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      和16。人源化-去免疫輕鏈的其他非限制性實例包括,但不限于,SEQ ID N0:17、18、 19、20、21、22和23。所述序列下面提供于實施例17。
      [0158] 在另一個方面,本申請?zhí)峁┝艘环N抗體,其能夠在一定條件下與本文所述的抗-CD105抗體競爭,其中在ELISA試驗中,通過與這樣的抗體的競爭阻斷至少5%的具有所述抗 體的%和V并列的抗體與⑶105結(jié)合。
      [0159] 本文提供了中和抗體,其結(jié)合⑶105,并調(diào)節(jié)⑶105的活性。中和抗體可以例如通 過結(jié)合⑶105來抑制血管生成。
      [0160] 本文描述的抗體可用于在下面更詳細地描述的檢測或診斷用途。本文描述的抗體 可用于結(jié)合⑶105,這又可以抑制本文所述的血管生成。
      [0161] 本文所述的抗體可以另外包含用于治療應用的治療部分。
      [0162] 本文所述的抗體也可以用作免疫綴合物。如本文使用的,為了說明書和權(quán)利要求 書的目的,免疫綴合物指由根據(jù)本發(fā)明的抗-CD105抗體或其片段和至少一種治療標記構(gòu) 成的綴合物。治療標記包括抗腫瘤試劑和血管生成抑制劑。這樣的抗腫瘤試劑是本領(lǐng)域 已知的,包括但不限于:毒素、藥物、酶、細胞因子、放射性核素、光動力劑和血管生成抑制 劑。毒素包括、但不限于:蓖麻蛋白A鏈、突變型假單胞菌外毒素、白喉類毒素、鏈黑霉素、 博安霉素(boamycin)、阜草素、白樹毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。藥物包括柔紅霉素、甲氨 蝶呤和卡奇霉素。放射性核素包括放射性金屬。細胞因子包括、但不限于:轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)-P、白介素、干擾素和腫瘤壞死因子。光動力劑包括、但不限于:嚇啉類和它們的衍生 物。額外的治療標記是本領(lǐng)域已知的,且也在本文中考慮。用于使抗-CD105 mAb或其片段 與至少一種抗腫瘤劑復合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(即,Ghetie等人,1994, 63:209-34所綜述的抗體綴合物)。這樣的方法可以利用幾種可使用的 用于偶聯(lián)或連接分子的雜雙功能試劑之一。額外的放射性核素與額外的用于連接分子(諸 如治療和診斷標記)的方法一起在本文中進行進一步描述。
      [0163] 使用本領(lǐng)域已知的用于不同目的的技術(shù),諸如,例如,通過添加聚乙二醇(PEG),可 以修飾抗體。PEG修飾(聚乙二醇化)可以導致下述的一項或多項:改善的循環(huán)時間、改 善的溶解度、改善的對蛋白酶解的抗性、降低的抗原性和免疫原性、改善的生物利用度、降 低的毒性、改善的穩(wěn)定性和更容易配制(關(guān)于綜述,參見,F(xiàn)rancis等人,International Journal of Hematology 68:1-18, 1998)〇
      [0164] 可以修飾抗體的Fe部分,以增加當施用給患者時在血液中的循環(huán)半衰期。使用本 領(lǐng)域的常規(guī)方式,諸如,例如,在美國專利號7, 217, 798(它以其整體通過引用并入本文)中 所述的方式,可以測定修飾。
      [0165] 改善基于抗體的融合蛋白在循環(huán)中的半衰期的其他方法也是已知的,諸如,例如, 在美國專利號7, 091,321和6, 737, 056 (它們各自通過引用并入本文)中所述的方法。另 外,可以生產(chǎn)或表達抗體,使得它們不含有在它們的復雜的N-糖苷-連接的糖鏈上的巖藻 糖。已知從復雜的N-糖苷-連接的糖鏈去除巖藻糖增加抗體和抗原結(jié)合片段的效應物功 能,包括但不限于:抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性的細胞毒性 (CDC)。類似地,可以將結(jié)合CD105的抗體在它們的C-端末端連接在源自任何抗體同種型 (例如,IgG、IgA、IgE、IgD和IgM)和任何同種型亞類(尤其是IgGl、IgG2b、IgG2a、IgG3和 IgG4)的所有或部分免疫球蛋白重鏈上。
      [0166] 另外,還可以修飾本文所述的抗體,使得它們能夠穿過血腦屏障。本文所述的 抗體的這種修飾允許治療腦疾病,諸如多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)。在美國專利公開 20070082380(它以其整體通過引用并入本文)中描述了允許蛋白(諸如抗體)穿過血腦屏 障的示例性的修飾。
