病(gaucherdisease)、亨特氏綜合征(huntersyndrome)、α-甘露糖貯積病(alpha-mannosidosis)、天冬氨酰葡糖胺尿癥(aspartylglucosaminuria)、膽固醇酯貯積病(cholesterylesterstoragedisease)、慢性己糖胺酶a缺乏癥(chronichexosaminidaseadeficiency)、胱氨酸貯積癥(cystinosis)、danon病(danondisease)、farber病(farberdisease)、巖藻糖苷貯積癥(fucosidosis)、半乳糖唾液酸貯積癥(galactosialidosis),或巴騰氏病(battendisease),包括后期嬰兒型巴騰氏病(lateinfantilebattendisease)和青少年型巴騰氏病(juvenilebattendisease)。

      本發(fā)明的另一方面提供了治療lsd的方法,包括向需要這種治療的受試者施用一種組合物,該組合物包括治療有效量的介導(dǎo)tfeb基因上調(diào)的藥劑。又一方面提供治療lsd的方法,包括向需要這種治療的受試者施用一種組合物,該組合物包括治療有效量的一種藥劑,其中該藥劑恢復(fù)tfeb活性。

      附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

      圖1顯示吉非羅齊和維甲酸上調(diào)大腦細(xì)胞中的tfebmrna和蛋白水平。(a,b)將小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清的dmem/f-12培養(yǎng)基中用不同濃度的吉非羅齊和全反式維甲酸(atra)處理12小時(shí),之后通過(guò)qrt-pcr監(jiān)測(cè)tfeb的mrna水平(a)以及通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)tfeb蛋白水平(b)。(c)對(duì)tfeb的免疫印跡的光密度分析(相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白)。(d,e)將小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在類似的培養(yǎng)條件下用吉非羅齊(10μm)和atra(0.2μm)的組合處理4、6、12和24小時(shí),之后通過(guò)qrt-pcr監(jiān)測(cè)tfeb的mrna水平(d)以及通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)蛋白水平(e)。(f)對(duì)tfeb的免疫印跡的光密度分析。所有結(jié)果表示為或?yàn)橹辽偃齻€(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)集的平均值±sem。(g,i)將小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(g)和小鼠原代神經(jīng)元(i)在無(wú)血清條件下用吉非羅齊和維甲酸的組合處理24小時(shí),并分別對(duì)tfeb(紅)-gfap(綠)和tfeb(紅)-map2(綠)進(jìn)行雙標(biāo)記。使用dapi對(duì)核進(jìn)行染色。比例尺=20μm(對(duì)于g),對(duì)于高倍圖像,比例尺=5μm(對(duì)于g);比例尺=50μm(對(duì)于i),對(duì)于高倍圖像,比例尺=10μm(對(duì)于i)。(h,j)按照相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)計(jì)算,對(duì)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(h)和小鼠原代神經(jīng)元(j)的全細(xì)胞和核中的tfeb免疫反應(yīng)性(tfebir)量化。采用imagej對(duì)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)集的每種條件至少25個(gè)單獨(dú)圖像進(jìn)行量化。與未經(jīng)處理的對(duì)照相比。

      圖2顯示pparα和rxrα參與貝特類藥物介導(dǎo)的tfebmrna和蛋白的上調(diào):(a,b)將自pparα-/-和pparβ-/-以及野生型小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清dmem/f12中用吉非羅齊(10μm)和維甲酸(0.2μm)的組合處理24小時(shí),之后通過(guò)實(shí)時(shí)pcr監(jiān)測(cè)tfeb的mrna表達(dá)(a)以及通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)tfeb的蛋白水平(b)。(c)pparα-/-和pparβ-/-以及野生型星形膠質(zhì)細(xì)胞中的tfeb水平的光密度分析(相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白)。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns–相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。(d)將自wt小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞用gw9662預(yù)處理30分鐘,之后在類似的培養(yǎng)條件下用吉非羅齊和維甲酸處理,之后通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)tfeb蛋白表達(dá)的水平。(e)對(duì)tfeb的免疫印跡的光密度分析(相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白)。與對(duì)照相比;ns-相對(duì)于對(duì)照為非顯著性的。(f)將自pparα-/-和pparβ-/-和wt小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清dmem/f12中用10μm吉非羅齊和0.2μm維甲酸處理24小時(shí),并對(duì)tfeb(紅)和gfap(綠)進(jìn)行雙標(biāo)記。使用dapi對(duì)核進(jìn)行染色。un-無(wú)處理。比例尺=20μm。(g)按照相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)計(jì)算,對(duì)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的tfeb免疫反應(yīng)性(tfebir)進(jìn)行量化。采用imagej對(duì)來(lái)自三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)集的每種條件至少25個(gè)單獨(dú)圖像進(jìn)行量化。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns–相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。(h,i,j)對(duì)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染、用序列打亂的sirna(1.0μg)或rxrαsirna(1.0μg)轉(zhuǎn)染36小時(shí),之后在無(wú)血清dmem/f12培養(yǎng)基中用ra(0.2μm)和吉非羅齊(10μm)聯(lián)合處理24小時(shí),之后通過(guò)rt-pcr監(jiān)測(cè)rxrα以檢查基因沉默的水平(h)以及通過(guò)定量實(shí)時(shí)pcr監(jiān)測(cè)tfeb(j)和通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)tfeb(j)。(k)對(duì)tfeb的免疫印跡的光密度分析(相對(duì)于β肌動(dòng)蛋白)。p*<0.05,與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照相比;p**<0.05,與序列打亂的sirna轉(zhuǎn)染的對(duì)照相比;ns–相對(duì)于rxr-αsirna轉(zhuǎn)染的對(duì)照為非顯著性的。所有結(jié)果表示為或?yàn)橹辽偃齻€(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)集的平均值±sem。

      圖3顯示pparα在處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄調(diào)控tfeb表達(dá):(a)tfeb-熒光素酶啟動(dòng)子構(gòu)建物的野生型和突變型ppre位點(diǎn)的圖譜。(b)將bv2細(xì)胞用ptfeb(wt)-luc轉(zhuǎn)染24小時(shí),之后用不同濃度的吉非羅齊和維甲酸單獨(dú)以及聯(lián)合處理,并進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。p*<0.05,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比。(c)將bv2細(xì)胞用ptfeb(wt)-luc轉(zhuǎn)染24小時(shí),之后用pparα-、pparβ-、pparγ-拮抗劑預(yù)處理,之后用吉非羅齊和維甲酸處理,并進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。與未經(jīng)處理的對(duì)照相比,p*<0.05。與處理相比,p#<0.05。(d)將自pparα-/-(中間)和pparβ-/-(右)和野生型(左)小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞用ptfeb(wt)-luc轉(zhuǎn)染24小時(shí),之后用吉非羅齊和維甲酸處理,并進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。p*<0.05,與未經(jīng)處理的wt對(duì)照相比。p#–與未經(jīng)處理的pparα-/-對(duì)照相比為非顯著性的。與未經(jīng)處理的pparβ-/-對(duì)照相比。(e,f)將bv2細(xì)胞(e)和小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(f)用ptfeb(wt)-luc和ptfeb(mu)-luc轉(zhuǎn)染24小時(shí),之后用吉非羅齊和維甲酸處理,并進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。p*<0.05,與未經(jīng)處理的ptfeb(wt)-luc轉(zhuǎn)染對(duì)照相比。ns-相對(duì)于未經(jīng)處理的ptfeb(mu)-luc轉(zhuǎn)染對(duì)照為非顯著性的。所有結(jié)果為至少6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)集的平均值±sem。

      圖4顯示pparα-rxrα-pgc1α復(fù)合物對(duì)tfeb的轉(zhuǎn)錄激活。(a)具有用于chip的核心序列和擴(kuò)增子長(zhǎng)度的tfeb啟動(dòng)子上的ppre的圖譜。(b,c)將小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞用吉非羅齊(10μm)和ra(0.2μm)的組合處理30、60、120和240分鐘,并通過(guò)chip監(jiān)測(cè)在tfeb啟動(dòng)子的ppre結(jié)合位點(diǎn)上pparα(最左)、rxrα(中間偏左)、pgc1α(中間偏右)和rna聚合酶(最右)的募集,之后通過(guò)rt-pcr(b)和qrt-pcr(c)監(jiān)測(cè)。使用正常igg作為對(duì)照。p*<0.05,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比。所有結(jié)果表示為或?yàn)橹辽偃齻€(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)集的平均值±sem。(d)通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物誘導(dǎo)溶酶體的生物生成的示意圖。

      圖5顯示pparα依賴性上調(diào)tfeb誘導(dǎo)溶酶體的生物生成:(a,b)將自pparα-/-和pparβ-/-和野生型小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清dmem/f12中用吉非羅齊(10μm)和維甲酸(0.2μm)的組合處理24小時(shí),之后通過(guò)實(shí)時(shí)pcr監(jiān)測(cè)溶酶體基因(lamp2(左)、limp2(中間)、npc1(右))的mrna表達(dá)(a)以及通過(guò)免疫印跡監(jiān)測(cè)lamp2的蛋白水平(b)。(c)pparα-/-和pparβ-/-和野生型星形膠質(zhì)細(xì)胞中的lamp2水平的光密度分析(相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白)。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns-相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。所有結(jié)果表示為或?yàn)橹辽偃齻€(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)集的平均值±sem。(d)將自pparα-/-和pparβ-/-和wt小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清dmem/f12中用10μm吉非羅齊和0.2μm維甲酸處理24小時(shí),并對(duì)lamp2(紅)和gfap(綠)進(jìn)行雙標(biāo)記。使用dapi對(duì)核進(jìn)行染色。(e)按照相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)計(jì)算,量化小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的lamp2免疫反應(yīng)性(lamp2ir)。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns–相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。(f)將自wt小鼠分離的小鼠原代神經(jīng)元在無(wú)血清dmem/f12中用10μm吉非羅齊和0.2μm維甲酸處理24小時(shí),并對(duì)lamp2(紅)和map2(綠)進(jìn)行雙標(biāo)記。使用dapi對(duì)核進(jìn)行染色。(g)按照相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)計(jì)算,量化小鼠原代神經(jīng)元的lamp2免疫反應(yīng)性(lamp2ir)。p*<0.05,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比。(h)將自pparα-/-和pparβ-/-和wt小鼠分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清dmem/f12中用10μm吉非羅齊和0.2μm維甲酸處理24小時(shí),并對(duì)lysotrackerred(紅)和gfap(綠)進(jìn)行雙標(biāo)記。(i)按照相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)計(jì)算,量化小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的lamp2免疫反應(yīng)性(lamp2ir)。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns-相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。un–無(wú)處理。比例尺=20μm(對(duì)于d、e&f),對(duì)于高倍圖像,比例尺=10μm(對(duì)于e)。采用imagej對(duì)來(lái)自三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)集的每種條件至少25個(gè)單獨(dú)圖像對(duì)所有的圖像定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

