本發(fā)明涉及艾滋病相關(guān)神經(jīng)病理痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及嘌呤2X3受體拮抗劑A317491可用于制備減輕艾滋病相關(guān)神經(jīng)病理痛的藥物，其作用機(jī)理涉及抑制背根神經(jīng)節(jié)嘌呤2X(P2X3)受體介導(dǎo)的痛覺信息傳遞。
背景技術(shù)：
：1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染可引起某些神經(jīng)病變，造成艾滋病(AIDS)相關(guān)感覺功能紊亂，其主要表現(xiàn)形式是慢性疼痛，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，HIV-1病毒蛋白可引發(fā)痛行為，用病毒包膜糖蛋白120(gp120)處理的大鼠出現(xiàn)溫度痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏行為。gp120引起的艾滋病相關(guān)神經(jīng)病變以遠(yuǎn)端對稱性多發(fā)性神經(jīng)病(DSP)為主，其癥狀主要有神經(jīng)病理痛，如觸誘發(fā)痛、痛覺過敏等。DSP的病理特征包括背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元損傷，周圍神經(jīng)病理痛是HIV-1感染病人最常見的神經(jīng)病變，病變發(fā)生時(shí)，DRG的中樞和周圍傳入神經(jīng)纖維均受損，并傳遞神經(jīng)末梢的傷害性刺激信號到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。艾滋病相關(guān)周圍神經(jīng)病變危害著60％的1型人免疫缺陷病毒感染患者，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其針對性的治療日益受到研究者們的關(guān)注。三磷酸腺苷(ATP)是急慢性疼痛的重要信號分子，ATP及其作用的P2X受體涉及痛覺及傷害性信息在初級感覺神經(jīng)元的傳遞，其中主要是P2X3受體參與初級感覺神經(jīng)元的痛覺及傷害性信息傳遞。細(xì)胞外給予ATP可激動(dòng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的離子通道型受體P2X，后者是HIV病毒進(jìn)入巨噬細(xì)胞的必需物質(zhì)，表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞。研究表明，急性病毒感染時(shí)ATP信號參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，病毒、細(xì)胞損傷、炎癥等發(fā)生時(shí)，嘌呤受體在巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。gp120可通過與巨噬細(xì)胞相互作用，引起ATP釋放，阻斷嘌呤受體可減少人類免疫缺陷病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，P2X3與傳遞持續(xù)性慢性神經(jīng)病理性疼痛和炎癥性疼痛有關(guān)，基因敲除P2X3受體或應(yīng)用選擇性P2X3受體拮抗劑A317491可降低P2X3受體的表達(dá)，減輕模型動(dòng)物神經(jīng)病理痛痛行為。因此考慮P2X3受體也可能參與介導(dǎo)艾滋病相關(guān)周圍神經(jīng)病變。本實(shí)驗(yàn)通過gp120浸浴坐骨神經(jīng)大鼠模型，A317491處理后模型大鼠痛行為的變化，以及與介導(dǎo)神經(jīng)病理痛的P2X3受體表達(dá)變化的關(guān)系，為A317491在艾滋病并發(fā)神經(jīng)病理痛的預(yù)防和治療提供幫助。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供嘌呤2X3受體拮抗劑A317491的第一個(gè)新用途，即P2X3受體拮抗劑A317491在制備防治人類免疫缺陷病毒糖蛋白120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供嘌呤2X3受體拮抗劑A317491的第二個(gè)新用途，即P2X3受體拮抗劑A317491在制備人類免疫缺陷病毒糖蛋白120誘導(dǎo)神經(jīng)損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。嘌呤2X3(P2X3)受體拮抗劑A317491可降低背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X3受體的表達(dá)，抑制背根神經(jīng)節(jié)的傷害性信息傳遞，減輕神經(jīng)損傷及炎性物質(zhì)的傷害剌激，減輕人類免疫缺陷病毒糖蛋白120誘導(dǎo)神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為。附圖說明圖1為人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gp120浸浴坐骨神經(jīng)模型大鼠制模過程中的機(jī)械縮足反射閾值變化圖。A317491處理后對模型大鼠的機(jī)械痛行為具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。其中*p<0.05，**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖2為gp120模型大鼠制模過程中的熱縮足反射閾值變化圖。A317491處理后對模型大鼠的熱敏痛行為具有抑制作用。其中實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。其中*p<0.05，**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖3為gp120模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)嘌呤2X3(P2X3)受體核糖核酸的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(qPCR)結(jié)果圖。