      [0167] 已經(jīng)顯示,免疫球蛋白的糖基化對它們的效應物功能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和從抗體生產(chǎn) 細胞分泌的速率具有顯著影響(Leatherbarrow等人,#〇7. Immunol. 22:407 (1985))。 負責這些性質(zhì)的碳水化合物基團通常連接在抗體的恒定(C)區(qū)上。例如,IgG的活化補體依 賴性的細胞溶解的經(jīng)典途徑的完全能力,需要IgG在C h 2結(jié)構(gòu)域中的天冬酰胺297處的糖 基化(Tao 和 Morrison, J Immunol. 143:2595 (1989))。IgM 在 Ch 3 結(jié)構(gòu)域中的天冬醜 胺402處的糖基化,是抗體的適當裝配和細胞溶解活性所必需的(Muraoka和Shulman, 7; 乂 142:695 (1989))。在IgA抗體的Ch 1和CH3結(jié)構(gòu)域中的位置162和419處的 糖基化位點的去除,導致細胞內(nèi)降解和至少90%的分泌抑制(Taylor和Wall,#〇乂 沒io人8:4197 (1988))。另外,可以生產(chǎn)或表達抗體,使得它們不含有在它們的復雜的N-糖 苷-連接的糖鏈上的巖藻糖。已知從復雜的N-糖苷-連接的糖鏈去除巖藻糖增加抗體和 抗原結(jié)合片段的效應物功能,包括但不限于:抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)和 補體依賴性的細胞毒性(CDC)。利用本領(lǐng)域已知的分子克隆技術(shù),通過多種系統(tǒng),可以生產(chǎn) 這些"去巖藻糖基化的"抗體,所述技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物或細胞系,它 們已經(jīng)遺傳地工程化,使得它們不再含有對于在復雜的N-糖苷-連接的糖鏈中包含巖藻糖 所必須的酶和生化途徑(也稱作巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶敲除的動物、植物或細胞)??梢怨こ袒?巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶敲除的細胞的細胞的非限制性實施例包括:CHO細胞、SP2/0細胞、NSO細胞 和YB2/0細胞。
      [0168] 還已經(jīng)觀察到免疫球蛋白在可變(V)區(qū)中的糖基化。Sox和Hood報道,約20%的 人抗體在V區(qū)中被糖基化G dTOC.他以.JcaiZ 5bi."說66:975 (1970))。認為V結(jié)構(gòu)域 的糖基化源自N-連接的糖基化信號Asn-Xaa-Ser/Thr在V區(qū)序列中的偶然出現(xiàn),且本領(lǐng)域 尚未認為在免疫球蛋白功能中起作用。
      [0169] 在可變結(jié)構(gòu)域框架殘基處的糖基化可以改變抗體與抗原的結(jié)合相互作用。本發(fā)明 包括這樣的標準:通過所述標準,選擇免疫球蛋白鏈的框架或CDR中的有限數(shù)目的氨基酸 進行突變(例如,通過殘基的置換、刪除或添加),以便增加抗體的親和力。
      [0170] 通常,通過將一個或多個突變導入V區(qū)框架中,通常在鄰近一個或多個⑶R的區(qū) 域中和/或在一個或多個框架區(qū)中,可以調(diào)節(jié)結(jié)合抗原的親和力。通常,這樣的突變涉及 保守氨基酸置換的導入,所述置換破壞或建立糖基化位點序列,但是基本上不會影響多肽 的親疏水(hydropathic)結(jié)構(gòu)性質(zhì)。通常,避免導入脯氨酸殘基的突變。在美國專利號 6, 350, 861 (它關(guān)于糖基化通過引用并入本文)中進一步描述了抗體的糖基化。
      [0171] 可以配制用于短期遞送或延長的(長期)遞送的抗體。
      [0172] 結(jié)合⑶105的抗體也可以用于純化⑶105和/或檢測樣品或患者中的⑶105水平, 以檢測或診斷在下面更詳細地描述的與CD105有關(guān)的疾病或病癥。
      [0173] 可以測試使用這樣的方法產(chǎn)生的結(jié)合CD105的抗體的結(jié)合親和力、親合力和中和 能力中的一項或多項。有用的抗體可以用于施用給患者,以預防、抑制、控制或治療與血管 生成有關(guān)的狀況、疾病或病癥。
