本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術領域，具體涉及γ-氨基丁酸在制備心臟保護藥物制劑中的應用。

背景技術：

海洋可食性魚類營養(yǎng)豐富，味道鮮美，而且還有很多保健功能，具有重要食用價值和經濟價值。隨著現(xiàn)代分離技術和生物技術的發(fā)展使人們對魚類資源的利用不再局限于海水養(yǎng)殖業(yè)，其研究內容涉及生態(tài)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥、毒理、遺傳和分子生物學等諸多領域。對低值魚類資源進行高值化開發(fā)利用，為人類提供理想的海洋食品及海洋藥物，并創(chuàng)造出宏觀的經濟效益，將有助于推動我國海洋產業(yè)的迅速發(fā)展。

心臟是脊椎動物身體中最重要的一個器官。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應氧和各種營養(yǎng)物質(如水、無機鹽、葡萄糖、蛋白質、各種水溶性維生素等)，并帶走代謝的終產物(如二氧化碳、尿素和尿酸等)，使細胞維持正常的代謝和功能。體內各種內分泌的激素和一些其它體液因素，也要通過血液循環(huán)將它們運送到靶細胞，實現(xiàn)機體的體液調節(jié)，維持機體內環(huán)境的相對恒定。此外，血液防衛(wèi)機能的實現(xiàn)，以及體溫相對恒定的調節(jié)，也都要依賴血液在血管內不斷循環(huán)流動，而血液的循環(huán)是由于心臟“泵”的作用實現(xiàn)的。保護心臟的關鍵是加強心臟細胞的抗氧化性能，促進血液循環(huán)，降低血液中膽固醇含量。

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutiric acid,GABA)是哺乳動物、甲殼類動物、昆蟲和某些寄生蠕蟲神經系統(tǒng)中重要的抑制性神經遞質。少數(shù)植物中含有這種非蛋白質氨基酸。GABA參與多種代謝活動，具有抗氧化、降血壓、改善睡眠、抗焦慮、改善脂質代謝、降低體重、防止動脈硬化等功效，因此受到越來越多的科學工作者的關注。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供γ-氨基丁酸在制備心臟保護藥物制劑中的應用。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的方案如下：

γ-氨基丁酸(GABA)在制備心臟保護藥物制劑中的應用。

優(yōu)選的；γ-氨基丁酸(GABA)在制備保護氟所致心臟損傷藥物中的應用。

優(yōu)選的；所述GABA的制備方法：以低值魚類或其加工廢料為原料，經具有谷氨酸脫羧酶活性的微生物進行發(fā)酵，所得發(fā)酵物分離提純即得。

具體是：

1)將原料低值魚類或其加工廢料磨成勻漿，向勻漿中添加勻漿質量5-10倍體積(w/v)蒸餾水,配制成勻漿液，再向勻漿液中加入勻漿液體積的0-5wt％葡萄糖(v/w)，調節(jié)溶液pH值4.5-6.0，獲得微生物培養(yǎng)液。培養(yǎng)液滅菌后冷卻，而后接種具有谷氨酸脫羧酶活性的微生物，置于30℃-40℃條件下培養(yǎng)24-72小時，即得到富含具有谷氨酸脫羧酶活性微生物的菌懸液(溶液A)；

2)調節(jié)溶液A的pH值為5.5-6.5，加入溶液A體積的0.5％-2wt％谷氨酸鈉(v/w)，配成富含谷氨酸鈉的培養(yǎng)液(溶液B)，溶液B置于35℃-40℃條件下培養(yǎng)72-120小時，即得到富含GABA的發(fā)酵液；

3)富含GABA的發(fā)酵液去菌體、去油脂：將步驟2)獲得發(fā)酵液以2000-5000r/min的速度，離心5-20分鐘，取上層液體置于高壓滅菌鍋中，進一步滅菌，得無菌體發(fā)酵液，無菌體發(fā)酵液經索氏提取法去油脂后，得到無菌體、無油脂的發(fā)酵液；

4)無菌體、無油脂發(fā)酵液脫色：采用活性炭或SD300樹脂脫色得無色透明發(fā)酵液，待用；

5)無色透明發(fā)酵液中GABA的分離純化：將步驟4)獲得無色透明發(fā)酵液上預處理過的732樹脂(氫型)交換柱，以2-5mL/min的流速充分進行交換吸附，吸附后經去離子水洗滌至pH6.0，用100-200ml 0.1-0.2mol/L堿性溶液洗，再用1-2mol/L堿性溶液以2-5mL/min的流速進行洗脫；洗脫過程中用茚三酮丙酮溶液進行顯色，收集茚三酮反應呈藍色，pH6.0左右的流出液，以高效液相色譜法檢測每管流出液中GABA含量，將GABA含量較高的流出液合并，減壓濃縮，即為分離純化后的GABA。