A317491處理后可降低gp120模型大鼠DRG上調(diào)的嘌呤2X3水平。實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。其中**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖4為gp120模型大鼠DRG的P2X3受體免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果圖。A317491處理后可降低模型大鼠DRG上調(diào)的P2X3受體水平。實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。其中**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖4(a)為免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖4(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖5為gp120模型大鼠DRG的P2X3受體蛋白印跡檢測結(jié)果圖。A317491處理后可降低gp120模型大鼠DRG上調(diào)的P2X3受體水平。實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。圖5(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖5(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖6為gp120模型大鼠DRG的(p)ERK1/2蛋白印跡檢測結(jié)果圖。A317491處理后可降低gp120模型大鼠DRG上調(diào)的pERK1/2水平。實(shí)驗(yàn)分組：對照組；假手術(shù)組；gp120模型組；gp120模型+A317491處理組。圖6(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中**p<0.01表示和正常組比較，##p<0.01表示與gp120模型組比較。圖7為原代分離與培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。Gp120處理后，使用P2X3受體特異性激動(dòng)劑α,β-meATP(α,β-亞甲基三磷酸腺苷)激動(dòng)電流幅度與對照組神經(jīng)元細(xì)胞比較有顯著差異，細(xì)胞分組：對照組，gp120模型組。圖7(a)為α,β-亞甲基三磷酸腺苷分別在對照組、gp120模型組背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元激活電流圖，圖7(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中**p<0.01表示和正常組比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例并對照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法，制成適用于艾滋病神經(jīng)病理痛治療的口服或注射的嘌呤2X3受體拮抗劑A317491制劑。實(shí)施例2。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法，制成適用于涉及艾滋病并發(fā)神經(jīng)損傷相關(guān)疾病治療的口服或注射的嘌呤2X3受體拮抗劑A317491制劑。實(shí)施例3。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的方法，制成適用于涉及艾滋病并發(fā)感覺神經(jīng)炎性相關(guān)疾病治療的口服或注射的嘌呤2X3受體拮抗劑A317491制劑?？傊堰?X3受體拮抗劑A317491制劑以口服、注射、含片或其它局部或全身用藥劑型藥物進(jìn)行上述疾病防治。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以嘌呤2X3受體拮抗劑A317491制劑對P2X3受體介導(dǎo)的艾滋病相關(guān)神經(jīng)疾病治療作用研究的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果來證明嘌呤2X3受體拮抗劑A317491的用途。一、材料和方法。1.動(dòng)物和分組。健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。健康SD雄性大鼠32只，體重200～250g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，對照組(Ctrl)8只，模型組：用10％水合氯醛麻醉(3ml/kg，腹腔注射)大鼠，無菌條件下，取大鼠左大腿后外側(cè)切口，鈍性分離出坐骨神經(jīng)，用250ul人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gp120(用含0.1％大鼠血清的生理鹽水溶解200nggp120)浸透的外科可吸收性無菌明膠海綿(祥恩，2×6mm)，疏松包裹在坐骨神經(jīng)的三支分叉近端。假手術(shù)組：用250ul含0.1％大鼠血清的生理鹽水浸透的外科可吸收性無菌明膠海綿(祥恩，2×6mm)，疏松包裹在坐骨神經(jīng)的三支分叉近端。模型+A317491組：建模術(shù)后第7天對造模成功的大鼠隨機(jī)選取8只進(jìn)行嘌呤2X3受體拮抗劑A317491在體鞘內(nèi)注射，A317491由Sigma公司提供，注射劑量為：10-6mg/kg(用生理鹽水溶解成終濃度為15mg/ml的溶液進(jìn)行注射)。建模術(shù)后兩周，將四組SD大鼠迅速斷頭，取材(左側(cè)L4～L6背根神經(jīng)節(jié))。2.藥物與試劑。