融化，1000 rpm離心5 分鐘，棄上清液，加入懸浮專用培養(yǎng)基（配制：BBSM培養(yǎng)基中按I. 15g/L加入碳酸氫鈉，再 添加3%-5% (體積百分比）新生牛血清，調(diào)節(jié)pH值至7. 2±0. 5。BBSM培養(yǎng)基購自北京 清大天一科技有限公司，產(chǎn)品代碼：MD910)，重懸，調(diào)節(jié)接種密度為0. 2-0. 5XIO6細胞/mL， 轉(zhuǎn)至125mL細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)體積：30-50mL，37°C、100rpm培養(yǎng)。
[0030] 2、細胞傳代
[0031] 細胞培養(yǎng)48h后取樣計數(shù)，若細胞密度多2.OXIO6細胞/mL時進行細胞傳代， 否則繼續(xù)培養(yǎng)，取需要傳代的細胞，加入懸浮專用培養(yǎng)基（配制同上），將細胞液稀釋至 0. 2-0. 5XIO6細胞/mL，將稀釋好的細胞液分裝培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)1-3代，擴增至反應(yīng)器所 需體積和密度（細胞密度彡2.OXIO6細胞/mL)。
[0032] 二、反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21-C13細胞
[0033] 1、BHK21-C13細胞5L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0034] 將步驟一培養(yǎng)得到的符合要求的懸浮細胞（細胞密度多2. OX IO6細胞/mL，存活 率大于90%)250-1000mL混合在專用接種瓶內(nèi)。將接種瓶內(nèi)的細胞轉(zhuǎn)移至5L反應(yīng)器中，補 加懸浮專用培養(yǎng)基（配制同上）至5000mL，細胞密度稀釋至0.2-0. 5 X IO6細胞/mL，設(shè)定 細胞培養(yǎng)溫度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60%(飽和度百分比），轉(zhuǎn)速 隨著細胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在60-1 lOrpm。細胞培養(yǎng)48h后取樣 計數(shù)，當(dāng)細胞密度多2. OX IO6細胞/mL時將細胞液轉(zhuǎn)至50L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，或作為培養(yǎng)病 毒使用（可用于偽狂犬生產(chǎn)用懸浮種毒培養(yǎng)，根據(jù)生產(chǎn)毒需求量不同，從而使用不同規(guī)格 的反應(yīng)器培養(yǎng)），否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細胞密度。經(jīng)測，細胞密度達2-4 X IO6細胞/mL。
[0035] 2、BHK21-C13細胞50L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0036] 取步驟1培養(yǎng)的符合要求（細胞密度彡2.OXIO6細胞/mL)的懸浮細胞，加入50L 反應(yīng)器中，補加懸浮專用培養(yǎng)基（組成同上）至50L，使細胞密度稀釋至0.2-0.5X106細胞 /mL，設(shè)定細胞培養(yǎng)溫度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60% (飽和度百分 比），轉(zhuǎn)速隨著細胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在60-llOrpm。細胞培養(yǎng) 48h后取樣計數(shù)，當(dāng)細胞密度彡2.OXIO6細胞/mL時，可將細胞轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培 養(yǎng)或培養(yǎng)病毒使用，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細胞密度。
[0037] 3、BHK21-C13細胞500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0038] 取步驟2培養(yǎng)的符合要求（細胞密度彡2. 0XIO6細胞/mL)的懸浮細胞，加入500L 反應(yīng)器中，補加懸浮專用培養(yǎng)基（組成同上）至500L，使細胞密度稀釋至0. 2-0. 5XIO6細 胞/mL，設(shè)定細胞培養(yǎng)溫度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60% (飽和度百 分比），轉(zhuǎn)速隨著細胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般在60-llOrpm。細胞培 養(yǎng)48h后取樣計數(shù)，當(dāng)細胞密度多2.OXIO6細胞/mL時，可將細胞轉(zhuǎn)至5000L反應(yīng)器繼續(xù) 培養(yǎng)或病毒培養(yǎng)使用，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細胞密度（細胞密度達到2-4XIO6細胞/mL)。