優(yōu)選的；所述步驟4)采用活性炭對無菌體、無油脂發(fā)酵液脫色處理是向無菌體、無油脂發(fā)酵液中添加0.5％-5％(w/v)的活性炭，于60-90℃水浴10-30分鐘，趁熱真空抽濾，得無色透明發(fā)酵液；

SD300樹脂脫色對無菌體、無油脂發(fā)酵液脫色處理是向無菌體、無油脂發(fā)酵液中添加5％-10％SD300樹脂，20-30℃，搖床100rpm脫色3小時，抽濾得無色透明發(fā)酵液。

優(yōu)選的；步驟5)所述減壓濃縮到1/20-1/10體積后，得到分離純化后的GABA濃縮液，利用高效液相色譜法檢測濃縮液中GABA的純度。

優(yōu)選的；步驟5)所述堿性溶液為氫氧化鈉溶液或氨水。

心臟受損模型，喂食以氟化鈉造模的心臟損傷模型小鼠濃度為0.1-2.0g/L分離純化的GABA 5-20天，通過心臟細胞形態(tài)結構、心臟組織丙二醛水平的變化以及心臟血液中高密度脂蛋白和神經營養(yǎng)因子的變化情況，表明GABA具有明顯的保護心臟作用。

檢測分離純化的GABA保護心臟能力：

1)以氟化鈉建立心臟受損小鼠模型。

2)喂食模型小鼠濃度為0.1-2.0g/L分離純化的GABA 5-20天。

3)通過心臟細胞細胞形態(tài)結構、心臟組織丙二醛、高密度脂蛋白、神經營養(yǎng)因子水平的變化情況，表明GABA具有明顯的心臟保護作用。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1)衛(wèi)生部2009年第十二號令食品級GABA生產工藝：以L-谷氨酸鈉為底物經安全菌株發(fā)酵、加熱殺菌、冷卻、活性炭處理、過濾、噴霧干燥等步驟生產而成。目前生產線普遍以20％純度批量生產食品級GABA，本發(fā)明分離純化所得GABA為安全菌株生物轉化L-谷氨酸鈉制得，純度為60％以上，其純度遠高于目前市面所售食品級GABA純度。

2)本發(fā)明提供了GABA的新用途，GABA對心臟的保護作用可以從多個方面得以實現(xiàn)：(1)GABA對心臟細胞具有顯著的營養(yǎng)、保護作用；(2)GABA的抗氧化性能對心臟細胞的凋亡起到抑制作用，防止心肌細胞衰老；(3)GABA能提高心臟血液中高密度脂蛋白含量。高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因子。俗稱“血管清道夫”，它對維持心臟正常功能起到了關鍵作用。(4)GABA能增加心臟組織神經生長因子含量。心臟內的血管平滑肌和心肌的運動，均受自主神經系統(tǒng)調節(jié)。神經生長因子對心臟內分布的神經元的發(fā)育、分化、生長、再生具有重要的調控作用。通過營養(yǎng)心臟內的神經細胞，使心臟內的血流量充足，心肌收縮功能得以正常發(fā)揮。

3)本發(fā)明獲得的GABA是從低值魚類或其加工廢棄物發(fā)酵液中分離純化所得GABA，具有無毒性，易吸收的顯著特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的心臟細胞在顯微鏡40倍物鏡下的顯微結構圖，其中(a)正常組心臟顯微結構，(b)陰性對照組心臟顯微結構，(c)陽性對照組心臟顯微結構，(d)分離純化GABA組心臟顯微結構；

圖2為高效液相色譜法檢測分離純化GABA的純度。

具體實施方式

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1

1.新鮮紅娘魚用粉碎機磨成勻漿后，添加紅娘魚勻漿質量10體積的(w/v)蒸餾水，配制成勻漿液，再向勻漿液中加入勻漿液體積的1wt％葡萄糖(v/w)，調節(jié)溶液pH值為5.5，配制成微生物培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基經121℃，滅菌15分鐘。冷卻后按1％接種量(v/v)接種乳酸鏈球菌，置于30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)1天，得到富含乳酸鏈球菌的菌懸液。

