專利名稱：含四氫異喹啉化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及由下式1和2所示四氫異喹啉化合物的新藥用途。更具體地說，本發(fā)明的化合物可以用作用于治療心力衰竭、血栓形成、敗血病、播散性血管內(nèi)血凝固(以下稱作″DIC″)和/或因一氧化氮(NO)引起的組織損傷的藥物組合物中的療效性成分，其中所說的因一氧化氮引起的組織損傷明顯是由可誘導(dǎo)性NO合酶(以下稱作″iNOS″)的誘導(dǎo)增強(qiáng)所致化學(xué)式1 化學(xué)式2四氫異喹啉(以下稱作″THI″)化合物是閉環(huán)結(jié)構(gòu)的N-烷基苯基乙胺。具體地說，6，7-二羥基四氫異喹啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有共同的兒茶酚胺主鏈。也就是說，它們的結(jié)構(gòu)中含有3，4-二羥基苯基乙胺，其是兒茶酚胺的主鏈，兒茶酚胺的代表實(shí)例是腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺。因此，很多THI化合物顯出對(duì)腎上腺素能受體的親和性。此外，據(jù)報(bào)導(dǎo)根據(jù)取代基的類型及其結(jié)合位置，THI化合物對(duì)α-和/或β-受體產(chǎn)生作用，并且發(fā)揮主動(dòng)和/或?qū)剐Ч?。由此顯出各種藥理學(xué)活性。
具體地說，據(jù)報(bào)導(dǎo)，在1-位碳上具有羥基(OH-)、甲氧基(OCH3-)或鹵素取代的芐基的THI化合物具有潛在的活性，如支氣管擴(kuò)張、血小板凝結(jié)抑制活性、鈣通道阻塞作用等(King，V.F.等，J.Biol.Chem.，263，2238-2244，1988；Triggle，D.J.等，Med.Res.Rev.，9，123-180，1989；Lacorix，p.等，Eur.J.Pharmacol.，192，317-327，1991；Chang，K.C.等.，Life.Sci.，51，64-74，1992；Chang，K.C.等，Eur.J.Pharmacol.，238，51-60，1993)。
近來，諸如漢防己堿、異漢防己堿和軟骨箭毒素的二芐基四氫異喹啉化合物據(jù)發(fā)現(xiàn)具有潛在的抑制由內(nèi)毒素脂多糖(以下稱作″LPS″)誘導(dǎo)的NO大量生成的活性(Kondo，Y.等，Biochem.Pharmacol.，46，1861-1863，1993)。
去甲烏藥堿，在1-位上含有4-羥基芐基并且在6-位和7-位上分別含有羥基的THI化合物，其結(jié)構(gòu)非常類似于臨床上用作強(qiáng)心劑的多巴酚丁胺。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在使用離體心臟的體外實(shí)驗(yàn)中去甲烏藥堿可以增加心肌收縮力和心搏率并且可以抑制血小板凝固，并且在使用大鼠或兔子的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯出心輸出量、降壓作用和抗血小板凝固的增加。還據(jù)報(bào)導(dǎo)，在使用小鼠腹膜巨噬細(xì)胞和大鼠胸主動(dòng)脈制品的實(shí)驗(yàn)中，去甲烏藥堿可以抑制iNOS的表達(dá)和因LPS的NO產(chǎn)生，其解釋為扁平血管反應(yīng)性的恢復(fù)和因內(nèi)毒素所致的死亡率降低(Y.J.Kang等，J.Pharmacol.Exp.Ther.291，314-320，1999)。此外，在關(guān)節(jié)炎模型中，發(fā)現(xiàn)去甲烏藥堿有抗炎和止痛活性(Park，C.W.等，Arch.Int.Pharmacodyn，267，279-288，1984；Chang，K.C.等，Can.J.Physiol.Pharmacol.，72，327-334，1994；Yun-Choi，H.S.等，Yakhak Hoeiu，38，191-196，1994；Kang，Y.J.等，Kor.J.Physiol.Phamacol.，1，297-302，1997；Shin，K.H.等，天然產(chǎn)物科學(xué)，2，24-28，1996)。然而，去甲烏藥堿的缺陷在于它僅顯出短時(shí)間的藥性并且前述的藥理學(xué)作用不足。
開發(fā)具有優(yōu)越藥理學(xué)效果的去甲烏藥堿衍生物的研究結(jié)果，本發(fā)明者成功地合成了化學(xué)式1和2所示的新化合物，如韓國(guó)專利148,755公開的，其具有長(zhǎng)時(shí)間的藥物作用并且顯出強(qiáng)心和降壓作用。此外，如本發(fā)明者的報(bào)導(dǎo)(Lee，Y.S.等)，還發(fā)現(xiàn)這些新化合物在使用離體的大鼠心臟制品，用于擴(kuò)大被苯福林收縮的離體血管的體外實(shí)驗(yàn)中，具有增加心肌收縮力和心搏率的潛在作用，并且在使用兔子的實(shí)驗(yàn)中具有增加心搏率和降壓的潛在作用。
目前治療充血性心力衰竭使用的是洋地黃強(qiáng)心苷和多巴胺。洋地黃強(qiáng)心苷的優(yōu)點(diǎn)是適合口服施用，但缺點(diǎn)是它們的安全性極限較窄以致于它們使用起來危險(xiǎn)并引起心律不齊。諸如多巴胺和多巴酚丁胺的擬交感藥物是有效的充血性心力衰竭治療劑，但缺點(diǎn)是它們必須靜脈內(nèi)注射并且使用起來引起β-腎上腺受體的下降調(diào)節(jié)。
通過聯(lián)合施用能夠增加低心肌收縮力的強(qiáng)心藥以及可以通過血管舒張或通過預(yù)防血栓形成平穩(wěn)血液循環(huán)來減少心臟過載負(fù)擔(dān)的藥物，可以使患有心力衰竭的患者得到良好的治療效果。由于洋地黃強(qiáng)心苷和多巴胺僅具有強(qiáng)心活性，因此將它們與血管舒張藥(降壓藥)和血小板凝結(jié)抑制藥一起施用時(shí)可以顯出良好的治療效果。但是，這種各種藥物的聯(lián)合施用具有所用藥物之間相互作用影響各藥在體內(nèi)吸收和藥物代謝的問題，從而增加了副作用發(fā)生的頻率。
由各種跡象發(fā)現(xiàn)過量產(chǎn)生氧自由基，包括NO，是引發(fā)急性和慢性組織/器官損傷的主要原因之一。上述的組織/器官損傷的例子是，治療如關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞形成、大腦卒中的炎癥或局部缺血癥進(jìn)行再灌注時(shí)的組織損傷，或者由于細(xì)菌感染而來的內(nèi)毒素所引起的復(fù)雜器官損傷。因此，需要注重開發(fā)可以用于治療各種因大量NO所致疾病的物質(zhì)、抑制iNOS的表達(dá)或抑制NO的大量生成。還期望這些物質(zhì)保護(hù)由于例如急性心肌梗塞形成引起的心肌損傷或局部缺血心臟病，由此抑制心力衰竭的加重或者治愈之。