人類免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gp120(Sigma公司)，A317491(Sigma公司)，兔源性嘌呤2X3(P2X3)抗體(alomone公司)。3.主要儀器。無菌消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75％酒精，手術(shù)器械包：剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷等。4.大鼠行為學(xué)測定。分別于術(shù)前(標(biāo)記為0天)及術(shù)后第1，3，5，7，9，11，14天測量各組大鼠機(jī)械縮足反射閾值(MWT)和熱縮足反射潛伏期(TWL)，每次測量的時(shí)間及其他條件保持一致。(1)機(jī)械縮足反射閾值的檢測：采用的裝置為BME-404電子機(jī)械刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程科學(xué)研究所，中國，天津)，刺激細(xì)絲接觸面的直徑為0.6mm，測痛范圍為0～50g，分辨率為0.05g。將大鼠置于長寬高為20cm×10cm×30cm的透明有機(jī)玻璃盒中，并放在鐵絲網(wǎng)上，此裝置高于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，以便能夠清楚地觀察大鼠足底，適應(yīng)半個(gè)小時(shí)后進(jìn)行檢測。用細(xì)絲刺激大鼠左足底，每只大鼠每個(gè)力度試驗(yàn)10次，相鄰兩次測試的間隔時(shí)間至少為10秒，刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩腿等)完全消失后才可以進(jìn)行下次試驗(yàn)。測量時(shí)從小力度開始，直到某個(gè)力度刺激大鼠引起反應(yīng)，記下此力度，一共記錄5次，5次的平均值即為機(jī)械縮足反射閾值。(2)熱痛敏縮足反射閾值的檢測：本測試采用的儀器是BME-410C型全自動(dòng)熱痛刺激儀。將與上述相同的玻璃盒放在3mm厚的玻璃板上，大鼠置于玻璃盒中，待適應(yīng)30分鐘后進(jìn)行測試。采用熱輻射照射大鼠左足底，記錄從照射到出現(xiàn)抬腿的時(shí)間，即TWL，一共測量8次，取8次均值作為熱痛敏縮足反射閾值。為防止組織損傷，每次切斷時(shí)間為30s，且間隔3分鐘以上。7、逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)。(1)提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：所有器械均經(jīng)DEPC處理。在建模術(shù)后第14取材，分別取各組大鼠左側(cè)L4～L6背根神經(jīng)節(jié)，用DEPC處理并預(yù)冷過的PBS沖洗，置于RNAStore液中﹣20℃保存，提取RNA時(shí)將神經(jīng)節(jié)取出移至加有1mlTrizol勻漿器中，研磨后轉(zhuǎn)移到1.5ml的無核酶離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min，低溫離心12000g×15min，收集上層無色液相，加入與液相等體積的異丙醇，混勻，常溫靜置25min，沉淀RNA，之后4℃離心12000g×10min，棄上清，在管底可見少許白色沉淀為RNA，加入1ml無核酶水配置的75％乙醇，充分洗滌RNA。4℃離心5000g×3min后，吸棄上清液，倒置2分鐘，略干燥(切勿過分干燥，否則RNA不溶于水)，加20μl無RNase水溶解沉淀。采用50μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：無核酶水11.75μl，5×buffer10μl，dNTP3μl，OligDT2μl，MMLV2μl，Rnasin1.25μl，RNA樣本20μl，共50μl，離心，恒溫37℃水浴1小時(shí)。(2)設(shè)計(jì)引物：參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)P2X3受體引物序列。本發(fā)明選用β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，引物序列分別為：(3)采用ABI7500real-timePCRsystem進(jìn)行qPCR反應(yīng)，按照每個(gè)DNA模板每種引物種3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)Promage說明書配制qPCR反應(yīng)體系(每孔20μl)：(4)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件：通過ABI7500自帶軟件對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行處理分析。8、免疫組織化學(xué)方法。(1)提取組織：取各組大鼠左后肢L4～L6DRG，用預(yù)冷的PBS清洗，4％PFA固定48h后酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，其厚度為7μm，切片放37℃烘干箱烘干2小時(shí)后室溫保存。(2)免疫組化：用SP9001免疫組化試劑盒，根據(jù)說明書操作。1)切片取出放烤箱內(nèi)60℃烘烤30min脫蠟，0.01MPBS洗3次，每次5min；2)3％TritonX-100作用15min，PBS洗3次，每次5min；3)3％的H2O2作用5min；PBS洗3次，每次5min；4)5％山羊血清封閉液中37℃孵育1h；5)棄去封閉液，滴加稀釋好的一抗(P2X3抗體為兔來源，稀釋比例為1:200)里4℃過夜；6)次日，恢復(fù)室溫半小時(shí)后經(jīng)PBS常規(guī)沖洗后放入生物素標(biāo)記的二抗37℃水浴孵育45min；7)PBS沖洗后轉(zhuǎn)入C液(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)室溫孵育30min；8)PBS沖洗后顯微鏡下DAB顯色2min，放入PBS中以終止顯色反應(yīng)，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下拍照。