      [0174] 可以評價抗體的結(jié)合親和力、結(jié)合速率、解離速率和親合力中的一項或多項。在一 個方面,可以評價抗體的中和CD105或VEGF的活性的能力。使用本領(lǐng)域公認的試驗,包括但 不限于:酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、S Catchard分析、BIAC0RE分析(表面等離子體共振) 等以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常使用的和已知的其他試驗,可以測量結(jié)合親和力、結(jié)合速 率、解離速率和親合力。
      [0175] 使用例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、競爭性結(jié)合試驗、ELISP0T試驗或本領(lǐng)域已 知的任何其他有用的試驗,可以測量抗體與CD105的結(jié)合和/或測量例如抗體的抑制血管 生成的能力。這些試驗是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常使用的和眾所周知的。
      [0176] 在一個非限制性實施方案中,ELISA試驗可以用于測量結(jié)合⑶105的特定抗體的 結(jié)合能力。
      [0177] 諸如ELISA等試驗也可以用于鑒定與其其他抗體相比表現(xiàn)出增加的對⑶105的特 異性的抗體。諸如ELISA等試驗也可以用于鑒定其這樣的抗體:所述抗體結(jié)合跨一種或多 種多肽的表位和跨一種或多種⑶105或VEGF的表位。通過運行平行的ELISA,可以進行特 異性試驗,在所述ELISA中,在分開的試驗腔室中同時地篩選實驗抗體的結(jié)合一種或多種 表位(在含有CD105表位的不同物種多肽上)的能力,以鑒定其結(jié)合CD105的抗體。本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟悉的另一種測量表觀結(jié)合親和力的技術(shù)是表面等離子體共振技術(shù)(在BIAC0RE 2000 系統(tǒng)上分析)(Liljeblad,等人,J 2000,17:323-329)。Heeley, R. P·, 你 ?/ocr. Tfes. 2002,28:217-229描述了標準測量和傳統(tǒng)的結(jié)合試驗。
      [0178] 也可以測定特異性結(jié)合CD105的抗體的治療與血管生成有關(guān)的不同疾病和狀況 以及各種形式的癌癥(例如,原發(fā)性腫瘤、復發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移)的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的任何合適的試驗可以用于監(jiān)測這種效應。本文描述了幾種這樣的技術(shù)。在一個實 例中,測試本文描述的抗體的結(jié)合CD105的能力。在另一個實例中,通過表面等離子體共振 (SPR),測定本文描述的抗體的親和常數(shù)。在另一個實例中,測定本文描述的抗體對血管生 成抑制的作用。
      [0179] 制劑 除了活性成分(抗-CD105抗體或其抗體片段)以外,本文提供的制劑可以包括:藥學 上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他 材料。這樣的材料應當是無毒的,且不會干擾活性成分的功效。載體或其他材料的確切性 質(zhì)將取決于施用途徑。
      [0180] 本文提供了抗CD105抗體的新制劑、含有所述制劑的預充式注射器,和這樣的制 劑可用于治療血管生成相關(guān)病癥的用途。本申請?zhí)峁┝丝捎糜陟o脈內(nèi)或眼內(nèi)施用,例如,治 療與CD105相關(guān)的癌癥和眼科狀況的制劑??贵w或其抗原結(jié)合片段與本文所述的CD105的 結(jié)合、親和力、親合力和活性可以使用本領(lǐng)域公認的方法(包括,但不限于,上文和下文實 施例中描述的測定法)進行評價。
      [0181] 在一個方面,本文提供了包含約I mg/ml至約150 mg/ml抗⑶105抗體、或其抗原 結(jié)合片段,至多約100 mM緩沖劑、至多約I M多元醇和約4. 0至約7. 5的pH的制劑。
      [0182] 在一個方面,所述制劑在制備后是穩(wěn)定的,其可根據(jù)常規(guī)方法進行測試。包含蛋白 的制劑的安全處理和施用代表了對藥物配制人員的顯著挑戰(zhàn)。蛋白具有呈現(xiàn)穩(wěn)定性問題的 獨特的化學和物理特性:對于蛋白存在各種降解途徑,暗示化學和物理不穩(wěn)定性?;瘜W不 穩(wěn)定性包括脫氨基、聚集、肽骨架的削剪和甲硫氨酸殘基的氧化。物理不穩(wěn)定性包括許多現(xiàn) 象,包括,例如,聚合。