2.將富含乳酸鏈球菌的菌懸液pH值調制6.0，并向菌懸液中添加菌懸液體積的1wt％谷氨酸鈉(v/w)，置于37℃恒溫箱，靜置培養(yǎng)72小時，得到GABA含量為4.8g/L的紅娘魚發(fā)酵液。

所述乳酸鏈球菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京，編號為bio-52538。

3.對富含GABA的紅娘魚發(fā)酵液中的GABA進行分離提純。

1)富含GABA的紅娘魚發(fā)酵液去菌體、去油脂：將步驟2獲得發(fā)酵液以4000r/min的速度離心10分鐘，取上層液體高壓滅菌，得無菌體發(fā)酵液。無菌發(fā)酵液經索氏提取法去除油脂后，得到無菌體、無油脂發(fā)酵液。

2)無菌體、無油脂發(fā)酵液脫色：以SD300樹脂進行脫色處理，具體是向上述獲得無菌體、無油脂發(fā)酵液中添加5％SD300樹脂(w/v)，25℃，搖床100rpm，脫色3小時，抽濾得無色透明發(fā)酵液。

3)無色透明發(fā)酵液中GABA的分離純化：將上述無色透明液上預處理過的732樹脂(氫型)交換柱，以3mL/min的流速，讓其充分進行交換吸附。吸附完畢后用去離子水洗滌至pH6.0。先用150ml 0.1mol/L氫氧化鈉洗，再用1mol/L氫氧化鈉以3mL/min的流速進行洗脫。在洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮溶液進行顯色測試，并用pH試紙檢測pH的變化。當茚三酮反應呈藍色，pH6.0左右時，保留流出液，直至茚三酮藍色反應消失為止，以高效液相色譜法檢測收集管中GABA含量，合并GABA含量較高的收集管中的流出液(GABA水溶液pH值約為6，且與茚三酮反應呈藍色，由此可判斷流出液pH值為6，且與茚三酮反應呈藍色，其內所含的氨基酸為GABA)，經減壓濃縮至1/20體積，得分離提純GABA濃縮液。

實施例2

1.紅娘魚內臟(加工廢棄物)，添加其5倍體積(w/v)蒸餾水，配成溶液,向溶液中添加溶液體積的2.0wt％葡萄糖(v/w)，調節(jié)pH值為5.0，配制成微生物培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液經121℃，滅菌20分鐘。冷卻后按1％接種量(v/v)接種鳥腸球菌，置于37℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)36小時，得到富含鳥腸球菌的菌懸液。

2.向富含鳥腸球菌的菌懸液中添加菌懸液體積的2wt％谷氨酸鈉(v/w)，調節(jié)pH值為5.5，配成富含谷氨酸鈉培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)96小時，獲得GABA含量為5.7g/L的紅娘魚內臟發(fā)酵液。

所述鳥腸球菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京，編號為CGMCC9184。

3.對富含GABA的紅娘魚內臟發(fā)酵液中的GABA進行分離提純。

1)富含GABA的紅娘魚內臟發(fā)酵液去菌體、去油脂：3000r/min，離心15分鐘，取上層液體高溫高壓滅菌，得無菌體發(fā)酵液。無菌體發(fā)酵液經索氏提取法去除油脂，得無菌體、無油脂發(fā)酵液。

2)無菌體、無油脂發(fā)酵液脫色：SD300樹脂進行脫色處理，具體向上述獲得的無菌體、無油脂發(fā)酵液中添加10％SD300樹脂(w/v)，25℃，搖床100rpm，脫色4小時，抽濾得無色透明發(fā)酵液。

3)無色透明發(fā)酵液中GABA的分離純化：將上述無色透明液上預處理過的732樹脂(氫型)交換柱，流速取3mL/min，讓其充分進行交換吸附。吸附完畢后用去離子水洗滌至pH6.0。先用150ml 0.1mol/L氨水洗，再用1mol/L氨水以3mL/min的流速進行洗脫。在洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮溶液進行顯色測試，并用pH試紙檢測pH的變化。當茚三酮反應呈藍色，pH6.0左右時，保留流出液，以高效液相色譜法檢測收集管中GABA含量，合并GABA含量較高的收集管中的流出液(GABA水溶液pH值約為6，且與茚三酮反應呈藍色，由此可判斷流出液pH值為6，且與茚三酮反應呈藍色，其內含有GABA)，經減壓濃縮至1/10體積，得分離提純GABA濃縮液。