(3)用Image圖像分析系統(tǒng)觀察分析反應(yīng)密度。比較各組免疫化學(xué)反應(yīng)結(jié)果。9、蛋白印跡。(1)蛋白提?。簩RG置于加有200μl組織裂解液(含PMSF)的1ml勻漿器中，于冰上研磨充分。反復(fù)裂解后，將勻漿樣品轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，4℃，12000g離心10min，取上清，按比例加入5×loadingbuffer和DTT，混勻后煮沸5min，使蛋白變性，-20℃保存，備用。(2)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳：制備SDS-PAGE凝膠，所用試劑如下表：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳構(gòu)成(ml)試劑分離膠(10％)積層膠(5％)ddH2O4.02.730％丙烯酰胺溶液3.30.671.5MTris-HC(pH8.8)2.5/1.0MTris-HC(pH6.8)/0.510％SDS0.10.04AP0.10.04TEMED0.0060.008總體積104(3)上樣及電泳：每孔上樣量為25μl(蛋白含量約為20μg)，樣本兩邊加2μl蛋白Marker。濃縮膠恒壓60V(約45min)，分離膠90V，待溴酚藍(lán)遷移至膠的下緣時(shí)(約150min)停止電泳。(4)轉(zhuǎn)膜：根據(jù)蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量準(zhǔn)備合適大小的PVDF膜和2張4層的濾紙，PVDF膜浸入甲醇作用5min后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中(濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中)浸泡以備用。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，300mA轉(zhuǎn)膜1個(gè)小時(shí)40分鐘。(5)免疫反應(yīng)：A)封閉：將膜置于含5％BSA的TBST封閉液中，水平搖床室溫作用2h。B)一抗結(jié)合：將膜放入用5％BSA配制的一抗(兔來源的P2X3稀釋比例1:400，小鼠抗β-actin單抗稀釋比例1:800)中，4℃過夜，或室溫平搖3h，TBST洗膜3次，每次10分鐘。C)二抗結(jié)合：將膜用IgG-HRP二抗反應(yīng)液(P2X3二抗為山羊抗兔，按1:2000溶于封閉液，β-actin為山羊抗小鼠，按1：5000溶于封閉液)孵育，室溫平搖1.0h后，TBST洗膜10min×3次。D)免疫復(fù)合物的檢測：膜加ECL發(fā)光劑(Thermofisher公司)于BioRad曝光機(jī)下曝光顯影。(7)半定量分析：曝光所得條帶圖形，通過Image圖像分析軟件分析目的條帶所在的光密度值，以各組β-actin條帶的光密度值標(biāo)化其相應(yīng)組P2X3的蛋白表達(dá)量。10、背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。(1)原代神經(jīng)元分離與培養(yǎng)與藥物處理。取新生2天之內(nèi)的SD乳鼠，無菌操作下斷頭，分離背根神經(jīng)節(jié)，在解剖顯微鏡下用精細(xì)角膜剪及游絲鑷剪除與神經(jīng)節(jié)相連的神經(jīng)纖維和周圍結(jié)締組織被摸，將剝除干凈的背根神經(jīng)節(jié)盡可能剪碎，然后用1mlD-Hanks液加10ulI型膠原酶消化5～10分鐘，棄去消化液，再加入1mlDMEM培養(yǎng)基配制的0.25％EDTA胰酶37℃消化15～20分鐘，然后加入2ml含10％FBS的DMEM終止消化。1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液，加入2ml的神經(jīng)元培養(yǎng)基Nuerobasal用吸管小心吹打、重懸，將其制成單細(xì)胞懸液，接種于用多聚氨酸包被處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿中于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為Neurobasal培養(yǎng)基、2％B27、50ng/ml神經(jīng)生長因子NGF、2mmol/LL-谷氨酰胺以及雙抗。待神經(jīng)元生長良好(約2～3天)，選取一孔神經(jīng)元，用gp120處理(終濃度為500pmol/L)24小時(shí)，另一孔作為對照組。(2)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元膜片鉗實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞電流。所用微電極用兩步拉制法制成，微電極充灌電極液后電阻在2-10MΩ之間。電流信號經(jīng)Axopatch200B膜片甜放大器、Digidata1440A及Clampex10.3采集和分析。調(diào)節(jié)微操縱器使微電極尖端接近細(xì)胞表面，并對微電極內(nèi)施加一負(fù)壓，形成高阻封接(1-10GΩ)，置鉗制電壓于-60mV，吸破細(xì)胞膜。移動(dòng)微操縱器上的加藥裝置排管，不同藥物的傳送依賴于重力流的作用，每管直徑(I.D)為0.2mm，管口距記錄細(xì)胞100μm左右，然后分別加入需要的藥物。電極內(nèi)液成分為(mM)：140KCl，2MgCl2，10HEPES，11EGTA，and5ATP。用KOH調(diào)節(jié)pH到7.2。細(xì)胞外液成分為(mM)：150NaCl，5KCl，2.5CaCl2，1MgCl2，10HEPES，10D-glucose。用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4。