      圖6顯示口服施用吉非羅齊在體內(nèi)在wt和pparβ-/-小鼠的皮質(zhì)中但不在pparα-/-小鼠的皮質(zhì)中上調(diào)tfeb:(a,d,g)對(duì)wt、pparα-/-和pparβ-/-小鼠(每組中n=6)經(jīng)由管飼法用7.5mg/kg體重/天的吉非羅齊和0.1mg/kg體重的全反式維甲酸(溶于0.1%甲基纖維素)或溶媒(0.1%甲基纖維素)處理。處理60天后,將小鼠殺死,并對(duì)皮質(zhì)切片進(jìn)行tfeb(紅)和neun(綠)雙標(biāo)記。使用dapi使核可視化。(c,f,i)較高放大倍數(shù)圖像顯示tfeb和neun在處理組(wt、pparα-/-和pparβ-/-)小鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元中的定位。(b,e,h)量化每組(wt、pparα-/-和pparβ-/-)的未經(jīng)處理和經(jīng)過(guò)處理的樣本的tfeb免疫反應(yīng)性(tfebir),用面積百分比表示。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns–相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。采用imagej對(duì)每組至少12張切片(每只動(dòng)物2張切片)進(jìn)行量化。比例尺=50μm和10μm(對(duì)于放大倍數(shù)較高的圖像)。

      圖7顯示口服施用吉非羅齊在體內(nèi)在wt和pparβ-/-小鼠的皮質(zhì)中但不在pparα-/-小鼠的皮質(zhì)中上調(diào)lamp2:(a,d,g)將wt、pparα-/-和pparβ-/-小鼠(每組中n=6)經(jīng)由管飼法用7.5mg/kg體重/天的吉非羅齊和0.1mg/kg體重的全反式維甲酸(溶于0.1%甲基纖維素)或溶媒(0.1%甲基纖維素)處理。處理60天后,將小鼠殺死,并對(duì)皮質(zhì)切片進(jìn)行l(wèi)amp2(紅)和neun(綠)雙標(biāo)記。使用dapi使核可視化。(c,f,i)較高放大倍數(shù)圖像顯示lamp2和neun在處理組(wt、pparα-/-和pparβ-/-)小鼠的皮質(zhì)神經(jīng)元中的定位。(b,e,i)量化每組(wt、pparα-/-和pparβ-/-)的未經(jīng)處理和經(jīng)過(guò)處理的樣本的lamp2免疫反應(yīng)性(lamp2ir),用面積百分比表示。pa<0.05,與wt對(duì)照相比;pb<0.05,與pparβ-/-對(duì)照相比;ns–相對(duì)于pparα-/-對(duì)照為非顯著性的。采用imagej對(duì)每組至少12張切片(每只動(dòng)物2張切片)進(jìn)行量化。比例尺=50μm和10μm(對(duì)于放大倍數(shù)較高的圖像)。

      圖8顯示tfeb的上調(diào)在正常和lincl患者的成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)溶酶體的生物生成:將來(lái)自健康個(gè)體(wt#1-3)和lincl患者(ncl#1-5)以及l(fā)incl載體(ncl/c)的成纖維細(xì)胞在減少血清(2%)的dmem培養(yǎng)基中用吉非羅齊(10μm)和維甲酸(0.2μm)處理24小時(shí),之后用lysotrackerred(紅)染色。使用明視野顯微鏡來(lái)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)。比例尺=20μm。對(duì)應(yīng)的箱形圖表示在每種細(xì)胞類型中與對(duì)照相比處理組的lysotracker陽(yáng)性信號(hào)的倍數(shù)變化。p*<0.05,與未經(jīng)處理的對(duì)照相比。roi–白色虛線,表示細(xì)胞的面積。倍數(shù)變化計(jì)算為與對(duì)照相比處理中每種細(xì)胞每單位面積的lysot+ve信號(hào)。采用imagej對(duì)每種細(xì)胞類型每種條件至少25個(gè)圖像進(jìn)行量化。

      圖9(a)–9(d)示出降膽固醇藥物(辛伐他汀和普伐他汀)、阿司匹林(鎮(zhèn)痛劑和退熱劑)、肉桂酸(肉桂代謝物)和用于尿素循環(huán)障礙的藥物(苯丁酸鈉和苯甲酸鈉)上調(diào)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中tfebmrna的表達(dá)。

      圖10示出阿司匹林在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中增加溶酶體的生物生成。將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理24h,之后進(jìn)行l(wèi)yso-tracker染色。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

      圖11(a)-(d)顯示阿司匹林在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)lamp2的表達(dá)。11(a)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理不同的時(shí)間段,之后通過(guò)實(shí)時(shí)pcr監(jiān)測(cè)lamp2的mrna表達(dá)。結(jié)果是三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+sd。ap<0.05,與對(duì)照相比;bp<0.001,與對(duì)照相比。11(b)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理24h,之后進(jìn)行l(wèi)amp2的蛋白質(zhì)印跡。11(c)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理不同的時(shí)間段,之后進(jìn)行l(wèi)amp2的蛋白質(zhì)印跡。11(d)在阿司匹林處理24h后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行l(wèi)amp2和gfap雙標(biāo)記。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

      圖12(a)-(c)顯示阿司匹林在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中增加tpp1。12(a)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理24h,之后進(jìn)行tpp1的蛋白質(zhì)印跡。12(b)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理不同的時(shí)間段,之后進(jìn)行tpp1的蛋白質(zhì)印跡。運(yùn)行肌動(dòng)蛋白作為管家分子。12(c)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理24h,之后使用含有5μg總蛋白和作為底物的ala-ala-phe7-酰氨基-4-甲基香豆素的細(xì)胞提取物進(jìn)行tpp1活性測(cè)定。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

      圖13(a)-(c)示出阿司匹林在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)tfeb。13(a)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理12h,之后進(jìn)行tfeb的蛋白質(zhì)印跡。運(yùn)行肌動(dòng)蛋白作為管家分子。13(b)將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理12h,之后用gfap和tfeb進(jìn)行雙標(biāo)記。這些結(jié)果是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。13(c)將細(xì)胞用p(wt)tfeb-luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,并在轉(zhuǎn)染24h后,將細(xì)胞用不同劑量的阿司匹林刺激。4h后,在總細(xì)胞提取物中測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+sd。ap<0.001,與對(duì)照相比。

      圖14(a)-(b)示出阿司匹林在小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中激活pparα。14(a)將細(xì)胞用5μm阿司匹林處理不同的時(shí)間段(用分鐘表示),之后分離核提取物并使用tfeb啟動(dòng)子的pparα-結(jié)合位點(diǎn)作為探針進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)pparα的dna結(jié)合活性。14(b)將從野生型、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞用ppar熒光素酶報(bào)告因子(ppre-x3-tk-luc)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,并在轉(zhuǎn)染24h后,將細(xì)胞用不同劑量的阿司匹林刺激。4h后,在總細(xì)胞提取物中測(cè)量螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+sd。ap<0.001,與對(duì)照相比。

      圖15(a)-(c)示出阿司匹林經(jīng)由pparα增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中tfeb的水平。將從wt15(a)、pparα(-/-)15(b)和pparβ(-/-)15(c)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理12h,之后對(duì)tfeb和gfap進(jìn)行雙標(biāo)記。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

      圖16(a)-(b)示出阿司匹林經(jīng)由pparα增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中l(wèi)amp2的水平。將從wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度的阿司匹林處理24h,之后進(jìn)行l(wèi)amp2的蛋白質(zhì)印跡分析16(a)。運(yùn)行肌動(dòng)蛋白作為管家分子。對(duì)條帶進(jìn)行掃描和并將其表示為相對(duì)于對(duì)照16(b)。結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+sd。ap<0.05,與對(duì)照相比;bp<0.001,與對(duì)照相比。ns,非顯著性的。

      圖17(a)-(c)示出阿司匹林經(jīng)由pparα增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體的生物生成。將從wt17(a)、pparα(-/-)17(b)和pparβ(-/-)17(c)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清條件下用5μm阿司匹林處理24h,之后進(jìn)行l(wèi)yso-tracker染色。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

      優(yōu)選實(shí)施方式詳述

      定義

      除非另有定義,本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)技術(shù)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。在相互矛盾的情況下,將以本文件包括定義為準(zhǔn)。優(yōu)選的方法和材料在下文描述,然而在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與本文描述的那些相似或等同的方法和材料。

      在描述本發(fā)明的內(nèi)容中(尤其是在后面的權(quán)利要求書(shū)中)使用術(shù)語(yǔ)“一種”、“一個(gè)”和“該”以及類似的提及被解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù),除非本文另有說(shuō)明或內(nèi)容明顯相互矛盾。除非本文另有說(shuō)明,本文描述的值的范圍僅旨在用作單獨(dú)提及每個(gè)落在該范圍內(nèi)的單獨(dú)值的速記方法,并且每個(gè)單獨(dú)值如同其單獨(dú)在本文中描述那樣被引入到說(shuō)明書(shū)中。本文描述的所有方法均能以合適的順序進(jìn)行,除非本文另有說(shuō)明或內(nèi)容明顯相互矛盾。本文提供的任何和全部實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(舉例來(lái)說(shuō),“如”,“例如”)的使用僅旨在更好地舉例說(shuō)明本發(fā)明,并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制,除非另有說(shuō)明。說(shuō)明書(shū)中的任何語(yǔ)言均不應(yīng)被解釋為任何對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐是必要的非要求要素。

      如本文所用,術(shù)語(yǔ)受試者是指人類或獸類受試者。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療作用”是指引起、改善或以其他方式導(dǎo)致與受試者的病癥(例如lsd)相關(guān)的病理癥狀、疾病進(jìn)展或生理狀況的改善或?qū)η谠摬“Y具有抗性的作用。關(guān)于藥物所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指賦予受試者治療作用的藥物的量。

      術(shù)語(yǔ)“協(xié)同”、“協(xié)同作用”或“協(xié)同的”意指多于預(yù)期的組合的相加作用。當(dāng)活性成分(1)以組合的單位劑量制劑共同配制或同時(shí)施用或遞送;(2)作為單獨(dú)的制劑交替或并行遞送;或(3)采用一些其他方案時(shí),可以獲得協(xié)同效應(yīng)。

      治療溶酶體貯積癥的組合物和方法

      出于促進(jìn)理解本發(fā)明原理的目的,現(xiàn)參考實(shí)施方式,其中一些實(shí)施方式在附圖中舉例說(shuō)明,并使用特定語(yǔ)言對(duì)其進(jìn)行描述。然而將理解并不因此旨在限制本發(fā)明的范圍。預(yù)期涵蓋描述的實(shí)施方式中的任何替代方案和進(jìn)一步的修改方案以及本發(fā)明原理的任何進(jìn)一步應(yīng)用,如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的任何技術(shù)人員正常想到的那些。

