壓力下由氣體 推進(jìn)劑攜帶至治療應(yīng)用的位點(diǎn)。本發(fā)明的醫(yī)療氣霧劑含有在流體載體和推進(jìn)劑混合物中可 溶解、分散或乳化的治療活性化合物。氣霧劑的形式可W有溶液、懸液、乳液、粉末或半固體 制劑。本發(fā)明的氣霧劑作為精細(xì)的、固體的顆粒或液霧用于經(jīng)患者的呼吸道給藥?？墒褂?各種類型的推進(jìn)劑，包括但不限于，控類或其它合適的氣體。本發(fā)明的氣霧劑也可通過噴霧 器進(jìn)行遞送，其在氣體中產(chǎn)生基本上均勻大小的非常精細(xì)的液體顆粒。優(yōu)選的，含有活性化 合物的液體被分散為液滴，其可W被氣流攜帶出噴霧器，進(jìn)入患者呼吸道。
[0056] 術(shù)語"改善"指在治療例如流感相關(guān)疾病狀態(tài)的疾病狀態(tài)中得到的任何有益的治 療結(jié)果，包括預(yù)防、減輕嚴(yán)重程度或進(jìn)程、緩解或治愈。
[0057] 一般而言，術(shù)語"耐受良好的"指不存在由治療導(dǎo)致的會影響治療決定的健康狀況 的負(fù)面變化。
[0058] "協(xié)同作用"指一種相互作用，其中兩種或更多藥劑的組合效果大于其各自效果的 代數(shù)和。
[0059] 術(shù)語"體外"指在活體有機(jī)體外生長、例如生長于組織培養(yǎng)物中的活細(xì)胞中發(fā)生的 過程。
[0060] 術(shù)語"體內(nèi)"指在活體有機(jī)體內(nèi)發(fā)生的過程。
[0061] 在此使用的術(shù)語"哺乳動物"包括人和非人，并且包括但不限于人、非人靈長類，犬 科、貓科、鼠科、?？啤ⅠR科W及豬科動物。
[0062] 術(shù)語"足夠的劑量"表示足W產(chǎn)生目標(biāo)效果的劑量，例如足W調(diào)控細(xì)胞中蛋白聚集 的劑量。
[0063] 術(shù)語"治療上有效量"是有效緩解疾病癥狀的劑量。治療上有效量可W是"預(yù)防性 有效量"，因?yàn)轭A(yù)防可被認(rèn)為是治療。
[0064] 在此使用的術(shù)語"包含"、"含有"、"包括"、"具有"或其任何其它變化，意為覆蓋一種 非排他性的涵蓋。例如，包含一系列元素的過程、方法、制品或設(shè)備不必限制于僅僅那些元 素，而是可W包括其它未明確列出的或該過程或方法中固有的元素。此外，除非有明確的相 反說明，"或"指包括性的"或"，而不指排他性的"或"。例如，通過下述任一均可滿足條件A 或B:A是真的（或存在）和B是假的（或不存在）、A是假的（或不存在）和B是真的（或 存在）、W及A和B都是真的（或存在）。 陽0化]需要理解，本發(fā)明不限于特定方法、試劑、化合物、組合物、或生物系統(tǒng)，當(dāng)然其可W進(jìn)行變化。還應(yīng)理解在此使用術(shù)語的目的僅在于描述特定方面，并不意味著限制。如在 此說明書和之后的權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"包括復(fù)數(shù)的指示物，除非 內(nèi)容中清楚地另外指明。從而，例如，"一種疫苗"的意義包含了兩種或更多疫苗的組合，等 等。
[0066] 在此使用的"約"在指明例如劑量、時(shí)間段等可測量值的時(shí)候，意為涵蓋了該特定 值±20%或±10%、更加優(yōu)選的±5%、更加優(yōu)選的±1%化及甚至更加優(yōu)選的±0. 1%的 變化，因?yàn)檫\(yùn)些變化適于進(jìn)行所公開的方法。
[0067] 流感病毒類型
[0068] 本發(fā)明普遍地用于治療或預(yù)防哺乳動物流感病毒感染。本發(fā)明可W祀向Ξ種類型 的流感病毒：甲型、乙型和丙型流感病毒。甲型流感病毒根據(jù)病毒表面的兩種蛋白質(zhì)被分 為若干亞型。運(yùn)些蛋白質(zhì)被稱為血球凝集素（H)和神經(jīng)氨酸巧酶（腳。甲型流感病毒根據(jù) 運(yùn)兩種蛋白質(zhì)被分為若干亞型。存在16種不同的血球凝集素亞型出1、肥、冊、冊、H4、冊、 H7、冊、冊、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16 ;和9種不同的神經(jīng)氨酸巧酶亞型：N1、N2、 N3、Μ、N5、N6、N7、N8、或N9,其全部都已經(jīng)在野生甲型禽流感病毒中有所發(fā)現(xiàn)。甲型流感 病毒包括甲型化1Ν1)和甲型化3Ν2)，其都是本發(fā)明可W在哺乳動物中治療或預(yù)防所祀向 的流感病毒的例子。一般由流感病毒感染導(dǎo)致的疾病和癥狀可W包括：發(fā)燒、咳嗽、打噴曖、 疼痛、疲勞、頭痛、流眼水、鼻腔充血W及腹痛。本發(fā)明可用于治療或預(yù)防運(yùn)些疾病。 W例組合物