實施例3

1.鳀魚水煮濃縮廢棄液，添加該廢棄液5倍體積的(v/v)蒸餾水,配制成稀釋液，再向稀釋液中加入稀釋液體積的1wt％葡萄糖(v/w)，調節(jié)pH值為6.0，配制成微生物培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液經121℃，滅菌20分鐘。冷卻后按1％接種量(v/v)接種短乳桿菌，置于37℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時，得到富含短乳桿菌的菌懸液。

2.向富含短乳桿菌的菌懸液中添加菌懸液體積的1.5wt％谷氨酸鈉(v/w)，調節(jié)pH值為6.5，配成富含谷氨酸鈉培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)100小時，獲得GABA含量為5.81g/L的鳀魚水煮廢棄液發(fā)酵液。

所述短乳桿菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京，編號為CGMCC1.2028。

3.對富含GABA的鳀魚水煮廢棄液發(fā)酵液中的GABA進行分離提純。

1)富含GABA的鳀魚水煮廢棄液發(fā)酵液去菌體、去油脂：5000r/min，離心10分鐘，取上層液體高溫高壓進一步滅菌，得無菌體發(fā)酵液。無菌體發(fā)酵液經索氏提取法去除油脂，得無菌體、無油脂發(fā)酵液。

2)無菌體、無油脂發(fā)酵液活性炭脫色：無菌體、無油脂發(fā)酵液中添加1.5％活性炭(w/v)，80℃，脫色30分鐘，抽濾得無色透明發(fā)酵液。

3)無色透明發(fā)酵液中GABA的分離純化：將上述無色透明發(fā)酵液上預處理過的732樹脂(氫型)交換柱，流速取3mL/min，讓其充分進行交換吸附。吸附完畢后用去離子水洗滌至pH6.0。先用150ml 0.1mol/L氨水洗，再用1mol/L氨水以3mL/min的流速進行洗脫。在洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮溶液進行顯色測試，并用pH試紙檢測pH的變化。當茚三酮反應呈藍色，pH6.0左右時，保留流出液，以高效液相色譜法檢測收集管中GABA含量，合并GABA含量較高的收集管中的流出液(GABA水溶液pH值約為6，且與茚三酮反應呈藍色，由此可判斷流出液pH值為6，且與茚三酮反應呈藍色，其內含有GABA)。經減壓濃縮至1/10體積，得分離提純GABA濃縮液。

將上述實施例1、2和3分離提純的GABA濃縮液合并，采用高效液相色譜法檢測GABA的純度，結果如圖2所示，其中GABA的含量為63％，其他可檢測出的氨基酸的含量為：Ala丙氨酸2％、Gly甘氨酸8％、Arg精氨酸5％。丙氨酸、甘氨酸、精氨酸均為人體內常見氨基酸，其含量較低，均在安全攝入范圍之內，不會對人體或受試動物產生不良生理影響。

實施例4

利用上述合并的分離提純的GABA濃縮液作為制備心臟保護藥物制劑中的應用，其保護心臟作用的試驗及其效果如下：

分離提純GABA的心臟保護試驗：

實驗動物：120只昆明種雄性小鼠18-22g/只。

動物模型：100只小鼠喂食0.1g/L NaF 30天，創(chuàng)建心臟受損模型小鼠。

藥物配制：將上述實施例1、2和3分離提純的GABA濃縮液合并，然后向合并液中添加純凈水配制成GABA含量為0.1g/L，0.5g/L，1.0g/L的溶液。

實驗分組：20只正常組(健康小鼠每日喂食純凈水)；20只陰性對照組(心臟受損小鼠每日喂食純凈水)；20只陽性對照組(心臟受損小鼠每日喂食美國原裝GNC健安喜輔酶Q10，服用劑量參照服用說明書)；20只低劑量分離提純GABA組(心臟受損小鼠每日喂食GABA含量為0.1g/L溶液)；20只中劑量分離提純GABA組(心臟受損小鼠每日喂食GABA含量為0.5/L溶液)；20只高劑量分離提純GABA組(心臟受損小鼠每日喂食GABA含量為1.0g/L溶液)。