      本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療溶酶體貯積癥(lsd)的方法。lsd可以是例如tay-sachs病、法布里病、尼曼-匹克病、戈謝病、亨特氏綜合征、α-甘露糖貯積病、天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯貯積病、慢性己糖胺酶a缺乏癥、胱氨酸貯積癥、danon病、farber病、巖藻糖苷貯積癥、半乳糖唾液酸貯積癥或巴騰氏病,包括后期嬰兒型巴騰氏病和青少年型巴騰氏病。lsd還可以是涉及自噬-溶酶體途徑的神經(jīng)退行性疾病,例如,神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏舞蹈病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(als)、帕金森氏病,包括帕金森氏附加病,如多系統(tǒng)萎縮癥(msa)、進(jìn)行性核上性麻痹(psp)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(cbd)或路易體癡呆(dlb)。神經(jīng)退行性病癥可以通過(guò)缺陷型自噬表征。此類病癥包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷頓氏舞蹈病。

      一個(gè)實(shí)施方式包括向患有l(wèi)sd的受試者施用上調(diào)或增強(qiáng)tfeb基因的表達(dá)的藥劑。上調(diào)可以包括增加tfeb的mrna水平。本發(fā)明的方法還包括向患有l(wèi)sd的受試者施用上調(diào)tfeb或恢復(fù)tfeb活性的藥劑。上調(diào)可以包括增加tfebmrna水平、增加tfeb蛋白水平或增加tfeb活性。激活pparα/rxrα異源二聚體導(dǎo)致tfeb的上調(diào)。發(fā)明人還令人驚訝地表明tfeb通過(guò)pparα的活性或提高而不是通過(guò)pparβ或pparγ的活性或提高而被上調(diào)。

      該藥劑可以是降脂藥物,如貝特類藥物。貝特類藥物可以是吉非羅齊、非諾貝特或氯貝特。該藥劑可以是全反式維甲酸或維生素a。令人驚訝且意外的是,向受試者聯(lián)合施用貝特類藥物和全反式維甲酸或維生素a可以比單獨(dú)施用貝特類藥物或全反式維甲酸或維生素a更多地上調(diào)tfeb。貝特類藥物和全反式維甲酸或維生素a當(dāng)一起施用于受試者時(shí)可以協(xié)作地增強(qiáng)tfeb的上調(diào)從而協(xié)同上調(diào)tfeb。在全反式維甲酸或維生素a的存在下可以需要較低劑量的貝特類藥物以實(shí)現(xiàn)與向受試者只有施用較高劑量的貝特類藥物時(shí)才出現(xiàn)的相同程度的tfeb上調(diào)。貝特類藥物和全反式維甲酸或維生素a的組合可以是協(xié)同組合。

      在其他實(shí)施方式中,降脂藥物是他汀類藥物。舉例來(lái)說(shuō),他汀類藥物可以是阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素伐他汀、辛伐他汀或這些藥物中的至少兩種的組合。他汀類藥物可以單獨(dú)使用或與貝特類藥物和或全反式維甲酸或維生素a聯(lián)合使用。在另一些實(shí)施方式中,藥劑可以是鎮(zhèn)痛劑或退熱劑,例如阿司匹林;苯基丁酸酯;苯甲酸鈉;或肉桂代謝物例如肉桂酸。再次地,此類藥劑可以與全反式維甲酸或維生素a聯(lián)合使用并可以一起施用于受試者以協(xié)作地增強(qiáng)tfeb的上調(diào),從而協(xié)同上調(diào)tfeb。

      降脂藥物可以是降低在受試者血液中循環(huán)的甘油三酯水平的藥物。此外,降脂藥物可以是降低高脂血癥(hyperlipidemia)風(fēng)險(xiǎn)的藥物。貝特類藥物可以經(jīng)由pparα但不經(jīng)由pparβ和pparγ介導(dǎo)tfeb的上調(diào)。在tfeb的上調(diào)期間,pparα與rxr-α形成異源二聚體,并且rxrα/ppar-a異源二聚體經(jīng)由rxr結(jié)合位點(diǎn)被募集至tfeb基因的啟動(dòng)子。

      tfeb的上調(diào)可以由全反式維甲酸介導(dǎo)。全反式維甲酸還可以被稱為atra、維甲酸、維a酸(tretinoin)和維生素a酸。全反式維甲酸可以經(jīng)由維甲酸類x受體-α(rxr-α)介導(dǎo)tfeb的上調(diào)。在tfeb的上調(diào)期間,rxr-α與過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體-a(ppar-α)形成異源二聚體,并且該rxr-α/ppar-α異源二聚體經(jīng)由rxr結(jié)合位點(diǎn)被募集至tfeb基因的啟動(dòng)子。

      介導(dǎo)tfeb上調(diào)的組合物可以包括藥劑(例如降脂藥物)和全反式維甲酸或維生素a的組合。此種組合與單獨(dú)施用該藥劑或全反式維甲酸或維生素a相比可以協(xié)作地介導(dǎo)或增強(qiáng)tfeb的上調(diào)。與單獨(dú)施用該降脂藥物或全反式維甲酸或維生素a相比,該組合可以協(xié)作地增強(qiáng)tfeb的上調(diào)約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、或約10倍。特別是,與單獨(dú)施用該降脂藥物或全反式維甲酸或維生素a相比,該組合可以協(xié)作地增強(qiáng)tfeb的上調(diào)約3倍。

      本發(fā)明的另一方面提供藥物組合物,該藥物組合物包括上文公開(kāi)的藥劑中的至少一種。該藥物組合物還可以包括全反式維甲酸或維生素a。例如,該藥物組合物可以包括吉非羅齊或吉非羅齊和全反式維甲酸或維生素a的組合或阿司匹林和全反式維甲酸或維生素a的組合。

      藥物組合物可以為例如片劑、丸劑、錠劑、硬和軟凝膠膠囊、顆粒劑、微丸,水性、脂質(zhì)、油性或其他溶液、乳劑如水包油型乳劑、脂質(zhì)體,水性或油性懸浮液、糖漿劑、酏劑(alixiers)、固體乳劑、固體分散體或可分散性粉末的形式。在用于口服施用的藥物組合物中,藥劑可以與通常已知和使用的佐劑和賦形劑(例如,阿拉伯樹(shù)膠、滑石、淀粉、糖(舉例來(lái)說(shuō),如甘露糖、甲基纖維素、乳糖)、明膠、表面活性劑、硬脂酸鎂、水或非水溶劑、石蠟衍生物、交聯(lián)劑、分散劑、乳化劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、調(diào)味劑(例如香精油)、溶解增強(qiáng)劑(例如苯甲酸芐酯或苯甲醇)或生物利用度增強(qiáng)劑(例如gelucire))混合。在該藥物組合物中,藥劑還可以分散在微粒(例如納米顆粒)組合物中。

      對(duì)于腸胃外施用,在存在或不存在增溶劑、表面活性劑、分散劑或乳化劑的情況下,可將藥劑或藥劑的藥物組合物溶解或懸浮于生理學(xué)上可接受的稀釋劑(舉例而言,如水、緩沖液、油)中。對(duì)于油而言,可以使用例如且不限制橄欖油、花生油、棉籽油、大豆油、蓖麻油和芝麻油。更普遍地,對(duì)于腸胃外施用,藥劑或藥劑的藥物組合物可為水性、脂質(zhì)、油性或其他類型的溶液或懸浮液的形式,或者甚至可以脂質(zhì)體或納米懸浮液的形式施用。

      施用方式

      上文公開(kāi)的藥劑或包括這些藥劑的藥物組合物可通過(guò)任何允許向受試者遞送治療有效量的藥劑的方法施用。施用方式可包括但不限于口服、局部、經(jīng)皮和腸胃外途徑,以及直接注射到組織中和通過(guò)導(dǎo)管遞送。腸胃外途徑可包括但不限于皮下、真皮內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌內(nèi)途徑。在一個(gè)實(shí)施方式中,施用途徑是通過(guò)局部或經(jīng)皮施用,如通過(guò)洗劑、乳膏劑、貼劑、注射、植入裝置、移植物或其他控釋載體。施用途徑包括將組合物直接遞送至體循環(huán)(例如通過(guò)注射)的任何途徑,包括任何腸胃外途徑。

      本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式包括以足以防止lsd發(fā)展或減輕lsd程度的一定劑量、濃度和時(shí)間施用至少一種藥劑(例如吉非羅齊或吉非羅齊和atra的組合)。某些實(shí)施方式包括以約0.1微克至約100毫克/千克受試者體重、約0.1微克至約10毫克/千克受試者體重、約0.1微克至約1毫克/千克受試者體重的劑量全身性施用。在實(shí)踐本方法的過(guò)程中,藥劑或含有該藥劑的治療組合物可以每天一劑或每天多劑施用。這種治療方法可能需要施用較長(zhǎng)的一段時(shí)間。每次施用的藥劑的量或施用的重量將由醫(yī)師決定并且將取決于諸如患者的體重、患者的年齡和一般健康狀況以及患者對(duì)該化合物的耐受性等因素。

      將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明的實(shí)施方式,以下實(shí)施例不限制權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍。

      實(shí)施例

      實(shí)施例1–材料和方法

      試劑:dmem/f-1250/501x、hank’s平衡鹽溶液(hbss)和0.05%胰蛋白酶購(gòu)自mediatech(washington,dc)。胎牛血清(fbs)得自atlasbiologicals(fortcollins,co)??咕拐婢鷦⒓橇_齊和全反式維甲酸(atra)得自sigma-aldrich(st.louis,mo)。

      小鼠原代星形神經(jīng)膠質(zhì)的分離:根據(jù)giulian和baker的方法(26)從所述的混合神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物(24,25)分離星形神經(jīng)膠質(zhì)。簡(jiǎn)言之,在第9天,將混合神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物用杜氏改良eagle培養(yǎng)基/f-12洗滌三次,并在旋轉(zhuǎn)振蕩器中在37℃下以240rpm振搖2h以除去小神經(jīng)膠質(zhì)。2天后,重復(fù)振搖24h以除去少突神經(jīng)膠質(zhì)并確保完全除去所有的非星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。將貼壁細(xì)胞接種至新板上用于進(jìn)一步的研究。