發(fā)明公開就上述關(guān)心的問題，本發(fā)明者經(jīng)過有效研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)式1和2的化合物憑借其結(jié)合心臟刺激作用、血管舒張(降壓作用)、防血小板凝結(jié)和iNOS抑制作用并且速效而成為心力衰竭的有效治療劑，以及憑借其抑制血小板凝結(jié)的活性成為血栓形成的有效治療劑和憑借其抑制iNOS表達(dá)和NO合成的活性成為NO所致組織損傷、敗血病和DIC的有效治療劑。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防和治療心力衰竭、血栓形成、iNOS誘發(fā)的組織損傷、敗血病和DIC的治療組合物。
根據(jù)本發(fā)明，上述目的可以通過提供含有1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分的藥物組合物來實(shí)現(xiàn)，其中分別由以下化學(xué)式1和2所示的1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉的每一種都顯出結(jié)合有心臟刺激作用、降壓活性、血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS表達(dá)抑制活性并且這些活性是速效的。
化學(xué)式1 化學(xué)式2
第1列對(duì)照第2列LPS(300ng/ml)第3列LPS(300ng/ml)＋化學(xué)式1的化合物(10μM)第4列LPS(300ng/ml)＋化學(xué)式1的化合物(30μM)第5列LPS(300ng/ml)＋化學(xué)式1的化合物(100μM)；圖2是RNA印跡的放射自顯影圖，其顯示了化學(xué)式2的化合物抑制由LPS和IFN-γ刺激之巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)中的iNOS mRNA表達(dá)，其中第1列對(duì)照第2列LPS(100ng/ml)＋I(xiàn)FN-γ(10U/ml)第3列LPS(100ng/ml)＋I(xiàn)FN-γ(10U/ml)＋化學(xué)式2的化合物(1μM)第4列LPS(100ng/ml)＋I(xiàn)FN-γ(10U/ml)＋化學(xué)式2的化合物(10μM)第5列LPS(100ng/ml)＋I(xiàn)FN-γ(10U/ml)＋化學(xué)式2的化合物(100μM)；圖3顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中血小板數(shù)量的變化；圖4顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)凝血酶原時(shí)間的變化；圖5顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)活化的部分凝血致活酶時(shí)間(aPTT)的變化；圖6顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中纖維蛋白原含量的變化；圖7顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中纖維蛋白/纖維蛋白原脫氫產(chǎn)物(FDP)含量的變化；圖8顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中S-GOT含量的變化；圖9顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中S-GPT含量的變化；

圖10顯示了當(dāng)給距最后口服施用去甲烏藥堿和化學(xué)式1和2化合物1小時(shí)后的大鼠靜脈內(nèi)注射LPS(20mg/kg)時(shí)3小時(shí)期間內(nèi)血液中BUN含量的變化；圖11a顯示了化學(xué)式1的化合物對(duì)小鼠中LPS誘發(fā)死亡的抑制效果，其中-○-LPS(20mg/kg)-△-LPS(20mg/kg)＋化學(xué)式1的化合物(10mg/kg)-□-LPS(20mg/kg)＋化學(xué)式1的化合物(20mg/kg)，并且圖11b顯示了化學(xué)式2的化合物對(duì)小鼠中LPS誘發(fā)死亡的抑制效果，其中-○-LPS(20mg/kg)-△-LPS(20mg/kg)＋化學(xué)式2的化合物(10mg/kg)-□-LPS(20mg/kg)＋化學(xué)式2的化合物(20mg/kg)發(fā)明詳述本發(fā)明提供THI化合物，由化學(xué)式1和2所示1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉，在治療和/或預(yù)防心力衰竭、血栓形成、iNOS誘發(fā)組織損傷、敗血病和DIC中的新用途。
化學(xué)式1和2的化合物可以具有很多異構(gòu)體。例如，正如從化學(xué)式1和2中看到的，可以存在互變異構(gòu)體。而且，由于化學(xué)式1和2的每個(gè)化合物含有至少一個(gè)不對(duì)稱碳原子，化合物可以是以旋光純(R)-或(S)-異構(gòu)體存在，或以不等比例的(R)-和(S)-異構(gòu)體的混合物存在，或以外消旋的形式存在。因此，應(yīng)當(dāng)說明化學(xué)式1和2化合物的所有異構(gòu)體均屬于本發(fā)明的范圍。而且，化學(xué)式1和2化合物的藥用鹽及其前體藥物也包括在本發(fā)明中。
可用于制備化學(xué)式1和2化合物藥用鹽的酸的具體實(shí)例包括鹽酸、溴酸、硫酸、甲磺酸、丙酸、琥珀酸、戊二酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、谷氨酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、抗壞血酸、碳酸、膦酸、硝酸、乙酸、L-天冬氨酸、乳酸、香草酸和氫碘酸。
如上所述，化學(xué)式1和2化合物的前體藥物也屬于本發(fā)明的范圍。由于在體內(nèi)能夠容易轉(zhuǎn)化成藥理學(xué)活性的形式，這些前體藥物是化學(xué)式1和2化合物的反應(yīng)性衍生物。關(guān)于適宜前體藥物的選擇和制備工藝可參見《前體藥物的設(shè)計(jì)》H.Bundgarrd編(1985)。