實驗方法：心臟受損小鼠喂食純凈水，美國原裝GNC健安喜輔酶Q10，不同濃度分離提純GABA溶液14天后取心臟組織檢測心臟細胞形態(tài)結構，心臟組織丙二醛水平的變化以及心臟血液中高密度脂蛋白和神經營養(yǎng)因子含量的變化情況。丙二醛檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司，檢測方法參考說明書)檢測心臟組織丙二醛含量變化；高密度脂蛋白檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司，檢測方法參考說明書)檢測高密度脂蛋白含量的變化；神經營養(yǎng)因子Elisa試劑盒(美國Houston公司，檢測方法參考說明書)檢測心臟神經生長因子含量；心臟細胞結構觀察采用常規(guī)切片HE染色，顯微鏡下鏡檢。

檢測指標：心臟細胞形態(tài)結構變化情況，心臟組織丙二醛、高密度脂蛋白、神經營養(yǎng)因子含量的變化情況。

(1)心臟細胞形態(tài)結構變化結果如圖1所示：正常組心肌細胞排列緊密，細胞核位于細胞中央，細胞膜界限清晰，血細胞較多，血流量充盈；陰性對照組心肌細胞密度變小，排列松散，細胞膜界限不清晰，血細胞密度?。魂栃詫φ战M和喂食1g/L分離提純GABA組的心臟損傷現(xiàn)象有明顯改善，心肌細胞、血細胞密度高于陰性對照組，且細胞膜界限清晰，細胞核位于細胞中央。因此高濃度GABA(1g/L)對NaF誘導的心臟損傷具有明顯的改善作用，使心臟細胞組織結構趨于正常化，且與陽性對照組之間無明顯差異。

(2)心臟組織勻漿中神經營養(yǎng)因子含量變化結果顯示：喂食1g/L分離提純GABA組小鼠神經營養(yǎng)因子含量提高，接近于正常組數(shù)值，顯著高于陰性對照組，且與陽性對照組無顯著性差異，結果如表1所示；喂食0.1g/L和0.5g/L分離提純GABA組小鼠神經營養(yǎng)因子含量與陰性對照組無顯著性差異；證明低值魚或其加工廢棄物發(fā)酵液中分離提純的GABA在高濃度(1g/L)下對神經營養(yǎng)因子的合成有明顯的促進作用，能保障心臟中自主神經系調控功能的正常發(fā)揮，保障心臟的血流量和心肌跳動的節(jié)律性。

表1心臟組織勻漿中神經營養(yǎng)因子含量

*1.正常組小鼠每日喂食純凈水；2.陰性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食純凈水；3.陽性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食美國原裝GNC健安喜輔酶Q10(服用劑量參照說明書)；4.分離提純GABA組為心臟受損模型小鼠每日喂食1g/L分離提純所得GABA。

(3)丙二醛是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷因此在組織臟器衰老生理和抗性生理研究中丙二醛含量是一個常用指標，可通過丙二醛了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及組織臟器的抗逆性。服用1g/L分離純化GABA組小鼠心臟組織中的丙二醛含量要明顯低于陰性對照組，且與正常組和陽性對照組之間無顯著性差異，結果如表2所示；服用0.1g/L和0.5g/L分離純化GABA組小鼠心臟組織中的丙二醛含量與陰性對照組之間無顯著性差異。證明分離純化的GABA在高濃度(1g/L)下對被氟離子損害的心臟組織具有保護作用，可降低心臟細胞膜系統(tǒng)受損程度，提升心臟組織的抗逆性。

表2 GABA對心臟組織勻漿中丙二醛含量的影響

*正常組小鼠每日喂食純凈水；陰性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食純凈水；陽性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食美國原裝GNC健安喜輔酶Q10(服用劑量參照說明書)；分離提純GABA組為心臟受損模型小鼠每日喂食1g/L分離提純所得GABA。

(4)高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因子，俗稱“血管清道夫”。喂食1g/L分離提純GABA組小鼠心臟組織中高密度脂蛋白含量提高，結果如表3所示；喂食0.1g/L和0.5g/L分離提純GABA組小鼠心臟組織中高密度脂蛋白含量與陰性對照組無顯著性差異。

表3心臟組織中高密度脂蛋白含量

*正常組小鼠每日喂食純凈水；陰性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食純凈水；陽性對照組為心臟受損模型小鼠每日喂食美國原裝GNC健安喜輔酶Q10(服用劑量參照說明書)；分離提純GABA組為心臟受損模型小鼠每日喂食1g/L分離提純所得GABA。

由上述試驗結果顯示，低值魚或其加工廢棄物生物轉化的GABA具有顯著的保護心臟作用。