      小鼠原代神經(jīng)元的分離:如以前(27)描述并改良的方法的制備胚胎(e18-e16)小鼠神經(jīng)元。取出全腦,并將細(xì)胞通過(guò)在1200rpm下離心三次持續(xù)10min進(jìn)行洗滌,沉淀物分裂,并將細(xì)胞在10%融合時(shí)鋪在用多聚d賴氨酸(sigma,st.louis,mo)預(yù)處理>2hr的8孔室玻片中。4min后,抽吸非貼壁細(xì)胞懸浮液,并向每孔加入500ml補(bǔ)充有2%b27的完全neurobasal培養(yǎng)基(invitrogen)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前將細(xì)胞孵育4天。采用β-微管蛋白和gfap或cd11b的雙標(biāo)記免疫熒光顯示神經(jīng)元的純度大于98%(數(shù)據(jù)未示出)。在進(jìn)行甲醇固定和免疫染色之前,將細(xì)胞在減去抗氧化劑補(bǔ)充有2%b27的neurobasal培養(yǎng)基(invitrogen)中用吉非羅齊刺激24hr。

      半定量反轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr):采用rna-easyqiagen(valencia,ca)試劑盒按照生產(chǎn)商的方案從小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分離總rna。在20μl反應(yīng)混合物中使用oligo(dt)12–18作為引物和莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(mmlv-rt,invitrogen)如早期(28)所述的進(jìn)行半定量rtpcr。采用promegamastermix(madison,wi)和下列用于鼠基因的引物(invitrogen)將得到的cdna適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)增:

      小鼠tfeb:有義,5’-aacaaaggcaccatcctcaa-3′(seqidno.:1);反義,5′-cagctcggccatattcacac-3′(seqidno.:2);小鼠lamp2:有義:5′-ggtgctggtctttcaggcttgatt-3′(seqidno.:3);反義,5′-accacccaatctaagagcaggact-3(seqidno.:4)′;小鼠limp2:有義:5′-tgttgaaacgggagacatca-3′(seqidno.:5);反義,5′-tggtgacaaccaaagtcgtg-3′(seqidno.:6);小鼠npc1:有義:5′-gggatgcccgtgcctgcaat-3′(seqidno.:7);反義,5′-ctggcagctacatggccccg-3′(seqidno.:8);小鼠gapdh:有義:5′-gcacagtcaaggccgagaat-3′(seqidno.:9);反義,5′-gccttctccatggtggtgaa-3′(seqidno.:10)。

      擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖(invitrogen)凝膠上進(jìn)行電泳并通過(guò)溴化乙錠(invitrogen)染色使其可視化。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)mrna作為上樣對(duì)照以確定從每個(gè)樣本合成等量的cdna。

      定量實(shí)時(shí)pcr:采用abiprism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(appliedbiosystems,fostercity,ca)使用sybrselectmastermix(appliedbiosystems)進(jìn)行mrna定量。將靶向基因的mrna表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為gapdhmrna的水平,并且通過(guò)abi序列檢測(cè)系統(tǒng)1.6軟件處理數(shù)據(jù)。

      細(xì)胞的免疫染色:如早期(29)所述進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)。簡(jiǎn)言之,將含有小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、小鼠神經(jīng)元的8孔室玻片培養(yǎng)至70-80%融合,并用冷甲醇(fisherscientific,waltham,ma)固定過(guò)夜,之后用濾過(guò)pbs簡(jiǎn)單沖洗兩次。將樣本用在含吐溫20(sigma)和tritonx-100(sigma)的pbs中的2%bsa(fisherscientific)阻斷30min,并在含有下列抗小鼠一級(jí)抗體的pbs中在振搖條件下室溫孵育2hr:tfeb(1:1000;abcam),gfap,(1:1000;dako),lamp2(1:500,abcam),neun(1:500,millipore)和map2(1:200,millipore)。在濾過(guò)pbs中經(jīng)四次15min洗滌后,將玻片進(jìn)一步用cy2或cy5-標(biāo)記的二級(jí)抗體(全都為1:200;jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)在類似的振搖條件下孵育1hr。用濾過(guò)pbs經(jīng)四次15分鐘洗滌后,將細(xì)胞用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,1:10,000;sigma)孵育4-5min。將樣本以etoh和二甲苯(fisher)梯度運(yùn)行,安裝,并在olympusbx41熒光顯微鏡下觀察。

      組織切片的免疫染色:處理60天后,將小鼠殺死并將它們的腦固定、包埋和處理。切片由不同的腦區(qū)制成,并在新鮮冷凍切片上進(jìn)行免疫熒光染色,使用抗小鼠tfeb(1:500)、抗小鼠lamp2(1:200)和抗小鼠neun(1:500)。安裝樣本并在olympusbx41熒光顯微鏡下觀察(30)。

      lysotracker染色:在減少血清(2%)dmem培養(yǎng)基下對(duì)培養(yǎng)至70-80%融合的成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同的刺激,之后用75nmlysotrackerreddnd99(invitrogen)孵育45分鐘。然后將細(xì)胞用濾過(guò)pbs徹底清洗并安裝在載玻片上,并在bx41熒光顯微鏡下觀察。

      免疫印跡:如早期(31,32)所述并改良的方法進(jìn)行蛋白免疫印跡。簡(jiǎn)單而言,將細(xì)胞刮在1xripa緩沖液中,使用布拉德福試劑測(cè)量蛋白質(zhì),加入十二烷基硫酸鈉(sds)緩沖液并在4-12%bis-tris凝膠(invitrogen)上進(jìn)行電泳,使用thermo-piercefastsemi-dryblotter將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(bio-rad)。

      然后將膜在加吐溫20的tbs(tbst)中洗滌15min,并在含有bsa的tbst中阻斷1小時(shí)。接下來(lái),將膜在振搖條件下于4℃用下列1°抗體孵育過(guò)夜:tfeb(1:1000,abcam),lamp2(1:500,abcam)和β-肌動(dòng)蛋白(1:800;abcam,cambridge,ma)。第二天,將膜在tbst中洗滌1小時(shí),在抗1°抗體宿主的2°抗體(全都為1:10,000;jacksonimmunoresearch)中室溫孵育1小時(shí),再洗滌1小時(shí),并在紅外成像系統(tǒng)(li-cor,lincoln,ne)下觀察。

      小鼠tfeb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告因子構(gòu)建物的構(gòu)建:使用自小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分離的小鼠基因組dna作為pcr期間的模板。通過(guò)pcr分離小鼠tfeb(-916/+61)基因的5′側(cè)翼序列。從基因庫(kù)序列設(shè)計(jì)引物。tfeb:有義:5′-acgcgtccaggagccagggacggggtacatctc-3′(seqidno.:11);反義:5′-agatctaaggagaaactgagtccgggcagaagg-3’(seqidno.:12)。將有義引物用mlu1限制酶位點(diǎn)標(biāo)記,而將反義引物用bglii標(biāo)記。采用advantage-2pcr試劑盒(clontech)根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明進(jìn)行pcr。得到的片段經(jīng)凝膠純化并連接到pgem-teasy載體(promega)中。在用相應(yīng)的限制酶消化并通過(guò)測(cè)序acgtinc.dnasequencingservices驗(yàn)證后將這些片段進(jìn)一步亞克隆到pgl-3enhancer載體中。

      tfeb啟動(dòng)子的克隆和定點(diǎn)誘變:通過(guò)使用定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?stratagene,usa)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。使用相反方向上的兩個(gè)引物在單個(gè)pcr反應(yīng)中擴(kuò)增突變質(zhì)粒。突變啟動(dòng)子位點(diǎn)的引物序列為:突變:有義:5’-gcaacagcaagtgcggatttgagggggggggacggtggg-3’(seqidno.:13);反義:5’-cccaccgtccccccccctcaaatccgcacttgctgttgc-3’(seqidno.:14)。用乙醇沉淀pcr產(chǎn)物,然后通過(guò)t4激酶磷酸化。通過(guò)t4dna連接酶使磷酸化的片段自我連接并用限制酶dpni消化以消除未突變的模板。將突變的質(zhì)粒在大腸桿菌(dh5-α菌株)感受態(tài)細(xì)胞中克隆和擴(kuò)增。

      tfeb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告因子活性的測(cè)定:將鋪在12孔板中的50–60%融合的細(xì)胞用0.25μg的ptfeb(wt)-luc、ptfeb(mu)-luc并使用lipofectamineplus(invitrogen)共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,將細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同的藥劑刺激6小時(shí)。如早期(33,34)所述在td-20/20光度計(jì)(turnerdesigns)中使用熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)試劑盒(promega)分析細(xì)胞提取物中螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

      染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)定:采用nelson等人(35)描述的方法在做了某些改良的情況下進(jìn)行chip測(cè)定。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),將小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞用10μm吉非羅齊和0.5μmra一起刺激6小時(shí),之后用甲醛(1.42%最終體積)固定,并用125mm甘氨酸猝滅。細(xì)胞在含有150mmnacl、50mmtris-hcl(ph7.5)、5mmedta、np-40(0.5%vol/vol)、tritonx-100(1.0%vol/vol)的ip緩沖液中沉淀并細(xì)胞溶解。對(duì)于500ml,加入4.383gnacl、25ml的100mmedta(ph8.0)、25ml的1mtris-hcl(ph7.5)、25ml的10%(vol/vol)np-40和50ml的含有下列抑制劑的10%(vol/vol)tritonx-100:10μg/ml亮抑酶酞、0.5mm苯甲基磺酰氟(pmsf)、30mm對(duì)硝基苯基磷酸酯、10mmnaf、0.1mmna3vo4、0.1mmna2moo4和10mmβ-甘油磷酸酯。

      在用1.0mlip緩沖液洗滌1次后,將沉淀再懸浮于1mlip緩沖液(含有所有的抑制劑)中并超聲處理,將修剪的染色質(zhì)分成兩部分(一部分將被用作輸入(input))。剩余部分在旋轉(zhuǎn)下于4℃用5-7μg的抗-pparα或抗-rxrαabs或抗-pgc1α或rnapol或正常igg(santacruz)孵育過(guò)夜,之后在旋轉(zhuǎn)下于4℃用蛋白g-瓊脂糖(santacruz)孵育2小時(shí)。然后將珠用冷ip緩沖液洗滌5次,并將總計(jì)100μl的10%chelex(10g/100mlh2o)直接加入至洗滌后的蛋白g珠并渦旋。10min煮沸后,允許chelex/蛋白g珠懸浮液冷卻至室溫。然后加入蛋白酶k(100μg/ml)并將珠在55℃下孵育30min,同時(shí)振搖,之后再煮沸10min。將懸浮液離心并收集上清液。將chelex/蛋白g珠部分用另外100μl水渦旋,再次離心,并合并第一和第二上清液。洗出液直接作為pcr中的模板。

      使用下列引物來(lái)擴(kuò)增小鼠tfeb啟動(dòng)子中的側(cè)翼為rxr結(jié)合元件的片段:set1:有義:5'-gaacattccaggtggaggca-3'(seqidno.:15),反義:5'-cccccaacacatgcttctct-3'(seqidno.:16);set2:有義:5'-gagtctctcggaggaggtga-3'(seqidno.:17),反義:5'-actccaggcatgctttctcc-3'(seqidno.:18)。通過(guò)使用不同的循環(huán)數(shù)以及不同量的模板來(lái)重復(fù)pcr以確保結(jié)果是在pcr的線性范圍內(nèi)。使用相同的引物和sybrselectmastermix進(jìn)行qrt-pcr。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為輸入和非特異性igg,并計(jì)算相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)增加。