由化學(xué)式1所示的1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉或由化學(xué)式2所示的1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉，顯出結(jié)合有心臟刺激作用、降壓作用、防血小板凝結(jié)作用和iNOS抑制作用，并且這些作用是速效的，從而含有至少一種化合物作為有效組分的藥物組合物可以用作心力衰竭的預(yù)防或治愈劑。
目前，為治愈心力衰竭，臨床上單獨(dú)或聯(lián)合使用洋地黃、強(qiáng)心苷、血管舒張藥、鈣拮抗藥、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制藥，期望通過減少對(duì)心臟的預(yù)加荷載和后加荷載來改善血液動(dòng)力。就此方面來說，本發(fā)明的化學(xué)式1和2的化合物可以用作心臟病的有效治療劑，因?yàn)樗鼈兪峭瑫r(shí)具有心臟刺激作用和血管舒張作用的inodilator。
當(dāng)諸如動(dòng)脈硬化和高血壓的循環(huán)性疾病長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)從而給心臟帶來沉重負(fù)擔(dān)，或者當(dāng)發(fā)生由血栓引起的冠狀動(dòng)脈疾病或發(fā)生局部缺血疾病如心肌梗塞形成時(shí)，心力衰竭將會(huì)加重。具有心臟病高危指標(biāo)的患者被強(qiáng)烈建議連續(xù)服用血小板凝結(jié)抑制劑，目的是防止或預(yù)防各種心臟病或循環(huán)性疾病。因此，本發(fā)明的化學(xué)式1和2的化合物憑借其抑制血小板凝結(jié)的活性而具有抗血栓形成活性，滿足心力衰竭治愈的要求。患有慢性心力衰竭的患者處于提高免疫活性的狀態(tài)并且具有在腸和血管中活化的iNOS的表達(dá)。與此相關(guān)，因iNOS表達(dá)而合成大量的NO，其可以形成過氧化亞硝酸鹽，導(dǎo)致心肌收縮力下降和組織損傷?；瘜W(xué)式1和2的化合物可以抑制iNOS的表達(dá)，由此抑制了NO的合成和組織損傷。也就是說，除遏制NO的組織損傷外，本發(fā)明的化合物還可抑制氧自由基的產(chǎn)生，其是引起慢性心力衰竭患者心肌收縮力下降的原因之一。所以，化學(xué)式1和2的化合物可以表現(xiàn)出結(jié)合有上述各種活性并且速效，從而它們可以用作治療心力衰竭的特別改進(jìn)的治療劑。
這里，術(shù)語(yǔ)″心力衰竭治療劑″是指可以抑制因心肌收縮機(jī)能減退而引起的心力衰竭或充血性心力衰竭的加重或者可以治愈這種心力衰竭的藥物，其中所說的心肌收縮機(jī)能減退是由于急性心肌梗塞形成、按照例如慢性炎癥的免疫活性增加、局部缺血心臟病造成的；所說的充血性心力衰竭例如長(zhǎng)期高血壓、動(dòng)脈硬化或冠狀動(dòng)脈疾病。
就通過血小板凝結(jié)抑制的抗血栓形成活性和iNOS抑制活性而言，化學(xué)式1和2化合物中的一種可以作為有效成分包含在適用于抗血栓形成劑、組織損傷抑制劑、敗血病治愈劑和/或DIC治療劑的藥物組合物中。
抗血栓形成劑可以預(yù)防術(shù)后血栓形成、抑制血栓形成或血栓誘發(fā)疾病的加重如局部缺血腦血管事故、冠狀動(dòng)脈疾病、局部缺血心肌梗塞形成和慢性動(dòng)脈梗塞形成，或治愈這些疾病。
組織損傷抑制劑可以預(yù)防或治愈由NO引起的組織損傷以及由局部缺血疾病和由再灌注引起的組織損傷，或抑制這些組織損傷的加重，其中所說的NO明顯由iNOS合成所致，其可發(fā)展成例如炎癥如關(guān)節(jié)炎，所說的局部缺血疾病例如動(dòng)脈硬化、心肌梗塞形成和大腦卒中。
敗血病治愈劑用于治療DIC和由復(fù)雜組織損傷引起的敗血病。
DIC治療劑用于治療由血凝固激活引起的綜合癥，例如血小板數(shù)快速減少、出血、休克、血栓形成、血管梗塞形成。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過腸胃外、口服、靜脈內(nèi)或直腸途徑施用并且其劑量形式選自例如注射液、膠囊劑、丸劑、糖衣片劑、栓劑、溶液、懸浮液或乳液。
為制備藥物組合物，可以將本發(fā)明的化合物與藥用載體混合，例如有機(jī)或無機(jī)、固體、半固體或液體稀釋劑或賦形劑。如果需要，本發(fā)明的藥物組合物中可以含有輔劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、緩沖劑和/或其它常規(guī)添加劑。
實(shí)驗(yàn)顯示，即使當(dāng)口服施用時(shí)，本發(fā)明的化合物仍可明顯長(zhǎng)時(shí)間地在血液中保持高含量?；趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本發(fā)明化合物的施用劑量注射時(shí)為0.01-20mg/kg體重且口服施用時(shí)為2-200mg/kg體重。
在毒性實(shí)驗(yàn)中，據(jù)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物口服施用時(shí)的50％致死劑量(LD50)為至少1,000mg/kg。當(dāng)腹膜內(nèi)注射時(shí)，化學(xué)式1所示1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉的LD50為290.0mg/kg，95％置信界限為235.1-359.9mg/kg，而1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉的LD50為438.6mg/kg，95％置信界限為350.9-548.2mg/kg。
本發(fā)明分析了化學(xué)式1之1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和化學(xué)式2之1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉的上述藥理學(xué)效果并且評(píng)價(jià)顯示了這些各種組合的效果。而且，在各種實(shí)驗(yàn)中比較本發(fā)明的化合物與去甲烏藥堿，預(yù)計(jì)具有相似的作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推論出化學(xué)式1和2的化合物具有的潛在的血小板凝結(jié)抑制活性是因?yàn)槟I上腺素而不是二磷酸腺苷(以下稱作″ADP″)或膠原。此外，在對(duì)α-腎上腺素受體的拮抗作用方面，據(jù)信本發(fā)明的化合物還可以擴(kuò)大血管和抑制血小板凝結(jié)。