[0039] 4、BHK21-C13細胞5000L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0040] 取步驟3培養(yǎng)的符合要求（細胞密度彡2.0X106細胞/mL)的懸浮細胞，加 入5000L反應(yīng)器中，補加懸浮專用培養(yǎng)基（組成同上）約4500L，使細胞密度稀釋至 0. 2-0. 5XIO6細胞 /mL，設(shè)定細胞培養(yǎng)溫度：36. 5±0. 5 °C，pH值：7. 20±0. 1，DO值： 20% -60% (飽和度百分比），轉(zhuǎn)速隨著細胞密度、培養(yǎng)體積、攪拌方式的不同而不同，一般 在60-1lOrpm。細胞培養(yǎng)48h后取樣計數(shù)，當(dāng)細胞密度多2.OXIO6細胞/mL時用于病毒培 養(yǎng)，否則繼續(xù)培養(yǎng)至所需細胞密度（細胞密度達2-4XIO6細胞/mL)。
[0041] 三、偽狂犬懸浮種毒培養(yǎng)
[0042] 1、偽狂犬基礎(chǔ)種毒培養(yǎng)
[0043] 貼壁培養(yǎng)：從液氮中取出一支凍存的BHK21貼壁細胞株，37°C快速融化，1000 rpm 離心5分鐘，棄上清液，加入少量MEM營養(yǎng)液（MEM培養(yǎng)基，用7. 5% (質(zhì)量體積百分比W/V) 碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. 2 ±0. 5,添加8 % -10% (體積百分比）的新生牛血清；MEM培 養(yǎng)基購自宜興市賽爾生物科技有限公司，產(chǎn)品代碼：1605-030)重懸后加入75cm2細胞培養(yǎng) 瓶中，補加MEM營養(yǎng)液至30mL，至37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，待細胞長滿單層后取用或繼續(xù)傳 代。
[0044] 細胞傳代：取長滿單層的貼壁細胞，棄去原培養(yǎng)液，加入消化液（0. 25%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA) 5-10ml，細胞消化分散后按所需比例加入MEM營養(yǎng)液，將細胞液按比例分 裝至新細胞瓶中，至37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，待細胞長滿單層后取用或繼續(xù)傳代。
[0045] 基礎(chǔ)種毒培養(yǎng)：取長勢良好且已鋪滿單層的BHK21-C13貼壁細胞，棄去原培養(yǎng)液， 加入病毒維持液（維持液配方:MEM培養(yǎng)基，用7. 5% (質(zhì)量體積百分比W/V)碳酸氫鈉溶液 調(diào)節(jié)PH值至7.4±0.5,添加1%-3% (體積百分比）的新生牛血清；MEM培養(yǎng)基購自宜興 市賽爾生物科技有限公司，產(chǎn)品代碼：1605-030)補充至原體積，再按1% (體積比）的比 例加入偽狂犬種毒（例如Bartha-K61毒株，來源中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研宄所），于 37°C培養(yǎng)，當(dāng)細胞病變多75% (數(shù)量百分比）時收獲病毒液得到偽狂犬基礎(chǔ)種毒，-20°C冷 凍保存，取樣檢測TCID5tl，每0.ImL病毒含量應(yīng)彡106_°TCID5Q。
[0046] 2、偽狂犬生產(chǎn)用懸浮種毒培養(yǎng)
[0047] 將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)合格的懸浮BHK21-C13細胞（步驟二獲得，取用量依據(jù)規(guī)模調(diào) 整），棄掉原培養(yǎng)液，加入病毒維持液（維持液配方：BBSM培養(yǎng)基按I. 15g/L加入的碳酸氫 鈉，添加1%-3% (體積百分比）新生牛血清，調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.5)恢復(fù)至原培養(yǎng)體積， 再加入1 % (體積百分比）偽狂犬基礎(chǔ)種毒（上述步驟1得到），設(shè)定病毒培養(yǎng)的PH值為 7. 40-7. 60，D0 :20% -60% (飽和度百分比），轉(zhuǎn)速：60-110rpm，溫度：36. 0±0. 5°C，累計懸 浮培養(yǎng)72-96h，待細胞病變多75% (數(shù)量百分比）時收獲病毒液作為懸浮生產(chǎn)種毒，-20°C 冷凍保存。
[0048] 更大規(guī)模生產(chǎn)時，可用收獲的生產(chǎn)用懸浮種毒液，經(jīng)反應(yīng)器再連續(xù)培養(yǎng)2-3代作 為懸浮生產(chǎn)種毒，-20°C保存。
[0049] 四、偽狂犬生產(chǎn)用懸浮毒液培養(yǎng)
[0050] 1、50L反應(yīng)器培養(yǎng)偽狂犬生產(chǎn)用懸浮病毒液
[0051]將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)合格的懸浮BHK21-C13細胞（步驟二獲得），棄掉懸浮專用培養(yǎng) 基，加入病毒維持液（維持液配方：BBSM培養(yǎng)基按I. 15g/L加入碳酸氫鈉，添加1% -3% (體積百分比）新生牛血清，調(diào)節(jié)PH值至7. 4±0. 5)恢復(fù)至原培養(yǎng)體積，再加入1% (體積 百分比）偽狂犬懸浮生產(chǎn)種毒（步驟三得到），設(shè)定病毒培養(yǎng)的pH值為7. 40-7. 60,DO值： 20%-60% (飽和度百分比），轉(zhuǎn)速：60-110rpm，溫度：36.0±0.5°C。懸浮培養(yǎng)，待細胞病變 彡75% (數(shù)量百分比）時收獲病毒液，-20°C冷凍保存。取樣檢測TCID5tl，每0.ImL中病毒 含量應(yīng)》IO6tlTCID5ci。將符合要求的病毒液用于配制疫苗。
[0052] 2、500L反應(yīng)器培養(yǎng)偽狂犬生產(chǎn)用懸浮病毒液
[0053]將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)合格的懸浮BHK21-C13細胞（步驟二獲得），棄掉懸浮專用培養(yǎng) 基，加入病毒維持液（維持液配方：BBSM培養(yǎng)基按I. 15g/L