      光密度分析:采用imagej(nih,bethesda,md)分析蛋白印記并相對(duì)于它們各自的β-肌動(dòng)蛋白上樣對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化各帶。數(shù)據(jù)表示對(duì)于來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)集的每種條件至少25個(gè)不同的圖像相對(duì)于對(duì)照的平均倍數(shù)變化。

      統(tǒng)計(jì)學(xué):值表示為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±sem。經(jīng)由學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這一統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)為p<0.05。

      實(shí)施例2–pparα和rxrα的激活誘導(dǎo)小鼠原代腦細(xì)胞中的tfeb的表達(dá)

      考查ppar激活劑(如fda-批準(zhǔn)的藥物吉非羅齊)以確定它們是否上調(diào)小鼠腦細(xì)胞中的tfeb的表達(dá)。因?yàn)橐阎猵parα和rxrα形成轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合物(21,36,37),我們使用吉非羅齊和激活rxrα的atra二者來(lái)檢查雙重處理是否會(huì)有任何累加作用。在無(wú)血清培養(yǎng)基中用單劑量的吉非羅齊和atra以及二者的組合處理小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(mpa)。定量實(shí)時(shí)pcr數(shù)據(jù)顯示在全部三個(gè)組中tfeb的表達(dá)增加,并且該增加在聯(lián)合處理中略高(但相對(duì)于個(gè)體治療不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)(圖1a)。當(dāng)使用吉非羅齊和atra二者的組合時(shí),與25μm的吉非羅齊和0.5μm的atra相比,我們可以在這兩種化合物的低很多的劑量(分別為10μm和0.2μm)下實(shí)現(xiàn)類似的tfeb表達(dá)水平。采用聯(lián)合處理的時(shí)間點(diǎn)分析顯示在早至6小時(shí)時(shí)可誘導(dǎo)tfeb表達(dá)直至24小時(shí)(圖1d)。這兩種劑量和時(shí)間的qrt-pcr數(shù)據(jù)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡得到驗(yàn)證,該蛋白質(zhì)印跡顯示類似的tfeb水平的增加模式(圖1b、1c、1e&1f)。

      而且,我們使用小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代神經(jīng)元并將它們?cè)跓o(wú)血清培養(yǎng)基中用吉非羅齊和atra的組合處理24小時(shí),并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)。數(shù)據(jù)顯示在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中tfeb的水平都具有明顯的增加以及tfeb在核中和周圍的定位(圖1g&1i)。采用imagej量化tfeb免疫反應(yīng)性,并且我們觀察到處理后tfeb總體水平具有大約4倍的增加以及tfeb在核中的tfeb定位具有大約5-6倍的增加(圖1h&1j)。以前已表明饑餓和營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致tfeb的激活,所以在本項(xiàng)研究中也將所有未經(jīng)處理的細(xì)胞保持在無(wú)血清條件下持續(xù)整個(gè)處理持續(xù)時(shí)間,以使各組之間tfeb水平的基線變化保持相同。

      實(shí)施例3–pparα和rxrα參與藥物介導(dǎo)的tfeb上調(diào)

      通過(guò)使用來(lái)自pparα(-/-)動(dòng)物的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞并敲除wt小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中的rxrα來(lái)測(cè)試pparα連同rxrα能夠參與藥物介導(dǎo)的tfeb上調(diào)的假設(shè)。將得自wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)動(dòng)物的mpa在如上所述的類似條件下進(jìn)行處理并檢查tfeb的mrna和蛋白表達(dá)。tfeb的實(shí)時(shí)pcr和蛋白質(zhì)印跡都顯示tfeb在wt和pparβ(-/-)星形膠質(zhì)細(xì)胞中可被上調(diào)但在pparα(-/-)星形膠質(zhì)細(xì)胞中不在相同水平(圖2a、2b&2c)。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步被免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí),在免疫細(xì)胞化學(xué)中我們觀察到在wt和pparβ(-/-)中tfeb水平幾乎增加3-4倍,但在pparα(-/-)中沒(méi)有(圖2f&2g)。

      已報(bào)道pparγ共激活因子-1a(pgc1α)可參與轉(zhuǎn)錄激活tfeb,所以我們通過(guò)使用pparγ抑制劑來(lái)測(cè)試pparγ是否參與這種特定藥物介導(dǎo)的tfeb上調(diào)。在用藥物處理之前用pparγ特異性抑制劑預(yù)處理的tfeb的蛋白質(zhì)印跡表明吉非羅齊和atra對(duì)于tfeb的上調(diào)可能不是采用pparγ介導(dǎo)途徑(圖2d&2e)。已知pparα和rxrα形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,并且我們的數(shù)據(jù)顯示在atra的存在下tfeb輕微增加。我們想要看到atra是否經(jīng)由rxrα發(fā)揮它的作用。將wtmpa用rxrα特異性sirna處理,之后用吉非羅齊和atra的組合處理,并進(jìn)行mrna和蛋白兩種分析。數(shù)據(jù)顯示成功地敲除了rxrα基因以及因此在不存在rxrα的情況下藥物的作用被部分消除了,這根據(jù)rxrα沉默后tfebmrna的水平是顯然的(圖2h&2i)。蛋白質(zhì)印跡還顯示類似的結(jié)果:處理后,與序列打亂的sirna相比,tefb水平在rxrα沉默細(xì)胞中不太顯著(圖2j&2k)。綜合起來(lái),這些數(shù)據(jù)表明pparα和rxrα可涉及吉非羅齊和atra對(duì)tfeb的上調(diào)。

      實(shí)施例4–pparα/rxrα異源二聚體在處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄調(diào)控tfeb表達(dá)

      pparα和rxrα一起形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,所以已確定這些受體似乎上調(diào)tfeb,我們測(cè)試這些受體是否轉(zhuǎn)錄調(diào)控tfeb表達(dá)。在分析tfeb的啟動(dòng)子位點(diǎn)后,我們發(fā)現(xiàn)在tfeb的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)上游約480bp處存在過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(ppre)。將含有pero的tfeb啟動(dòng)子(ptfeb(wt))克隆至pgl3enhancer載體中。我們還突變了ppre的核心序列,并將突變的啟動(dòng)子構(gòu)建物(ptfeb(mu))也克隆至pgl3載體中。野生型熒光素酶構(gòu)建物當(dāng)轉(zhuǎn)染至bv2細(xì)胞中時(shí)顯示出明顯的熒光素酶活性增加(圖3b)。當(dāng)含有ptfeb(wt)熒光素酶構(gòu)建物的細(xì)胞用pparα-拮抗劑(gw6471;250nm)、pparβ-拮抗劑(gsk0660;250nm)、pparγ-拮抗劑(gw9662;5nm)處理時(shí),我們觀察到熒光素酶活性與pparα拮抗劑處理細(xì)胞中的未經(jīng)處理的細(xì)胞相似,但不與pparβ-或pparγ-拮抗劑處理細(xì)胞中的相似(圖3c)。

      在自wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)動(dòng)物分離的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中,我們觀察到在wt和pparβ(-/-)細(xì)胞中具有增加的熒光素酶活性,但在pparα(-/-)中不具有增加的熒光素酶活性(圖3d)。而且,當(dāng)具有突變ppre位點(diǎn)的構(gòu)建物(ptfeb(mu)-luc)轉(zhuǎn)染至bv2和小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在含有突變體構(gòu)建物的細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低(圖3e&3f)。綜合起來(lái),這些數(shù)據(jù)表明在用吉非羅齊和維甲酸處理后pparα的激活在tfeb的誘導(dǎo)中起重要作用。

      最后,我們決定研究在這種情況下pparα對(duì)tfeb啟動(dòng)子的實(shí)際dna結(jié)合作用。已表明激活后,pparα、rxrα和pgc1α形成復(fù)合物,該復(fù)合物啟動(dòng)許多基因的轉(zhuǎn)錄激活(38-42);我們?cè)诖搜芯渴欠袷沁@種情況。通過(guò)用抗-pparα、-rxrα和-pgc1α抗體免疫沉淀染色質(zhì)片段對(duì)用吉非羅齊和維甲酸處理30分鐘到240分鐘的不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行chip分析,并保持抗-rnapol和正常igg作為對(duì)照。半定量pcr和定量rt-pcr都顯示在通過(guò)特異性抗體沉降(pulldown)的情況下擴(kuò)增子隨時(shí)間的富集增加(圖4b&4c)。免疫沉淀后采用正常igg的pcr顯示出在rt-pcr中幾乎不可檢測(cè)的帶,采用總片段dna的pcr顯示出在rtpcr中的一致的信號(hào),表明結(jié)果的一致性和專一性。在實(shí)時(shí)pcr中,將ct值標(biāo)準(zhǔn)化至%輸入,并進(jìn)一步用igg信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化以得到信噪比,從而驗(yàn)證結(jié)果的專一性。實(shí)驗(yàn)在相同的條件下重復(fù)三次,并調(diào)節(jié)pcr產(chǎn)物的周期和稀釋度以確保數(shù)據(jù)在pcr的線性范圍內(nèi)。迄今為止所有這些發(fā)現(xiàn)都表明直接激活pparα和rxrα受體實(shí)際上可轉(zhuǎn)錄調(diào)控tfeb的表達(dá)。

      實(shí)施例5–tfeb的上調(diào)導(dǎo)致溶酶體的生物生成增加:

      tfeb是溶酶體基因表達(dá)和生物生成的主調(diào)控因子(9,12,16),所以我們預(yù)期隨著tfeb上調(diào),生物生成和溶酶體標(biāo)記物增加。對(duì)在相同條件下處理的mpa進(jìn)行一些溶酶體標(biāo)記物如lamp2、limp2和npc1的mrna分析。正如預(yù)期的,數(shù)據(jù)顯示在wt和pparβ(-/-)細(xì)胞中在相同條件下這些基因的水平升高,但在pparα(-/-)細(xì)胞中不升高(圖5a)。在wt和k.o.細(xì)胞中對(duì)lamp2的蛋白質(zhì)印跡分析和免疫細(xì)胞化學(xué)也顯示出類似的蛋白表達(dá)方式(圖5b、5c&5d)。在小鼠原代神經(jīng)元中也觀察到lamp2水平的增加(圖5e)。而且,當(dāng)細(xì)胞用lysotrackerred染色時(shí),我們觀察到在藥物處理后的wt和pparβ(-/-)細(xì)胞的情況中每種細(xì)胞的溶酶體含量增加,但在pparα(-/-)中不增加(圖5f),這與我們之前對(duì)tfeb和其他溶酶體標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)表明吉非羅齊和atra能經(jīng)由pparα/rxrα途徑誘導(dǎo)tfeb表達(dá),這最終導(dǎo)致溶酶體的生物生成增加。

