[0037] CO2孵育箱，購自三洋電器有限公司，型號：MC0_15AC
[0038] 生物安全柜，購自Thermo公司，型號：1389
[0039] I. 5mL離心管，購自美國Axygen公司
[0040] 15mL、50mL離心管，購自美國康寧公司。
[0041] I. 2Cac〇-2細胞培養(yǎng)方法
[0042] 細胞培養(yǎng)在T-225小瓶內(nèi)（225cm2組織培養(yǎng)瓶中），隔日更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天用含 EDTA(ImM)的胰蛋白酶（0.25%)溶液消化后分散成細胞懸液，隨后接種于24孔板內(nèi)放置 的1'四118￥611小室內(nèi)（0.7〇11 2/￥611，0.4 4]\1孔徑，]\^11丨口〇代）。0.8\105細胞培養(yǎng)在0.21^ 10 %胎牛血清（FBS) MEM培養(yǎng)基中（含有0.1 mM的非必需氨基酸、2mM的L-谷氨酰胺、4. 5g/ L的葡萄糖）。下部接收池添加 ImLlO % FBS MEM培養(yǎng)基。24孔板中的Transwell小室培 養(yǎng)在37°C含有5 % 0)2和90 %濕度的細胞培養(yǎng)箱中。用含有10% FBS的MEM培養(yǎng)基隔日 換液。
[0043] CAC0-2細胞培養(yǎng)7-8天左右匯合成細胞單層。通過跨膜電阻儀（CT)檢測TEER 值（細胞電阻值），隨著細胞上皮電阻值逐漸增加，細胞形成緊密連接。為確保有一個完整 的腸上皮細胞樣細胞的分化層，培養(yǎng)約21-25天細胞單層形成（代數(shù)20-40)，TEER值超過 300 Ω .cm2即可用于實驗。
[0044] I. 3Cac〇-2細胞實驗步驟
[0045] Caco-2細胞的實驗是在帶有Transwell插件的24孔板內(nèi)進行的。小室內(nèi)為絨毛 偵Ij (apical side，AP)小室外為基底側(cè)（basolateral side，BL) 〇
[0046] 實驗1 :用37°C的HBSS緩沖液預(yù)平衡30分鐘后，再用37°C緩沖液洗凈細胞單層 (AP和BL側(cè)）。AP側(cè)添加500 μ L空白緩沖液或含藥緩沖液（含底物奎尼丁 0. 05 μ M，中藥 組合物待測品0 %或0. 1 %或1 %或酮康唑1. 2 μ Μ，η = 3)，BL側(cè)添加750 yL的含藥緩沖 液（含底物奎尼丁 0.05 μΜ，待測品0%或0. 1 %或1 %或酮康唑1.2 μΜ，η = 3)或空白緩 沖液。孵育120分鐘后于接收池中取100 μ L緩沖液樣品加入10 μ L乙腈和200 μ L內(nèi)標液 (含〇· 1 μ M華法林的冷乙腈）終止反應(yīng)。
[0047] 實驗2 :用含有待測物（中藥組合物口服制劑）的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞72小時，用37°C 的HBSS緩沖液換去含有待測物的培養(yǎng)液，預(yù)平衡30分鐘后，再用37°C緩沖液洗凈細胞單層 (AP和BL側(cè)）。AP側(cè)添加500 μ L空白緩沖液或含藥緩沖液（含底物奎尼丁 0. 05 μ M，待測 品0 %或0. 1 %或1 %或酮康唑1.2 μ Μ，η = 3)，BL側(cè)添加750 μ L的含藥緩沖液（含底物 奎尼丁 0.05 μΜ，中藥組合物口服制劑0%或0. 1 %或1 %或酮康唑1. 2 μΜ，η = 3)或空白 緩沖液。孵育120分鐘后于接收池中取100 μ L緩沖液樣品加入10 μ L乙腈和200 μ L內(nèi)標 液（0. 1 μ M華法林的冷乙腈）終止反應(yīng)。
[0048] 實驗1和實驗2的標取樣品均取100 μ L空白緩沖液加入10 μ L標取工作液（奎 尼丁濃度為〇、〇. 1、〇. 2、0. 4、1、2、4和ΙΟμΜ的乙腈溶液）和200 yL內(nèi)標液（0. ΙμΜ華法 林的冷乙腈）。所有樣品渦旋混合后于3600rpm離心5分鐘。取上清150 μ L加入96孔板。 分析色譜柱為C181. 7 μπι 2. lX50mm Column(Waters)和三重四極桿質(zhì)譜（ΑΡΙ4000, AB公 司）進樣檢測，進樣體積為5yL。計算分析柱流出的分析物和內(nèi)標的峰面積。分析條件詳 見附錄。