      [0183] "穩(wěn)定的"制劑是其中的蛋白在儲存后基本上保留其物理穩(wěn)定性和/或化學穩(wěn)定 性和/或生物活性的制劑。用于測量蛋白穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在本領(lǐng)域中可用且綜述 于,例如,Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York, N.Y·,Pubs. (1991)和 Jones, A. JoV.FezyTfeK 10: 29-90 (1993)。穩(wěn)定性可在所選溫度持續(xù)所選時間段進行測量。優(yōu)選地,所述制劑在 室溫(約30°C )或在40°C持續(xù)至少1個月是穩(wěn)定的,和/或在約2-8°C持續(xù)至少1年或至 少2年是穩(wěn)定的。此外,所述制劑在制劑的冷凍(至,例如,-80°C)和融化之后可以是穩(wěn)定 的。
      [0184] 如果蛋白在顏色和/或澄清度的目視檢查之后或如通過UV光散射或通過大小排 阻色譜法(SEC)測量顯示無聚集、沉淀和/或變性的跡象,則蛋白在藥物制劑中"保留其物 理穩(wěn)定性"。用于測定這樣的測量值的方法是本領(lǐng)域已知的,且在下面更詳細地描述。
      [0185] 如果在給定時間的化學穩(wěn)定性使得所述蛋白被認為仍保留如下所定義的其生物 活性,則蛋白在制劑中"保留其化學穩(wěn)定性"?;瘜W穩(wěn)定性可通過檢測和定量蛋白的化學改 變的形式進行評價?;瘜W變化可涉及大小修飾(例如,削剪),其可以使用例如大小排阻色 譜、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜(MALDI/TOF MS)來評價。其 他類型的化學改變包括電荷改變(例如,作為脫酰胺的結(jié)果而發(fā)生),其可通過例如離子交 換色譜或毛細管電泳等電聚焦(cIEF)來評估。
      [0186] 如果如例如抗原結(jié)合測定法所測定,抗體在給定時間的生物活性是,例如,在制備 制劑時表現(xiàn)出的生物學活性的約50至150%內(nèi)(在測定誤差內(nèi)),則抗體在制劑中"保留其 生物學活性"。用于抗體的其他"生物活性"測定法詳述如下。
      [0187] 就所述制劑隨著時間的穩(wěn)定性而言,如通過大小排阻色譜法(SEC)所測量,至少 95%的抗⑶105抗體或其抗原結(jié)合片段在約2至8°C儲存至少約12個月之后可以作為單體 存在。此外,本文中還考慮本領(lǐng)域公認用于評價穩(wěn)定性的方法,包括但不限于實施例中描述 的那些。
      [0188] 此外,所述抗⑶105抗體或其抗原結(jié)合片段在約2_8°C儲存至少約12個月之后可 以顯示約50至150%結(jié)合(通過⑶105 ELISA結(jié)合測定法)。
      [0189] 在2至8°C儲存至少約12個月之后,抗⑶105抗體的平均等電點(pi)可為約8. 8 至約9. 2,如通過,例如,毛細管電泳等電對焦所測量。
      [0190] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解,抗CD105抗體或其抗原結(jié)合片段可以穩(wěn)定至少約12個 月、至少約18個月、至少約24個月、至少約30個月、至少約36個月或更長時間。
      [0191] 在所述制劑的冷凍和融化循環(huán)之后,如通過SEC所測量,所述制劑可以含有作為 單體存在的至少95%的抗⑶105抗體??商娲兀蛄硗獾?,當經(jīng)受攪動應力時,制劑可以 含有作為單體存在的至少95%的抗⑶105抗體。
      [0192] 抗⑶105抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含其⑶R能夠結(jié)合⑶105的任何序列。在 一個非限制性實施方案中,所述抗⑶105抗體是TRC105,其包含具有如SEQ ID N0:1所示氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)(');具有如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)(CJ ;具 有如SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh);和具有如SEQ ID N0:4所示氨基酸 序列的恒定區(qū)(Fe)。