      實(shí)施例6–pparα和rxrα的激動(dòng)劑在wt和pparβ/-小鼠但不在pparα-/-小鼠的cns中體內(nèi)誘導(dǎo)溶酶體的生物生成:

      一旦證實(shí)pparα參與貝特類藥物介導(dǎo)的tfeb上調(diào),我們進(jìn)一步核實(shí)在體內(nèi)環(huán)境下能否復(fù)制相同的結(jié)果。將來(lái)自相同背景的wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠用7.5mg/kg體重/天的吉非羅齊和溶于0.1%甲基纖維素的0.1mg/kg體重的atra口服治療60天,0.1%甲基纖維素也被用作溶媒。在治療結(jié)束時(shí),將小鼠處死,并將大腦皮質(zhì)切片,進(jìn)行免疫熒光用于檢測(cè)tfeb的存在。這一體內(nèi)免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了我們的細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn),因?yàn)槲覀冇^察到與溶媒對(duì)照相比在pparα(-/-)治療的動(dòng)物的皮質(zhì)中tfeb水平?jīng)]有任何明顯的升高,但是在wt和pparβ(-/-)動(dòng)物中觀察到相當(dāng)大的反應(yīng)(圖6a、6d&6g)。

      我們進(jìn)一步量化了每組至少12張切片的tfeb陽(yáng)性信號(hào),值表示為總面積的百分比。定量分析證實(shí)了在wt和pparβ(-/-)動(dòng)物中tfeb陽(yáng)性信號(hào)顯著增加,但是在pparα(-/-)動(dòng)物中則無(wú)顯著增加(圖6b、6e&6h)。對(duì)來(lái)自同一動(dòng)物的皮質(zhì)的其他切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)用于檢測(cè)lamp2的存在。結(jié)果顯示在wt和pparβ(-/-)動(dòng)物中l(wèi)amp2免疫反應(yīng)性增加,但在pparα(-/-)動(dòng)物中沒(méi)有增加(圖7a、7d&7g)。該定量數(shù)據(jù)還表明在wt和pparβ(-/-)動(dòng)物中l(wèi)amp2陽(yáng)性信號(hào)顯著增加,而在pparα(-/-)動(dòng)物中則無(wú)顯著增加(圖7b、7e&7h)。

      實(shí)施例7–在lincl患者的成纖維細(xì)胞中吉非羅齊和atra誘導(dǎo)的溶酶體的生物生成

      為了測(cè)試在患者細(xì)胞中能否復(fù)制類似的結(jié)果,我們獲得了來(lái)自正常和lincl受累患者皮膚成纖維細(xì)胞,并在減少血清培養(yǎng)基(2%血清)中用類似濃度的吉非羅齊和atra處理細(xì)胞。為了考量由于血清饑餓引起的任何變化,將未經(jīng)處理的對(duì)照在類似的血清條件下保持處理時(shí)間長(zhǎng)度(24小時(shí))。在此之后,將成纖維細(xì)胞用lysotrackerred染色,我們觀察到全面地類似的細(xì)胞中溶酶體累積增加模式。正常成纖維細(xì)胞(wt#1至wt#3)和來(lái)自攜帶cln2突變的lincl患者的成纖維細(xì)胞(ncl#1至ncl#5)以及l(fā)incl載體(ncl/c)成纖維細(xì)胞顯示每種細(xì)胞的溶酶體增加是類似的(圖8)。為了標(biāo)準(zhǔn)化圖像中細(xì)胞的數(shù)量和大小,我們計(jì)算了每細(xì)胞每單位面積的lysotracker+ve信號(hào)并進(jìn)行相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)分析。對(duì)每組至少25場(chǎng)分析lysotracker陽(yáng)性信號(hào),數(shù)據(jù)表明與疾病狀態(tài)無(wú)關(guān),在所有的成纖維細(xì)胞中均顯著增加,盡管細(xì)胞中溶酶體的基線水平和增加水平隨細(xì)胞不同而不同。這一數(shù)據(jù)表明治療作用獨(dú)立于lincl患者的疾病狀況。

      實(shí)施例8–對(duì)實(shí)施例2-7的討論

      溶酶體是細(xì)胞中主要細(xì)胞器之一,其不僅充當(dāng)細(xì)胞的廢物處理機(jī)構(gòu),而且在其他生物過(guò)程如抗原呈遞、某些激素的調(diào)控、骨再造、壞死性細(xì)胞死亡、細(xì)胞表面修復(fù)和發(fā)育以及其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用(2,43-47)。為了執(zhí)行這些不同的功能,需要嚴(yán)格調(diào)控溶酶體的生物生成和活性。根據(jù)近期發(fā)現(xiàn),tfeb是溶酶體生物生成的主調(diào)控因子(9,12,15)。多年以來(lái),不同團(tuán)隊(duì)已強(qiáng)調(diào)了溶酶體在不同疾病情況中的作用(48-53)。據(jù)報(bào)道在患有g(shù)raves眼病(graves’ophthalmopathy)的患者的眼眶脂肪中溶酶體相關(guān)基因被嚴(yán)密調(diào)控,而溶酶體進(jìn)程的下調(diào)改進(jìn)了聚乙二醇化脂聚復(fù)合物(lipopolyplex)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染(53,54)。溶酶體的生物生成增加可能不必然證明在所有疾病和細(xì)胞類型中均是有益的,但是在一些情況中,自噬-溶酶體途徑的誘導(dǎo)可能有助于毒性廢物的細(xì)胞清除(55,56)。

      在過(guò)去幾年里,tfeb已成為一些溶酶體相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。taijitsunemi等人報(bào)道通過(guò)經(jīng)由pgc1α激活轉(zhuǎn)錄因子eb(tfeb)可導(dǎo)致htt轉(zhuǎn)化(turnover)的增加和蛋白聚集體的消除(57,58)。有報(bào)道表明α-突觸核蛋白毒性和受損的tfeb功能之間的聯(lián)系以及將tfeb認(rèn)定為pd的神經(jīng)保護(hù)療法的靶點(diǎn)(59)。已表明tfeb激活增強(qiáng)戈謝病中去穩(wěn)定的葡糖腦苷脂酶(gc)變體的折疊、運(yùn)輸和活性。在另一lsdtay-sachs病的情況中,表明tfeb救濟(jì)β-己糖胺酶突變體的活性。這些發(fā)現(xiàn)將tfeb描述為溶酶體蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的特異性調(diào)控因子和救濟(jì)lsd的酶穩(wěn)態(tài)的治療靶點(diǎn)(60,61)。

      還報(bào)道tfeb過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)溶酶體胞吐作用能救濟(jì)lsd的病理性貯積并恢復(fù)正常的細(xì)胞形態(tài)學(xué)(62)。除lsd之外,已表明在小鼠中tfeb誘導(dǎo)脂質(zhì)的分解代謝和清除,并能救濟(jì)肥胖癥和代謝綜合征(15,16)??傮w上,在近些年,tfeb因其不僅在溶酶體生物生成中的作用而且由于其作為疾病狀況的治療靶點(diǎn)的暗示而變成潛在重要的轉(zhuǎn)錄因子。已鑒定的靶向tfeb活性的治療上可行的化合物并不是很多,盡管最近已表明2-羥基丙基-β-環(huán)糊精(hpβcd)是fda批準(zhǔn)的賦形劑,促進(jìn)來(lái)自患有l(wèi)incl的患者的細(xì)胞中tfeb介導(dǎo)的蛋白脂質(zhì)聚集體的清除(56)。而且,另一項(xiàng)研究揭示了染料木素(5,7-二羥基-3-(4-羥基苯基)-4h-1-苯并吡喃-4-酮)對(duì)tfeb水平和活性以及溶酶體生物生成的誘導(dǎo),染料木素是一種用于粘多糖貯積癥(mps)的底物減少療法(srt)中的潛在藥物(63)。

      近期研究已將tfeb、溶酶體生物生成和自噬與脂質(zhì)代謝連接起來(lái)(14-16,55,64,65)。tfeb和脂質(zhì)代謝之間的潛在相互影響導(dǎo)致我們研究吉非羅齊和atra的作用,吉非羅齊和atra是脂質(zhì)代謝中的兩種重要因子pparα和rxrα的潛在激活劑。吉非羅齊,作為“吉非貝齊(lopid)”銷售,是fda批準(zhǔn)的用于高脂血癥的處方藥(17,19),但是已表明其具有多種有益作用(22)。吉非羅齊穿過(guò)血腦屏障(bbb)的能力已有文獻(xiàn)記載(20)。我們以前報(bào)道了吉非羅齊連同atra能誘導(dǎo)腦細(xì)胞中cln2基因的水平(66)。我們進(jìn)一步研究想要了解溶酶體生物生成的主調(diào)控因子tfeb能否被藥物影響。我們的數(shù)據(jù)表明吉非羅齊單獨(dú)地或者連同atra能有效誘導(dǎo)腦細(xì)胞中tfeb的表達(dá)。

      進(jìn)一步的研究表明pparα在該過(guò)程中的可能作用。已表明pparα在不同的調(diào)控和調(diào)節(jié)途徑中起重要作用(67-71)。已知某些多不飽和脂肪酸和氧化衍生物以及貝特類藥物家族的調(diào)脂藥物(包括非諾貝特和吉非羅齊)激活pparα。貝特類藥物替代在細(xì)胞溶質(zhì)中隔絕pparα的hsp90抑制因子復(fù)合物,并有助于救濟(jì)pparα的轉(zhuǎn)錄活性(21)。因此,我們?cè)u(píng)估了受體的ppar基團(tuán)對(duì)這種現(xiàn)象的作用。我們的數(shù)據(jù)明確表明pparα參與吉非羅齊對(duì)tfeb上調(diào)的過(guò)程中,但是pparβ和pparγ不參與。體外研究進(jìn)一步被體內(nèi)研究驗(yàn)證,在體內(nèi)研究中,我們使用敲除pparα和pparβ的小鼠。我們的體內(nèi)研究也支持細(xì)胞培養(yǎng)物數(shù)據(jù)。