在抑制由內(nèi)毒素誘發(fā)的iNOS的表達(dá)和NO的合成中，化學(xué)式1和2的化合物顯出劑量依賴效果。通過抑制由于NO合成引起的組織損傷，本發(fā)明的化合物可以用作炎癥如關(guān)節(jié)炎、各種局部缺血疾病如大腦卒中和心肌梗塞形成以及再灌注時(shí)產(chǎn)生的組織損傷的預(yù)防劑、抑制劑或治愈劑。而且，本發(fā)明的化合物可以用于治療由快速?gòu)?fù)雜組織損傷引起的疾病，如敗血病和DIC。
在使用小鼠和大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，證明了化學(xué)式1和2的化合物在明顯降低因急性血栓形成而引起的死亡和抑制動(dòng)脈-靜脈分路(AVS)管中血栓形成方面具有杰出的抗血栓形成活性。
諸如LPS的內(nèi)毒素誘發(fā)各種DIC。DIC實(shí)例的指征包括血液中血小板數(shù)量減少、血液中纖維蛋白原含量減少且纖維蛋白/纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)含量增加以及凝血酶原時(shí)間(PT)和活化的部分凝血致活酶時(shí)間(aPTT)延長(zhǎng)。這些LPS-誘發(fā)DIC的指征可以通過本發(fā)明的化合物來改善。也就是說，當(dāng)施用時(shí)，本發(fā)明的化合物可以預(yù)防血液中血小板數(shù)量和纖維蛋白原濃度的減少、FDP含量的增加以及LPS誘發(fā)的PT和aPTT的延長(zhǎng)。同時(shí)，還已知內(nèi)毒素可以引起血清谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(S-GOT)、血清谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(S-GPT)和血液尿素氮(BUN)含量的增加。對(duì)此，本發(fā)明的化合物可以用于預(yù)防LPS引發(fā)S-GOT、S-GPT和BUN含量的增加。也就是說，本發(fā)明的化合物可以改善LPS-誘發(fā)多種器官衰竭(MOF)的指標(biāo)。此外，由于降低LPS-誘發(fā)死亡率的活性，本發(fā)明的化合物據(jù)認(rèn)識(shí)可以是內(nèi)毒素引起休克的保護(hù)劑。
根據(jù)以下的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是舉例說明性的，不被解釋為限制本發(fā)明。試驗(yàn)例1血小板凝結(jié)的抑制效果為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定購(gòu)自韓國(guó)漢城國(guó)立大學(xué)醫(yī)院血庫(kù)的血液血小板濃縮物，借助于血小板分析儀(PLT-4，Texas Instruments)測(cè)定血小板數(shù)量，并且用磷酸鹽緩沖的鹽水(以下稱作″PBS″)稀釋得到富含血小板的血漿(以下稱作″PRP″)，使其血小板的數(shù)量范圍為300×106-400×106/ml。在37℃下保溫3分鐘后，在PRP中添加ADP、膠原或腎上腺素引發(fā)血小板凝結(jié)。觀測(cè)PRP濁度的減少程度，并且使用諸如USAChrong-Log制造的血小板凝結(jié)計(jì)″Model 500VS″檢測(cè)凝結(jié)的程度。
根據(jù)以下等式計(jì)算％抑制率，來評(píng)價(jià)樣品化合物對(duì)血小板凝結(jié)的抑制活性％抑制率＝(A－B)/A×100其中A當(dāng)單獨(dú)添加血小板凝結(jié)引發(fā)物時(shí)所獲得的血小板凝結(jié)程度；B當(dāng)添加血小板凝結(jié)引發(fā)物和樣品的組合時(shí)所獲得的血小板凝結(jié)程度。
使用人的血小板獲得化學(xué)式1和2的化合物以及對(duì)照藥去甲烏藥堿對(duì)血小板凝結(jié)的抑制效果，見下表1。
表1化合物和去甲烏藥堿對(duì)血小板凝結(jié)的抑制效果

注ADP1×10-5M；膠原2-4×10-6g/ml；腎上腺素2×10-6M
正如從表1的數(shù)據(jù)中認(rèn)識(shí)的，去甲烏藥堿的差不多1×10-3M并沒有顯出對(duì)ADP-誘導(dǎo)血小板凝結(jié)的抑制活性，而化學(xué)式1和2的化合物也同樣地弱，它們的IC50分別為7.3×10-4M和8.6×10-4M。相比膠原的作用，化學(xué)式1的化合物經(jīng)測(cè)定其IC50為9.2×10-5M，其與去甲烏藥堿相類似。然而，化學(xué)式2化合物的抑制活性比化學(xué)式1化合物和去甲烏藥堿更有效約10倍。對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的血小板凝結(jié)來說，化學(xué)式1和2化合物的IC50分別為3.4×10-6和6.0×10-6，證實(shí)了所說的化合物的活性比去甲烏藥堿更有效，所說的去甲烏藥堿的IC50經(jīng)測(cè)定為1.9×10-5?？傊?，化學(xué)式1和2的化合物在抑制由ADP或腎上腺素誘導(dǎo)的血小板凝結(jié)活性方面比去甲烏藥堿更有效。在膠原誘導(dǎo)的血小板凝結(jié)抑制活性方面，化學(xué)式1和2的化合物與去甲烏藥堿類似或更有效。試驗(yàn)例2對(duì)α-腎上腺受體的結(jié)合親合性為研究本發(fā)明化合物是否競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合α-受體以表現(xiàn)上述血小板凝結(jié)抑制活性并顯出血管舒張作用，制備富含α-受體的大鼠大腦皮層膜。為此，將得自大鼠(Sprague-Dawley，250±20g；除非具體說明，以下實(shí)驗(yàn)均使用同樣的大鼠)的大腦皮質(zhì)與20x緩沖劑(50mM Tris，5mMMgSO4，1mM EDTA，1mM抗壞血酸，pH7.7)均勻混合，然后在35,000xg下離心15分鐘，離心三次并且將粒狀沉淀儲(chǔ)存于-70℃下。將5mg粒狀沉淀的1ml緩沖劑溶液連同[3H]哌唑嗪(200pM)和樣品一起在25下保溫30分鐘，接著加入10ml緩沖劑(50mM Tris，pH7.7)以便使結(jié)合反應(yīng)驟停。將所得的溶液經(jīng)Whatman GF/C玻璃纖維濾器過濾，然后搖動(dòng)2小時(shí)，同時(shí)完全浸沒在閃爍混合物中。使用閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman，LS6500)測(cè)定放射性。
表2大鼠大腦α-受體的離解常數(shù)值(Ki)和大鼠胸主動(dòng)脈中的IC50