實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)與處理好的神經(jīng)元消化，低速離心，收集神經(jīng)元細(xì)胞，D-hanks液重懸，神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或橢圓形，選用輪廓和形態(tài)清晰的中小細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用P2X3受體特異性激動(dòng)劑α,β-meATP測試兩組神經(jīng)元細(xì)胞的激活電流值。11、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間差異性采用方差分析，組間比較采用LSD法，p<0.05表示有顯著性差異，p<0.01為極顯著差異。二、結(jié)果。(一)行為學(xué)結(jié)果。各組大鼠造模中均未見肢體運(yùn)動(dòng)障礙和自殘現(xiàn)象。造模前測定各組間機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射潛伏期的基礎(chǔ)值差異無顯著性(p>0.05)。1、機(jī)械痛敏(MWT)測定結(jié)果。建模術(shù)后第1天，gp120模型大鼠的機(jī)械縮足反射閾值開始降低，但與對照組相比其降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；術(shù)后3天開始，gp120模型大鼠的機(jī)械縮足反射閾值降低日趨明顯，與對照組相比具有顯著性差異(p<0.01，)；術(shù)后第7天，gp120模型大鼠給予A317491處理后，機(jī)械縮足反射閾值明顯增加，與對照相比其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，而與gp120模型組相比有顯著性差異(p<0.01，F(xiàn)1,14＝13.54)(見圖1)。2、熱痛敏(TWL)測定結(jié)果。建模術(shù)后第1天，gp120模型大鼠的熱縮足反射閾值開始降低，但與對照組相比其降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；術(shù)后3天開始，gp120模型大鼠組的熱縮足反射閾值明顯降低，與對照組相比具有顯著性差異(p<0.01)；gp120模型大鼠給予嘌呤2X3受體拮抗劑A317491處理后，熱縮足反射閾值明顯增加，與對照組相比其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，與gp120模型大鼠組相比有顯著性差異(p<0.01)(見圖2)。(二)逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測P2X3mRNA的表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果表明：gp120模型組背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3mRNA表達(dá)水平較對照組明顯增加(p<0.01)，gp120模型+A317491組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，而與gp120模型組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01，F(xiàn)1,18＝43.21)(見圖3)。(四)免疫組化檢測P2X3受體免疫反應(yīng)性。結(jié)果分析表明，P2X3受體的免疫反應(yīng)性表達(dá)在gp120模型組DRG中表達(dá)較對照組明顯增高(p<0.01)；糖尿病模型大鼠給予P2X3受體拮抗劑A317491處理后，P2X3受體的免疫反應(yīng)性表達(dá)較gp120模型組明顯降低(p<0.01)，而與對照組比無顯著差異(p>0.05)(見圖4)。(五)蛋白印跡。1、P2X3蛋白印跡結(jié)果。采用軟件分析P2X3蛋白印跡結(jié)果表明：gp120模型組DRG中P2X3受體表達(dá)水平較對照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型+A317491組與對照組P2X3受體表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，而與gp120模型組之間差異有顯著性意義(p<0.01)(見圖5)。2、(磷酸化)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶((p)ERK1/2)蛋白印跡結(jié)果。各組大鼠DRG中ERK1/2的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；pERK1/2的表達(dá)水平，gp120模型組較對照組明顯增加(p<0.01)，gp120模型+A317491處理組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與gp120模型組之間差異有顯著性意義(p<0.01)(見圖6)。(六)背根神經(jīng)節(jié)原代培養(yǎng)神經(jīng)元膜片鉗試驗(yàn)結(jié)果。膜片鉗試驗(yàn)結(jié)果顯示：gp120模型組原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的P2X3受體特異性激動(dòng)劑α,β-meATP的激動(dòng)電流，較對照組明顯增大(p<0.01)(見圖7)。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)嘌呤2X3(P2X3)受體拮抗劑A317491可降低背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X3受體的表達(dá)，抑制背根神經(jīng)節(jié)的傷害性信息傳遞，減輕神經(jīng)損傷的傷害剌激，減輕人類免疫缺陷病毒糖蛋白120神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為，可應(yīng)用于制備人類免疫缺陷病毒糖蛋白120并發(fā)神經(jīng)病理痛、并發(fā)神經(jīng)損傷相關(guān)疾病的藥物。當(dāng)前第1頁1 2 3