      對(duì)tfeb基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析以描述tfeb上調(diào)的機(jī)理。在小鼠tfeb啟動(dòng)子以及rxr結(jié)合位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)pero位點(diǎn)。根據(jù)以前的研究,ppar/rxr異源二聚體已顯示出dna結(jié)合活性(70)。綜合起來(lái),ppar/rxr異源二聚體調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,其產(chǎn)物參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化(69,72)。觀察tfeb上調(diào)途徑需要ppar和rxr二者的協(xié)作效應(yīng)。而且,吉非羅齊和ra的作用在rxrα或pparα任一不存在的情況下均被消除。使用tfeb啟動(dòng)子上的pero的wt和突變體熒光素酶構(gòu)建物的熒光素酶測(cè)定結(jié)果都顯示刺激后在wt構(gòu)建物中tfeb啟動(dòng)子依賴性活性增加。但是pparα(-/-)細(xì)胞在用ptfeb(wt)-luc構(gòu)建物轉(zhuǎn)染時(shí)以及wt細(xì)胞在用ptfeb(mu)-luc構(gòu)建物轉(zhuǎn)染時(shí)不顯示熒光素酶活性的任何顯著增加。最后,chip數(shù)據(jù)表明pparα和rxrα連同pgc1α和rnapol一起在tfeb啟動(dòng)子的pero位點(diǎn)上募集。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行精密分析,并引入適當(dāng)?shù)膶?duì)照以確保發(fā)現(xiàn)結(jié)果的專一性。

      共同地,這些數(shù)據(jù)描繪了獨(dú)特的機(jī)理,其中吉非羅齊(pparα的激活劑)和atra(rxrα的激動(dòng)劑)一起經(jīng)由pparα/rxrα異源二聚體上調(diào)腦細(xì)胞中的tfeb。雖然一項(xiàng)研究報(bào)道了無(wú)pparγ的滋養(yǎng)層干(ts)細(xì)胞在分化的第4天具有較低的tfeb水平,但是在腦細(xì)胞中使用gw9662(一種強(qiáng)效和已知的pparγ拮抗劑)的研究未揭示任何實(shí)質(zhì)性的pparγ參與(73)。這可能是由于細(xì)胞類型的變化,即分化ts細(xì)胞與成熟的原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)元或由于激活pparα的潛能水平不同而導(dǎo)致的。在settembre等人進(jìn)行的一項(xiàng)綜合性研究中,作者報(bào)道pparα和pgc1α在饑餓誘導(dǎo)應(yīng)激下是tfeb的靶點(diǎn),以及在饑餓應(yīng)激的情況中tfeb是自我調(diào)控的,但是tsunemi等人的另一項(xiàng)研究在亨廷頓氏舞蹈病情況中將pgc1α放置在tfeb的上游。tfeb經(jīng)由pparα和pgc1α調(diào)控脂質(zhì)代謝是相當(dāng)有可能的,pparα和pgc1α這兩者在調(diào)控脂質(zhì)代謝中均具有非常重要的作用。但是另一方面,當(dāng)前數(shù)據(jù)表明直接刺激pparα可誘導(dǎo)pparα-rxrα-pgc1α復(fù)合物在tfeb啟動(dòng)子上的募集并因此影響溶酶體生物生成。

      雖然應(yīng)激反應(yīng)直接調(diào)控tfeb功能,當(dāng)前發(fā)現(xiàn)表明通過(guò)外部刺激激活pparα以及rxrα也能調(diào)控tfeb,這反過(guò)來(lái)又可以控制pparα或負(fù)責(zé)脂質(zhì)代謝的其他基因的表達(dá)。然而,還需要更詳細(xì)的研究來(lái)解釋任何此種前饋調(diào)控機(jī)理的存在以及脂質(zhì)代謝和溶酶體生物生成之間的明顯雙向相互影響。

      總之,這一研究測(cè)試了降脂藥物如吉非羅齊能經(jīng)由pparα介導(dǎo)的tfeb激活在腦細(xì)胞中上調(diào)溶酶體生物生成的新假說(shuō)??紤]到在某些疾病情況中tfeb所起到的重要作用,對(duì)將tfeb認(rèn)定為治療靶點(diǎn)的興趣日增。這一研究的結(jié)果凸顯了pparα的未被發(fā)現(xiàn)的性質(zhì),描述了對(duì)lsd的新治療選擇,并揭示更動(dòng)態(tài)的tfeb調(diào)控以及激起了對(duì)理解脂質(zhì)代謝途徑和溶酶體生物生成之間的聯(lián)系的興趣。

      實(shí)施例9–降膽固醇藥物上調(diào)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中tfebmrna的表達(dá)

      圖9示出了降膽固醇藥物(辛伐他汀和普伐他汀)、阿司匹林(鎮(zhèn)痛劑和退熱劑)、肉桂酸(肉桂代謝物)和用于尿素循環(huán)障礙的藥物(苯丁酸鈉和苯甲酸鈉)上調(diào)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中tfebmrna的表達(dá)。將小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清條件下用不同濃度(參見(jiàn)圖9)的辛伐他汀和普伐他汀(a)、(b)、肉桂酸(c)以及苯丁酸鈉和苯甲酸鈉(d)孵育5小時(shí),之后通過(guò)半定量rt-pcr監(jiān)測(cè)tfeb的mrna表達(dá)。使用甲酸鈉(d)作為苯丁酸鈉和苯甲酸鈉的陰性對(duì)照。

      實(shí)施例10–阿司匹林誘導(dǎo)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體的生物生成

      我們考查世界上最廣泛使用的藥物之一阿司匹林能否上調(diào)小鼠腦細(xì)胞中溶酶體的生物生成。將星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中用不同劑量的阿司匹林處理,之后進(jìn)行l(wèi)yso-tracker染色。根據(jù)增加的lyso-tracker染色明顯可見(jiàn),2和5μm劑量下的阿司匹林明顯增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體的生物生成(圖10)。然而,在10μm的劑量下,阿司匹林在增加溶酶體生物生成方面不是特別有效的(圖10)。

      實(shí)施例11–阿司匹林增加小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中l(wèi)amp2的表達(dá)

      lamp2是重要的溶酶體膜蛋白,其在新溶酶體的形成中起關(guān)鍵作用。我們觀察到在星形膠質(zhì)細(xì)胞中阿司匹林引起lamp2mrna(圖11a)和蛋白(圖11c)表達(dá)的時(shí)間依賴性增加。再次地,劑量依賴性實(shí)驗(yàn)顯示在2和5μm阿司匹林的劑量下lamp2蛋白表達(dá)增加(圖11b)。阿司匹林引起的lamp2增加通過(guò)免疫染色得到進(jìn)一步的證實(shí)(圖11d)。

      實(shí)施例12–阿司匹林上調(diào)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中tpp1的表達(dá)和活性

      三肽基肽酶1(tpp1)是后期嬰兒型巴騰氏病的靶分子,因?yàn)樵谶@種疾病中缺乏這一蛋白的活性。我們考查阿司匹林能否上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的tpp1。再次地,劑量依賴性研究顯示在較低的阿司匹林劑量(2和5μm)下tpp1蛋白增加(圖12a)。響應(yīng)于5μm阿司匹林的tpp1蛋白的增加早在2h時(shí)即是明顯的,其在孵育12h時(shí)最大(圖12b)。再次地,我們觀察到在2和5μm的阿司匹林下tpp1活性增加,但在10μm的阿司匹林下不增加(圖12c)。

      實(shí)施例13–阿司匹林上調(diào)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中tfeb的表達(dá)

      根據(jù)近期發(fā)現(xiàn),tfeb是溶酶體生物生成的主調(diào)控因子(9,12,25)。多年以來(lái),不同團(tuán)隊(duì)已強(qiáng)調(diào)了溶酶體在不同疾病情況中的作用(48,49,52,53)。據(jù)報(bào)道在患有g(shù)raves眼病的患者的眼眶脂肪中溶酶體相關(guān)基因被嚴(yán)密調(diào)控,而溶酶體進(jìn)程的下調(diào)改進(jìn)了聚乙二醇化脂聚復(fù)合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染(53,54)。溶酶體生物生成的增加可能不一定證明在所有疾病和細(xì)胞類型中均是有益的,但是在一些情況中,自噬-溶酶體途徑的誘導(dǎo)可能有助于毒性廢物的細(xì)胞清除(55,56)。在過(guò)去幾年里,tfeb已成為一些溶酶體相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。根據(jù)tsunemi等人(57),經(jīng)由pgc1α激活轉(zhuǎn)錄因子eb(tfeb)可以導(dǎo)致htt轉(zhuǎn)化的增加和蛋白聚集體的消除。有報(bào)道表明α-突觸核蛋白毒性和受損的tfeb功能之間的聯(lián)系以及將tfeb認(rèn)定為pd的神經(jīng)保護(hù)療法的靶點(diǎn)(59)。還表明tfeb激活增強(qiáng)戈謝病中去穩(wěn)定的葡糖腦苷脂酶(gc)變體的折疊、運(yùn)輸和活性。在tay-sachs病(另一種lsd)的情況中,表明tfeb救濟(jì)β-己糖胺酶突變體的活性。這些發(fā)現(xiàn)將tfeb描述為溶酶體蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的特異性調(diào)控因子和救濟(jì)lsd的酶穩(wěn)態(tài)的治療靶點(diǎn)(60,61)。

      因此,我們考查阿司匹林能否上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的tfeb。劑量依賴性研究顯示在2和5μm阿司匹林的劑量下,阿司匹林能夠增加tfeb的蛋白水平(圖13a)。阿司匹林引起的tfeb上調(diào)通過(guò)免疫熒光分析得到進(jìn)一步的證實(shí)(圖13b)。我們還將tfeb啟動(dòng)子克隆至pgl3enhancer載體中并考查被tfeb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告因子活性。有趣的是,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中阿司匹林誘導(dǎo)tfeb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性(圖13c),表明阿司匹林增加tfeb基因的轉(zhuǎn)錄。

      實(shí)施例14–阿司匹林誘導(dǎo)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中pparα的激活。

      最近,我們已發(fā)現(xiàn)pparα在tfeb的轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。因此,在此,我們考查了阿司匹林能否誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中pparα的激活。首先,我們采用電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(emsa)來(lái)監(jiān)測(cè)pparα的dna結(jié)合活性,并發(fā)現(xiàn)阿司匹林引起pparα激活的時(shí)間依賴性增加(圖14a)。為了證實(shí)這些結(jié)果,我們從wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠分離星形膠質(zhì)細(xì)胞,并監(jiān)測(cè)ppar的轉(zhuǎn)錄活性。有趣的是,阿司匹林在從wt和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中增加ppre驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性,但在從pparα(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中不增加ppre驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性(圖14b),表明阿司匹林能夠誘導(dǎo)pparα的激活,但不能誘導(dǎo)pparβ的激活。

      實(shí)施例15–阿司匹林經(jīng)由pparα上調(diào)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中的tfeb

      將從wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞用5μm阿司匹林處理,之后進(jìn)行tfeb的免疫熒光分析。圖15顯示阿司匹林在從wt和pparβ(-/-)小鼠中分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)tfeb的表達(dá),但在從pparα(-/-)小鼠中分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中不誘導(dǎo)tfeb的表達(dá)。這些結(jié)果表明阿司匹林需要pparα但不需要pparβ來(lái)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中的tfeb。

      實(shí)施例16–阿司匹林經(jīng)由pparα增加小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體的生物生成