由哌唑嗪與α-受體的結(jié)合，獲得Kd值為133.5±8.91pM和B最大值為15.15±0.64 fmol/mg。據(jù)發(fā)現(xiàn)，測(cè)定離解常數(shù)值(Ki)為0.15-1.25μM的樣品化合物對(duì)α-受體具有親合性。此外，這些測(cè)定的離解常數(shù)值之間的近似值以及在苯福林收縮的離體主動(dòng)脈中測(cè)定的IC50值(1.02-2.81μM)和腎上腺素誘導(dǎo)的血小板凝結(jié)抑制濃度值(IC503.4-10μM)也證明了本發(fā)明的化合物可以阻斷α-受體，以便擴(kuò)張血管和抑制血小板凝結(jié)。試驗(yàn)例3抑制大鼠離體主動(dòng)脈中的LPS-誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)用戊巴比妥鈉(50mg/kg)使大鼠麻醉，并且分離主動(dòng)脈，接著從主動(dòng)脈中去除內(nèi)皮。在37℃下于含有300ng/ml LPS的Krebs溶液中保溫8小時(shí)，之后借助trizol溶液(GibcoBRL)對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行總RNA提取。通過使用UV分光光度計(jì)(Shimadzu，UV-1201)定量分析后，將獲得的總RNA在甲酰胺-甲醛瓊脂糖凝膠上電泳并且轉(zhuǎn)移至尼龍膜。之后，用iNOS的cDNA探針雜交尼龍膜上的總RNA，以測(cè)定iNOS mRNA的表達(dá)程度，其中通過隨機(jī)引物法給iNOS的cDNA標(biāo)記32P-dCTP。為定量分析，將x-射線膜曝置在來自尼龍膜的放射性輻射中并且顯影，以比較所需目標(biāo)物與GAPDH(甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶)的點(diǎn)大小。
當(dāng)將主動(dòng)脈制品體外保溫，將血管在LPS的存在下體外培養(yǎng)時(shí)，iNOS mRNA會(huì)被大量轉(zhuǎn)錄。然而，培養(yǎng)基中還附加存在有化學(xué)式1的化合物時(shí)將不允許iNOS mRNA被表達(dá)。這些結(jié)果可參見圖1，其顯示了將主動(dòng)脈與LPS和/或化學(xué)式1化合物一起保溫后所獲得的關(guān)于iNOSmRNA的RNA印跡。在RNA印跡的放射自顯影圖中，第3、4和5列顯示了在化學(xué)式1化合物不同濃度(分別為10μM、30μM和100μM)影響下的iNOS mRNA表達(dá)，而第1和2列分別顯示了對(duì)照(單獨(dú)的主動(dòng)脈)和僅僅LPS(300ng/ml)的影響。正如圖1所示，在LPS處理組(第2列)中iNOSmRNA被強(qiáng)表達(dá)，但化學(xué)式1的化合物以濃度依賴方式抑制了LPS誘導(dǎo)性iNOS mRNA表達(dá)(第3、4和5列)。試驗(yàn)例4巨噬細(xì)胞中LPS-和IFN-γ-誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)的抑制效果在補(bǔ)充有經(jīng)熱處理的10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100mg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(RAW 264.7細(xì)胞)，使其在CO2培養(yǎng)箱中融合。轉(zhuǎn)移至不含血清的DMEM培養(yǎng)基中之后，將細(xì)胞培養(yǎng)另外24小時(shí)，然后在LPS(100ng/ml)和干擾素-γ(以下稱作″IFN-γ″；10U/ml)和/或化學(xué)式2的化合物(0、1、10和100μM)的存在下再培養(yǎng)18小時(shí)。使用trizol溶液，從經(jīng)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中提取總RNA。在分光光度計(jì)中定量分析后，將獲得的總RNA在甲酰胺-甲醛瓊脂糖凝膠上電泳并且轉(zhuǎn)移至尼龍膜。之后，用iNOS的cDNA探針雜交尼龍膜上的總RNA，以測(cè)定iNOS mRNA的表達(dá)程度，其中通過隨機(jī)引物法給iNOS的cDNA標(biāo)記32P-dCTP。為定量分析，將x-射線膜曝置在來自尼龍膜的放射性輻射中并且顯影，以比較所需目標(biāo)物與GAPDH的點(diǎn)大小。
結(jié)果見圖2，其顯示了將巨噬細(xì)胞與LPS和IFN-γ和/或化學(xué)式2化合物一起培養(yǎng)后所獲得的關(guān)于iNOS mRNA的RNA印跡。在RNA印跡的放射自顯影圖中，第3、4和5列顯示了在化學(xué)式2化合物不同濃度(分別為1μM、10μM和100μM)影響下的iNOS mRNA表達(dá)，而第1和2列分別顯示了對(duì)照(單獨(dú)的細(xì)胞)以及LPS(100ng/ml)和IFN-γ的影響。正如圖2所示，當(dāng)在LPS(100ng/ml)和IFN-γ(10U/ml)的存在下將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)18小時(shí)時(shí)，iNOS mRNA得到表達(dá)。另一方面，化學(xué)式2的化合物以濃度依賴方式抑制了LPS/IFN-γ-誘導(dǎo)的iNOS mRNA的表達(dá)(第3、4和5列)。試驗(yàn)例5巨噬細(xì)胞中LPS-和IFN-γ-誘導(dǎo)的NO合成的抑制效果在補(bǔ)充有經(jīng)熱處理的10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100mg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(RAW 264.7細(xì)胞)，使其在CO2培養(yǎng)箱中融合。轉(zhuǎn)移至不含血清的DMEM培養(yǎng)基中之后，將細(xì)胞培養(yǎng)另外24小時(shí)，然后在LPS(100ng/ml)和IFN-γ和化學(xué)式1和2化合物之一種(0、1、10和100μM)的存在下再培養(yǎng)18小時(shí)。通過NO的氧化產(chǎn)物亞硝酸鹽來間接地測(cè)定所合成的NO的量。為此，用格里斯試劑(0.1％萘基乙二胺二鹽酸鹽、1％磺胺、5％磷酸鹽溶液)與亞硝酸鹽進(jìn)行生色反應(yīng)，并且通過分光光度計(jì)測(cè)定其在550nm下的吸光度。使用NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定亞硝酸鹽的量，并且結(jié)果記載于下表3中。