[0049] 2.數(shù)據(jù)分析
[0050] 用下面的計算公式計算表觀滲透系數(shù)Papp和Ratio,并比較空白和0. 1%或1%中 藥組合物口服液時的Ratio。如果0. 1 %或1 %中藥組合物口服液（待測品）的Ratio比 空白的Ratio低20%以上，證明中藥組合物口服液（待測品）具有抑制P-gp作用。如果 0· 1%或1%中藥組合物口服液（待測品）的Ratio比空白的Ratio低20%以內(nèi)，則表明中 藥組合物口服液（待測品）不是P-gp抑制劑或是很弱的抑制劑。
[0051] 計算公式：
[0052] Papp = (C*V/t) / (A*C0)
[0053] Ratio = Papp BL-to-AP/Papp AP_to - BL
[0054] C =樣品濃度
[0055] V =接收池緩沖液的體積
[0056] A =膜表面積（cm2,在我們的研宄中A = 0· 70cm2)
[0057] CO =初始孵育濃度
[0058] Papp =表觀滲透系數(shù)，表示為cm/sec*10_6
[0059] Papp AP - BL =計算AP為加藥池，BL為接收池的Papp值
[0060] Papp BL - AP =計算AP為接收池，BL為加藥池的Papp值。
[0061] 3.結(jié)果與討論
[0062] 實驗1中底物奎尼丁在各實驗樣品的接收池緩沖液中的濃度值詳見表1。實驗2 中經(jīng)不同天佛參口服液樣品孵育3天后底物奎尼丁在各實驗樣品的接收池緩沖液中的濃 度值詳見表2。實驗1中天佛參口服液及陽性對照酮康唑的Ratio和與空白Ratio之差總 結(jié)于表3。實驗2中經(jīng)不同天佛參口服液樣品孵育3天后底物奎尼丁在各實驗樣品的接收 池緩沖液中的濃度總結(jié)于表4。
[0063] 表1實驗1中底物奎尼丁在各實驗樣品的接收池緩沖液中的濃度
[0064]
【主權(quán)項】
1. 一種中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的中藥 組合物由以下重量份的原料制得：西洋參40~50份、蟾酥0. 25~0. 30份、天門冬140~160份、 土貝母180~200份、倒卵葉五加550~650份、獼猴桃根800~1000份、沙棘果300~330份、佛 手 140~160 份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料制得：西洋參50g、蟾酥0. 25g、天冬167g、土 貝母200g、倒卵葉五加599g、獼猴桃根1000g、沙棘果333g、佛手167g。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，所述的腫瘤為結(jié)腸癌，肺癌，乳腺癌，肝癌或?qū)m頸癌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述的藥物為口服制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，所述的口服制劑是口服液、顆粒劑、散劑、丸劑、膠囊劑或片劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論，采用辨證論治的理論進行中藥組方篩選，各藥味配比科學(xué)合理，并對中藥復(fù)方的臨床功效進行深入研究，開發(fā)其新的臨床功效。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的中藥組合物對結(jié)腸腺癌Caco-2細胞中P-糖蛋白（P-gp）具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出很好的抗腫瘤多藥耐藥的功效。并且臨床實驗結(jié)果證實，本發(fā)明提供的中藥組合物可有效治療產(chǎn)生多藥耐藥的腫瘤疾病。
【IPC分類】A61K36-8965, A61K35-65, A61P35-00
【公開號】CN104825763
【申請?zhí)枴緾N201510289522
【發(fā)明人】顧治平, 王恒斌, 張禮學(xué), 陳力建
【申請人】常熟雷允上制藥有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月29日