      因?yàn)閠feb是溶酶體基因表達(dá)和生物生成的主調(diào)控因子(9,12,16),我們考查了阿司匹林對(duì)溶酶體生物生成的影響。將從wt、pparα(-/-)和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞用不同劑量的阿司匹林處理,之后監(jiān)測(cè)lamp2的水平。根據(jù)圖16a-b明顯可見(jiàn),阿司匹林在從wt和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中但未在從pparα(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中劑量依賴性增加lamp2的水平。我們還考查了通過(guò)lyso-tracker染色溶酶體的狀態(tài)。與lamp2結(jié)果類似,阿司匹林在從wt和pparβ(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中但未在從pparα(-/-)小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中增加溶酶體的生物生成(圖17)。

      實(shí)施例17–對(duì)實(shí)施例10-16的討論

      阿司匹林相對(duì)于其他可用療法對(duì)于溶酶體貯積癥具有一些優(yōu)勢(shì)。一方面,阿司匹林已在整個(gè)世界范圍內(nèi)被廣泛用作鎮(zhèn)痛劑數(shù)十年。另一方面,其可口服,口服是痛苦最少的途徑。盡管已報(bào)道阿司匹林在高劑量下表現(xiàn)出一些毒性作用(胃潰瘍、胃出血和耳鳴等)(74),但在我們的研究中,阿司匹林在低劑量(2和5μm)下推進(jìn)溶酶體的生物生成,并且在低劑量下,阿司匹林可能是無(wú)毒的。然而,即使在較低的劑量下阿司匹林表現(xiàn)出任何毒性作用(例如胃潰瘍),也有方法減少其副作用。例如,腸溶包衣的阿司匹林可用于口服用途,并且避免在胃里降解。在一項(xiàng)開(kāi)放隨機(jī)試驗(yàn)中,緩釋制劑中的低劑量阿司匹林顯示出作為抗血小板劑的功效(75),并且沒(méi)有非常明顯的副作用。一項(xiàng)研究(76)使用s-腺苷基-甲硫氨酸(sam)(在體內(nèi)自然形成的一種氨基酸)并發(fā)現(xiàn)500mg劑量的sam與大劑量的阿司匹林(1300mg)一起給予使胃損傷的量減少90%。

      總之,我們已證實(shí)了阿司匹林(一種廣泛使用的鎮(zhèn)痛劑)經(jīng)由pparα-介導(dǎo)的tfeb上調(diào)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體的生物生成。這些結(jié)果凸顯了該藥物可以作為主要或輔助療法用于后期嬰兒型巴騰氏病和其他lsd的治療性干預(yù)。

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      5.fuster,j.j.,gonzalez,j.m.,edo,m.d.,viana,r.,boya,p.,cervera,j.,verges,m.,rivera,j.和andres,v.(2010)tumorsuppressorp27(kip1)undergoesendolysosomaldegradationthroughitsinteractionwithsortingnexin6.fasebj24,2998‐3009

      6.korolchuk,v.i.,saiki,s.,lichtenberg,m.,siddiqi,f.h.,roberts,e.a.,imarisio,s.,jahreiss,l.,sarkar,s.,futter,m.,menzies,f.m.,o'kane,c.j.,deretic,v.和rubinsztein,d.c.(2011)lysosomalpositioningcoordinatescellularnutrientresponses.natcellbiol13,453‐460

      7.boya,p.和kroemer,g.(2008)lysosomalmembranepermeabilizationincelldeath.oncogene27,6434‐6451

      8.martina,j.a.,diab,h.i.,lishu,l.,jeong,a.l.,patange,s.,raben,n.和puertollano,r.(2014)thenutrient‐responsivetranscriptionfactortfe3promotesautophagy,lysosomalbiogenesisclearanceofcellulardebris.scisignal7,ra9

      9.palmieri,m.,impey,s.,kang,h.,dironza,a.,pelz,c.,sardiello,m.和ballabio,a.(2011)characterizationoftheclearnetworkrevealsanintegratedcontrolofcellularclearancepathways.hummolgenet20,3852‐3866

      10.sardiello,m.,palmieri,m.,dironza,a.,medina,d.l.,valenza,m.,gennarino,v.a.,dimalta,c.,donaudy,f.,embrione,v.,polishchuk,r.s.,banfi,s.,parenti,g.,cattaneo,e.和ballabio,a.(2009)agenenetworkregulatinglysosomalbiogenesisandfunction.science325,473‐477

      11.marschner,k.,kollmann,k.,schweizer,m.,braulke,t.和pohl,s.(2011)akeyenzymeinthebiogenesisoflysosomesisaproteasethatregulatescholesterolmetabolism.science333,87‐90

      12.settembre,c.,dimalta,c.,polito,v.a.,garciaarencibia,m.,vetrini,f.,erdin,s.,erdin,s.u.,huynh,t.,medina,d.,colella,p.,sardiello,m.,rubinsztein,d.c.和ballabio,a.(2011)tfeblinksautophagytolysosomalbiogenesis.science332,1429‐1433

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      14.settembre,c.,zoncu,r.,medina,d.l.,vetrini,f.,erdin,s.,huynh,t.,ferron,m.,karsenty,g.,vellard,m.c.,facchinetti,v.,sabatini,d.m.和ballabio,a.(2012)alysosome‐to‐nucleussignallingmechanismsensesandregulatesthelysosomeviamtorandtfeb.emboj31,1095-1108

      15.settembre,c.,fraldi,a.,medina,d.l.和ballabio,a.(2013)signalsfromthelysosome:acontrolcentreforcellularclearanceandenergymetabolism.natrevmolcellbiol14,283‐296

      16.settembre,c.,decegli,r.,mansueto,g.,saha,p.k.,vetrini,f.,visvikis,o.,huynh,t.,carissimo,a.,palmer,d.,klisch,t.j.,wollenberg,a.c.,dibernardo,d.,chan,l.,irazoqui,j.e.和ballabio,a.(2013)tfebcontrolscellularlipidmetabolismthroughastarvation‐inducedautoregulatoryloop.natcellbiol15,647‐658

      17.robins,s.j.,collins,d.,wittes,j.t.,papademetriou,v.,deedwania,p.c.,schaefer,e.j.,mcnamara,j.r.,kashyap,m.l.,hershman,j.m.,wexler,l.f.和rubins,h.b.(2001)relationofgemfibroziltreatmentandlipidlevelswithmajorcoronaryevents:va‐hit:arandomizedcontrolledtrial.jama285,1585‐1591

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      23.corbett,g.t.,roy,a.和pahan,k.(2012)gemfibrozil,alipid‐loweringdrug,upregulatesil‐1receptorantagonistinmousecorticalneurons:implicationsforneuronalself‐defense.jimmunol189,1002‐1013

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      25.saha,r.n.和pahan,k.(2007)differentialregulationofmn‐superoxidedismutaseinneuronsandastrogliabyhiv‐1gp120:implicationsforhiv‐associateddementia.freeradicbiolmed42,1866‐1878

      26.giulian,d.和baker,t.j.(1986)characterizationofameboidmicrogliaisolatedfromdevelopingmammalianbrain.jneurosci6,2163‐2178

      27.jana,m.和pahan,k.(2005)redoxregulationofcytokine‐mediatedinhibitionofmyelingeneexpressioninhumanprimaryoligodendrocytes.freeradicbiolmed39,823-831

      28.khasnavis,s.,jana,a.,roy,a.,wood,t.,ghosh,s.,watson,r.和pahan,k.suppressionofnuclearfactor‐kappabactivationandinflammationinmicrogliabyaphysically‐modifiedsaline.jbiolchem

      29.khasnavis,s.和pahan,k.sodiumbenzoate,ametaboliteofcinnamonandafoodadditive,upregulatesneuroprotectiveparkinsondiseaseproteindj‐1inastrocytesandneurons.jneuroimmunepharmacol7,424‐435

      30.dasgupta,s.,jana,m.,zhou,y.,fung,y.k.,ghosh,s.和pahan,k.(2004)antineuroinflammatoryeffectofnf‐kappabessentialmodifier‐bindingdomainpeptidesintheadoptivetransfermodelofexperimentalallergicencephalomyelitis.jimmunol173,1344‐1354

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      雖然已參照本發(fā)明的特定示例性實(shí)施方式描述和舉例說(shuō)明了本發(fā)明,但并未預(yù)期將本發(fā)明限于這些示例性實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在不偏離隨后的權(quán)利要求所限定的發(fā)明的真實(shí)范圍和精神的情況下可以進(jìn)行變化和修改。因此預(yù)期在本發(fā)明內(nèi)包括所有這些落在隨附的權(quán)利要求及其等同方案的范圍內(nèi)的變化和修改。

      序列表

      <110>拉什大學(xué)醫(yī)學(xué)中心

      <120>用于治療溶酶體病癥的組合物和方法

      <130>14904-129(475)

      <150>us62/081,696

      <151>2014-11-19

      <160>18

      <170>patentinversion3.5

      <210>1

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工小鼠tfeb引物,有義鏈

      <400>1

      aacaaaggcaccatcctcaa20

      <210>2

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工小鼠tfeb引物,反義鏈

      <400>2

      cagctcggccatattcacac20

      <210>3

      <211>24

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工小鼠lamp2引物,有義鏈

      <400>3

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      <210>4

      <211>24

      <212>dna

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      <400>4

      accacccaatctaagagcaggact24

      <210>5

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

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      <400>5

      tgttgaaacgggagacatca20

      <210>6

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

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      <400>6

      tggtgacaaccaaagtcgtg20

      <210>7

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      <212>dna

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      <223>人工小鼠npc1引物,有義鏈

      <400>7

      gggatgcccgtgcctgcaat20

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      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工小鼠npc1引物,反義鏈

      <400>8

      ctggcagctacatggccccg20

      <210>9

      <211>20

      <212>dna

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      <400>9

      gcacagtcaaggccgagaat20

      <210>10

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      <212>dna

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      gccttctccatggtggtgaa20

      <210>11

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      <212>dna

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      <400>11

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      <212>dna

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      <220>

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      <400>12

      agatctaaggagaaactgagtccgggcagaagg33

      <210>13

      <211>39

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>突變啟動(dòng)子位點(diǎn)的人工引物,有義鏈

      <400>13

      gcaacagcaagtgcggatttgagggggggggacggtggg39

      <210>14

      <211>39

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>突變啟動(dòng)子位點(diǎn)的人工引物,反義鏈

      <400>14

      cccaccgtccccccccctcaaatccgcacttgctgttgc39

      <210>15

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工set1引物,有義鏈

      <400>15

      gaacattccaggtggaggca20

      <210>16

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工set1引物,反義鏈

      <400>16

      cccccaacacatgcttctct20

      <210>17

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工set2引物,有義鏈

      <400>17

      gagtctctcggaggaggtga20

      <210>18

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>人工set2引物,反義鏈

      <400>18

      actccaggcatgctttctcc20

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