表3對(duì)巨噬細(xì)胞中LPS-和IFN-γ-誘導(dǎo)的NO合成的抑制效果

正如表3的數(shù)據(jù)所示，當(dāng)在內(nèi)毒素的存在下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)，可以檢測(cè)到大量的亞硝酸鹽，說明了NO的大量合成。從沒有添加內(nèi)毒素和IFN-γ的對(duì)照中，檢測(cè)到8μM的亞硝酸鹽。另一方面，從添加有內(nèi)毒素和IFN-γ的培養(yǎng)物中測(cè)定到有57μM的亞硝酸鹽。在添加了LPS和IFN-γ以及添加了濃度1μM的化學(xué)式1和2化合物之一種的培養(yǎng)物中，合成的亞硝酸鹽的量經(jīng)測(cè)定為30μM或34μM，兩者都低于LPS和IFN-γ共存在時(shí)所測(cè)定的量。而且，當(dāng)使用較高濃度的化學(xué)式1和2化合物之一種時(shí)，亞硝酸鹽的量經(jīng)測(cè)定更小，說明化學(xué)式1和2的化合物可以濃度依賴方式有效抑制內(nèi)毒素引起的NO合成。試驗(yàn)例6小鼠中急性血栓形成引發(fā)性死亡的抑制效果將膠原(300μg/kg)和腎上腺素(30μg/kg)的混合物注射到小鼠(ICR；20±20g，以下實(shí)施例全部使用同樣的小鼠)尾部靜脈內(nèi)，以便誘發(fā)嚴(yán)重的急性肺動(dòng)脈血栓形成。由此制備急性血栓形成模型，其中經(jīng)注射后的小鼠在1-3分鐘內(nèi)癱瘓并且在15分鐘內(nèi)大部分死亡。為研究化學(xué)式1和2的化合物對(duì)急性血栓形成的效果，給小鼠口服施用其中之一種化合物1或3天。在最后一次口服施用之后靜脈內(nèi)注射膠原和腎上腺素的混合物。觀察檢測(cè)死亡率的變化和從癱瘓狀態(tài)中的恢復(fù)率，結(jié)果見下表4和5。
表4因血栓形成造成癱瘓的恢復(fù)率

*15分鐘內(nèi)從血栓形成性癱瘓中恢復(fù)的小鼠，各樣品口服施用一次。
表5因血栓形成造成癱瘓的恢復(fù)率

*15分鐘內(nèi)從血栓形成性癱瘓中恢復(fù)的小鼠。
各樣品口服施用每天一次，連續(xù)3天。
在注射后1分鐘內(nèi)大部分小鼠癱瘓，接著瞳孔放大、呼吸困難并且抽搐。大部分小鼠要么在5分鐘內(nèi)死亡要么癱瘓15分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。只有少數(shù)能夠從癱瘓中恢復(fù)。
如表4和5所示，施用了膠原和腎上腺素之混合物但沒有施用樣品化合物的對(duì)照組中只有17-20％的小鼠在15分鐘內(nèi)從癱瘓中恢復(fù)過來并且能夠自由活動(dòng)。阿斯匹林和去甲烏藥堿被用作陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)以50mg/kg的劑量口服施用一次時(shí)，它們顯出的恢復(fù)率分別為52％和37％。當(dāng)以100mg/kg的劑量施用去甲烏藥堿一次時(shí)，恢復(fù)率可增加至48％。對(duì)化學(xué)式1和2的化合物而言，當(dāng)以50mg/kg或100mg/kg的劑量施用一次時(shí)，顯示與阿斯匹林相似的恢復(fù)率。然而，當(dāng)以10mg/kg或50mg/kg的劑量每天施用一次連續(xù)施用三天時(shí)，化學(xué)式2的化合物的優(yōu)勢(shì)超過阿斯匹林，其恢復(fù)率上升至64-70％。試驗(yàn)例7動(dòng)靜脈分路管中血栓形成的抑制效果制備AVS管。為此，將頭皮靜脈切成18cm長(zhǎng)，并且將每端與18G注射器針頭相連接，同時(shí)用5cm長(zhǎng)的100％棉線固定管的中央。通過注射(肌肉內(nèi))用氯胺酮(250mg/kg)使大鼠麻醉并且進(jìn)行剖腹手術(shù)。將填充鹽水的AVS管安置在腹主動(dòng)脈和腎靜脈之間，安置的方式是其一個(gè)注射器針頭插入腹主動(dòng)脈中并且另一個(gè)注射器針頭插入腎靜脈中。讓血液流過AVS管，以便在棉線上形成血栓。血液經(jīng)AVS管循環(huán)15分鐘之后，從AVS管中取下棉線。稱重棉線測(cè)定棉線上形成的血栓的重量。觀測(cè)口服施用樣品化合物對(duì)大鼠中血栓形成的抑制效果，結(jié)果可見下表6和7。
表6一次口服各種藥物對(duì)插入大鼠中的AVS管中血栓形成的抑制效果

*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001
表7每天一次連續(xù)三天口服各種藥物對(duì)插入大鼠中的AVS管中血栓形成的抑制效果

*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001AVS管內(nèi)所形成的血栓的重量明顯受實(shí)驗(yàn)?zāi)翘斓臍夂驐l件(氣壓、濕度等)的影響。為得到有效分析，施用抗血栓形成劑阿斯匹林(50mg/kg)作為陽(yáng)性對(duì)照。在不施藥的陰性對(duì)照中，血栓的形成量為33-42mg。以50mg/kg的劑量施用一次阿斯匹林達(dá)到的血栓形成抑制效果為36-40％。當(dāng)以25mg/kg和50mg/kg的劑量施用一次去甲烏藥堿時(shí)，顯示抑制率為從25至31％。另一方面，當(dāng)以25mg/kg和50mg/kg的劑量施用一次化學(xué)式1和2的化合物時(shí)，可抑制24-39％的血栓形成。由此看出，本發(fā)明的化合物具有血栓形成抑制活性，其與去甲烏藥堿類似或更有效。
當(dāng)連續(xù)施用三天時(shí)，50mg/kg劑量的阿斯匹林可以使血栓形成降低12％。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)翘斓臍夂驐l件，對(duì)照的AVS管中形成了超過平均量的血栓，測(cè)試藥物對(duì)血栓形成的抑制效果相對(duì)較低。因此，對(duì)精確的分析來說，測(cè)試藥物和陽(yáng)性對(duì)照(阿斯匹林施用組)之間的比較是必需的。
當(dāng)以10mg和50mg的劑量每天一次連續(xù)三天施用時(shí)，去甲烏藥堿的％抑制率為13-18％，其與阿斯匹林類似?；瘜W(xué)式1和2的化合物，以10mg/kg和50mg/kg的劑量施用時(shí)，分別使血栓形成率降低了約24％和28％。這些數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的化合物在血栓形成抑制活性方面優(yōu)于阿斯匹林和去甲烏藥堿。試驗(yàn)例8大鼠中細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的DIC和MOF的指標(biāo)改進(jìn)效果通過注射(肌肉內(nèi))用氯胺酮(250mg/kg)將大鼠(Sprague-Dawley，250±50g)麻醉。30分鐘后，用3小時(shí)的時(shí)間將LPS(20mg/kg)注入大鼠尾部靜脈中。之后，從動(dòng)脈中取血，并且測(cè)定血小板數(shù)、PT、aPTT、纖維蛋白原含量、FDP含量以及S-GOT、S-GPT和BUN的含量。測(cè)試藥物口服施用每天一次共兩天。在最后一次施用所試化合物后1小時(shí)，將大鼠麻醉。