      [0193] 在另一個非限制性實施方案中,所述抗⑶105抗體包含具有如SEQ ID NO:5所示 氨基酸序列的' CDRl;具有如SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的八CDR2;具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的\ CDR3;具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Vh CDRl;具有 如SEQ ID NO :9所示氨基酸序列的Vh CDR2;和具有如SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的Vh CDR3。
      [0194] 所述制劑可含有約I mg/ml至約150 mg/ml的抗⑶105抗體或其抗原結(jié)合片段, 或其中任何值,包括但不限于,約2 mg/ml、約5 mg/ml、約7.5 mg/ml、約10 mg/ml, 20 mg/ ml、約 25 mg/ml、約 30 mg/ml、約 35 mg/ml、約 40 mg/ml、約 45 mg/ml、約 50 mg/ml、約 55 mg/ml、約 60 mg/ml、約 65 mg/ml、約 70 mg/ml、約 75 mg/ml、約 80 mg/ml、約 85 mg/ml、約 90 mg/ml、約 95 mg/ml、約 100 mg/ml、約 105 mg/ml、約 110 mg/ml、約 115 mg/ml、約 120 mg/ml、約 125 mg/ml、約 130 mg/ml、約 135 mg/ml、約 140 mg/ml、約 145 mg/ml、約 150 mg/ ml或更多、或其之間的任何整數(shù)。當涉及抗體濃度時,本文使用的術(shù)語"約"表示所示值的 ±2%。
      [0195] 在一個實施方案中,所述制劑包含約25 mg/ml的抗⑶105抗體或抗原結(jié)合片段。 在另一個實施方案中,所述制劑包含約50 mg/ml的抗CD105抗體或抗原結(jié)合片段。在又另 一個實施方案中,所述制劑包含約100 mg/ml的抗CD105抗體或抗原結(jié)合片段。
      [0196] 如本文所述的制劑可以含有緩沖劑,諸如,例如,組氨酸、乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸 鹽??梢园s5 mM至約100 mM的量的緩沖劑。在一個實施方案中,所述制劑包含約5 mM、約 L 5 mM、約 10 mM、約 12. 5 mM、約 15 mM、約 17. 5 mM, 20 mM、約 22. 5 mM、約 25 mM、約 30 mM、約 35 mM、約 40 mM、約 45 mM、約 50 mM、約 55 mM、約 60 mM、約 65 mM、約 70 mM、約 75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM、約100 mM或其中任何整數(shù)的組氨酸、乙酸鹽、檸 檬酸鹽或磷酸鹽。當涉及緩沖劑濃度時,本文使用的術(shù)語"約"表示所示值的±2%。
      [0197] 制劑可以用于已知用于抗體的任何類型的施用,包括,但不限于,玻璃體內(nèi)和靜脈 內(nèi)施用。
      [0198] 本文提供的制劑可以進一步包括可接受的載體或賦形劑,包括作為藥學上可接受 的載體或賦形劑且對于施用于患者可接受的任何載體或賦形劑。
      [0199] 在一個實施方案中,本文提供的制劑是等滲的。代表性等滲制劑包括,但不限于, 為約250至約350毫滲量的那些。在另一個實施方案中,本文提供的制劑是高滲的。代表 性高滲制劑包括,但不限于,為約351至約1000毫滲量的那些。
      [0200] 可以將多元醇以至多約I M的量添加至本文所述的制劑。例如,多元醇可以包含約 50 mM、約 75 mM、約 100 mM、約 150 mM、約 200 mM、約 225 mM、約 240 mM、約 250 mM、約 300 mM、約 350 mM、約 400 mM、約 450 mM、約 500 mM、約 550 mM、約 600 mM、約 650 mM、約 700 mM、 約750 mM、約800 mM、約850 mM、約900 mM、約950 mM、約I M或其中任何整數(shù)的量的多元 醇。在一個實施方案中,本文提
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