使用檸檬酸鈉作為抗凝劑。通過使用血小板計(jì)數(shù)器測(cè)定血液中的血小板數(shù)量。將抗凝劑處理過的血液在1,500xg下離心10分鐘并且獲得測(cè)試用的血漿。
為獲得凝血酶原時(shí)間(PT)，向100μl的血漿中添加50μl凝血致活酶試劑(Sigma，USA)并且使用纖維計(jì)(Becton Dickinson公司，加拿大)測(cè)定凝固時(shí)間?；旌锨?，將血漿與凝血致活酶試劑在37℃下分別預(yù)保溫3分鐘和5分鐘。
為測(cè)定aPTT，將100μl血漿在37℃下保溫3分鐘，并且加入100μl活化的部分凝血致活酶時(shí)間試劑(Sigma，USA)和100μ1 0.02M的CaCl2，并且使用纖維計(jì)測(cè)定凝固時(shí)間。添加之前，將試劑在37℃下預(yù)保溫1分鐘，同時(shí)將CaCl2在37℃下預(yù)加溫。
為測(cè)定纖維蛋白原含量，首先將20μl血漿與180μl緩沖劑混合并且在37℃下保溫2分鐘。向該溶液添加100μl凝血酶試劑(Sigma，USA)，接著測(cè)定凝固時(shí)間。然后，從根據(jù)纖維蛋白原參考獲得的校準(zhǔn)曲線中測(cè)定纖維蛋白原含量。
通過使用Thrombo-Wellcotest試劑盒(Murex Biotech Limit，英國(guó))測(cè)定FDP含量。為此，首先將各個(gè)血液樣品(不含檸檬酸鹽)與大豆胰蛋白酶抑制劑和大具竅蝮蛇毒液充分混合，并且在37℃下保溫30分鐘。經(jīng)過兩次在1,500xg下離心10分鐘之后，用甘氨酸鹽水緩沖液稀釋上清液的血清。將50μl稀釋后的血清與滴在測(cè)試載玻片上的一滴膠乳懸浮液充分混合，并且均勻涂開。將玻片放在搖動(dòng)器中2分鐘，并且觀察凝集。如下半定量地測(cè)定FDP濃度1∶0稀釋(-)0μg/ml，(+)1μg/ml，(++)2μg/ml；1∶1稀釋(+)3μg/ml，(++)4μg/ml；1∶2稀釋(+)5μg/ml，(++)6μg/ml等。
為分析S-GOT、S-GPT和BUN，使用診斷試劑盒(BoehringerMannheim；用于S-GOT的AST試劑盒、用于S-GPT的ALT試劑盒和用于BUN的尿試劑盒)，以及自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 747)，借韓國(guó)GreenCross Reference Lab的幫助。
當(dāng)在測(cè)試動(dòng)物中通過長(zhǎng)時(shí)間注射LPS來誘發(fā)膿毒性休克時(shí)，通過口服化學(xué)式1和2的化合物可以改善DIC和MOF的指標(biāo)。在僅施用LPS的對(duì)照中，血液中血小板數(shù)量和纖維蛋白原含量突然降低，且觀察到了PT和aPTT的延長(zhǎng)。而且，血液中FDP含量明顯增加。此外，檢測(cè)到高S-GOT、S-GPT和BUN值，說明肺或腎的功能下降。當(dāng)口服施用化學(xué)式1和2的化合物時(shí)，DIC和MOF綜合癥的指標(biāo)據(jù)觀察有所改善。
詳細(xì)地說，在口服施用去甲烏藥堿或化學(xué)式1和2的化合物之后，用3小時(shí)的時(shí)間給將LPS(20mg/kg)注射到大鼠中以引發(fā)DIC和MOF。為測(cè)定DIC和MOF指標(biāo)的改善，將這些測(cè)試動(dòng)物與僅供給LPS的對(duì)照進(jìn)行比較。
如圖3所示，作為對(duì)照，其每μl血液中血小板為296×103，低于正常血小板數(shù)量(747×103/μl)的一半。PT和aPTT經(jīng)測(cè)定分別為19和33秒，與正常值(14和20秒)相比延長(zhǎng)了50％(見圖4和5)。對(duì)照的纖維蛋白原濃度為104mg/ml并且FDP濃度為168μg/ml，而正常值保持纖維蛋白原含量為202mg/ml和FDP含量1μg/ml。與正常相比，對(duì)照的纖維蛋白原含量減少了一半并且FDP含量明顯增加，說明DIC嚴(yán)重惡化(參見圖6和7)。此外，S-GOT、S-GPT和BUN含量分別為231.0U/l、60.8U/l和25.6mg/dl，高于相應(yīng)的正常值(167U/l、49.3U/l和15.0mg/dl)。也就是說，MOF也嚴(yán)重惡化。
然而，以10mg/kg和50mg/kg的劑量口服施用去甲烏藥堿或化學(xué)式1和2的化合物與僅施用LPS的對(duì)照相比可以改善DIC和MOF的指標(biāo)。也就是說，如圖3-7所示血小板數(shù)量增加，PT和aPTT縮短，纖維蛋白原含量增加并且FDP含量降低。而且圖8-10所示帶來S-GOT、S-GPT和BUN含量降低。由這些結(jié)果可以看出，顯然本發(fā)明的化合物可以改進(jìn)LPS誘導(dǎo)的DICH和MOF。試驗(yàn)例9LPS引發(fā)的死亡的預(yù)防效果當(dāng)將大量的LPS注射入動(dòng)物中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生各種疾病如DIC，并且它們會(huì)在短時(shí)間內(nèi)因膿毒性休克而死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，將LPS(20mg/kg)腹膜內(nèi)注射入小鼠中并且計(jì)算注射后能夠存活48小時(shí)的小鼠數(shù)量。而且，檢測(cè)測(cè)試藥物對(duì)存活率的影響。
給小鼠注射(腹膜內(nèi))施用LPS(20mg/kg)，之后每6小鼠計(jì)算存活的小鼠的量，共計(jì)48小時(shí)。LPS注射前30分鐘，將測(cè)試藥物腹膜內(nèi)注射給小鼠，以檢測(cè)對(duì)LPS引發(fā)的死亡的預(yù)防效果。
當(dāng)僅注射LPS時(shí)，小鼠48小時(shí)后的存活率為約20％。然而，當(dāng)在注射LPS之前用20mg/kg劑量的化學(xué)式1的化合物(圖11a)和化學(xué)式2的化合物(圖11b)預(yù)處理時(shí)，LPS注射后直至30小時(shí)之前沒有大鼠死亡并且在48小時(shí)后仍有90％或更多的小鼠存活。當(dāng)以10mg/kg的劑量施用去甲烏藥堿或化學(xué)式2的化合物時(shí)，直至48小時(shí)之前小鼠存活80％。當(dāng)以10mg/kg的劑量注射化學(xué)式1的化合物時(shí)，直至48小時(shí)之前小鼠存活60％。因此，化學(xué)式1和2的化合物具有LPS-引發(fā)的休克的預(yù)防活性。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，化學(xué)式1和2的每種化合物結(jié)合具有抑制血小板凝結(jié)和iNOS表達(dá)的活性，以及心臟刺激活性和降低血壓的活性，并且這些活性是速效的。所以可以用作心力衰竭的治療劑。這些化合物還可以憑借其抑制血小板凝結(jié)的活性用作抗血栓形成劑和憑借其抑制iNOS表達(dá)和NO合成的活性用作組織損傷抑制劑、敗血病治愈劑或DIC治療劑。此外，含有本發(fā)明化合物的藥物組合物是廣泛安全的并且具有長(zhǎng)期藥物療效。
本發(fā)明以舉例描述的方式得到描述，并且應(yīng)當(dāng)說明這些術(shù)語(yǔ)是描述性的而不是限制性的。在上述教導(dǎo)的指引下可以作出本發(fā)明的很多改進(jìn)和變化。因此，可以說本發(fā)明的實(shí)踐是在本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，而不是根據(jù)具體的說明。
權(quán)利要求
1.用于治療心力衰竭的藥物組合物，含有分別由以下化學(xué)式1和2所示的1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分，其每一種都顯出心臟刺激活性、降壓活性、血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS表達(dá)抑制活性的組合活性并且這些活性是速效的化學(xué)式1 化學(xué)式2
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中治療心力衰竭是指抑制因心肌收縮機(jī)能減退而引起的心力衰竭加重或者可以治愈這些心臟病，其中所說的心肌收縮機(jī)能減退是由于急性心肌梗塞形成造成的心肌收縮機(jī)能減退；由于按照慢性炎癥的免疫活性增加造成的心肌收縮機(jī)能減退；由于局部缺血心臟病造成的心肌收縮機(jī)能減退；或由于充血性心力衰竭造成的心肌收縮機(jī)能減退，所說的充血性心力衰竭發(fā)展成長(zhǎng)期高血壓、動(dòng)脈硬化或冠狀動(dòng)脈疾病。
3.用于抗血栓形成劑的藥物組合物，含有1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分，其每一種都顯示有血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS合成抑制活性。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中抗血栓形成劑預(yù)防術(shù)后血栓形成、抑制血栓形成或血栓誘發(fā)疾病如局部缺血腦血管事故、冠狀動(dòng)脈疾病、局部缺血心肌梗塞形成和慢性動(dòng)脈梗塞形成的加重，或治愈這些疾病。
5.用于iNOS誘導(dǎo)的組織損傷抑制劑的藥物組合物，含有1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分，其每一種都顯示有血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS誘導(dǎo)抑制活性。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中組織損傷抑制劑預(yù)防由NO引起的組織損傷，其中增強(qiáng)iNOS表達(dá)在如關(guān)節(jié)炎的炎癥中相當(dāng)明顯；以及由局部缺血疾病引起的組織損傷，所說的局部缺血包括動(dòng)脈硬化、心肌梗塞形成和大腦卒中；和由再灌注引起的組織損傷，或抑制這些組織損傷的加重。
7.用于敗血病治愈劑的藥物組合物，含有1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分，其每一種都顯示有血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS合成抑制活性。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中敗血病治愈劑用于治療DIC和由復(fù)雜組織損傷引起的敗血病。
9.用于播散性血管內(nèi)凝結(jié)制療劑的藥物組合物，含有1-α-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉和/或1-β-萘基甲基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分，其每一種都顯示有血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS合成抑制活性。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中播散性血管內(nèi)凝結(jié)制療劑用于治療由血凝固激活引起的綜合癥，包括血小板數(shù)快速減少、出血、休克、血栓形成、血管梗塞形成。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療和預(yù)防心力衰竭、血栓形成、iNOS－誘導(dǎo)的組織損傷、敗血病和播散性血管內(nèi)血凝固的藥物組合物。該組合物含有分別由化學(xué)式1和2所示的1－α－萘基甲基－6,7－二羥基－1,2,3,4－四氫異喹啉和/或1－β－萘基甲基－6,7－二羥基－1,2,3,4－四氫異喹啉作為藥理學(xué)有效成分,其每一種都顯出心臟刺激活性、降壓活性、血小板凝結(jié)抑制活性和iNOS表達(dá)抑制活性的組合活性并且這些活性是速效的。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1331593SQ99812380
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期1999年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月21日
發(fā)明者尹-崔惠淑, 張基哲, 李德衡, 柳在泉 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院, 尹-崔惠淑, 張基哲, 李德衡