[0070] 博代氏巧蔭蔭株
[0071]本發(fā)明提供了突變的博代氏桿菌菌株，其可被用作免疫原性組合物或疫苗W在哺 乳動物中誘發(fā)免疫應(yīng)答。在一個(gè)方面，該突變的博代氏桿菌菌株包含突變的Ptx基因、缺失 或突變的化t基因、和異源ampG基因。異源ampG基因產(chǎn)物能夠大量降低產(chǎn)生的氣管細(xì)胞 毒素?cái)?shù)量。在一個(gè)方面，該菌株是BPZE1。進(jìn)行突變的初始菌株可W是任何博代氏桿菌菌 株，包括百日咳博代氏桿菌、副百日咳博代氏桿菌和支氣管炎博代氏桿菌。在一個(gè)方面，用 于得到該突變的博代氏桿菌菌株的初始菌株是百日咳博代氏桿菌。在另一方面，該菌株是 Ξ突變的博代氏桿菌菌株。在另一方面，該博代氏桿菌菌株的保藏號為CNCM1-3585。在另 一方面，該博代氏桿菌菌株的保藏號為V09/009169。
[0072] 本發(fā)明不僅限于上述突變體。其也可W是其它另外的突變，例如腺巧酸環(huán)化酶 (AC)缺陷型突變體、脂多糖（LP巧缺陷型突變體、纖維狀血球凝集素（FHA)W及任何一種 bvg調(diào)節(jié)元件。
[0073] 本發(fā)明的突變博代氏桿菌菌株的構(gòu)建可W始于將該菌株中的博代氏桿菌ampG基 因替換為異源ampG基因。任何本領(lǐng)域已知的異源ampG基因都可被用于本發(fā)明。其例子可 W包括每代向培養(yǎng)基中釋放非常少量的膚聚糖片段的所有革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì) 菌的例子包括但不限于：大腸埃希氏菌巧scherichiacoli)、沙口氏菌（Salmonella)、腸 桿菌科細(xì)菌巧nterobacteriaceae)、假單胞菌（Pseudomonas)、莫拉菌（Moraxella)、螺桿 菌化elicobacter)、狹長平胞菌（Stenotrophomonas)、軍團(tuán)桿菌(Xegionella)等等。一般， 通過將博代氏桿菌ampG基因替換為異源ampG基因，得到的菌株中產(chǎn)生氣管細(xì)胞毒素（TCT) 的量表現(xiàn)出低于1%的TCT殘留活性。在另一方面，得到的菌株中表達(dá)TCT的量為約0. 6% 至1 %的TCT殘留活性或約0. 4 %至3 %的TCT殘留活性或約0. 3 %至5 %的TCT殘留活性。
[0074]PTX是導(dǎo)致全身性百日咳博代氏桿菌感染的主要的致病因子，也是一種主要的保 護(hù)性抗原。因?yàn)檫\(yùn)些屬性，天然的ptx基因可W被替換為突變的版本，從而酶活性部分S1 編碼酶失活的毒素，但是其百日咳毒素的免疫原性不受影響。運(yùn)可W通過將序列第9位的 賴氨酸（Lys)替換為精氨酸（Arg) (K9R)來實(shí)現(xiàn)。此外，第129位的谷氨酸（Glu)可W被替 換為甘氨酸（Gly)(E129G)。運(yùn)些氨基酸位點(diǎn)一般分別參與底物結(jié)合和催化。在其它方面， 還可W進(jìn)行其它突變，例如描述于美國專利號6, 713, 072,在此引入作為參考，W及任何已 知的或其它能夠降低毒素活性的突變。在一個(gè)方面，可W首先應(yīng)用等位基因交換W刪除ptx 操縱子然后插入突變的版本。
[00巧]在本發(fā)明的另一方面，可W應(yīng)用等位基因交換W將化t基因從該博代氏桿菌菌 株中移除。除了全部移除外，酶活性也可W通過點(diǎn)突變來進(jìn)行抑制。由于DNT包括N端 區(qū)域的受體結(jié)合域W及C端的催化域，因此對化t基因進(jìn)行點(diǎn)突變，將切S-1305替換為 Ala-1305 能夠抑制DNT活性化ashimotoT.，Kat址iraJ，CornejoWR，MasudaM，Ρ?ι?αιο?ι A，MatsuzawaT，0hnishiT，HoriguchiY. (1999)Identificationoffunctionaldomains ofBordetelladermonecrotizingtoxin.Infect.Immun. 67:3727-32.)。
[0076] 除了等位基因交換插入突變的ptx基因和受抑制或缺失的化t基因外，基因的開 放閱讀框可W通過插入基因序列或質(zhì)粒來進(jìn)行打斷。該方法也包括在本發(fā)明中。其它產(chǎn)生 突變體菌株的方法一般是本領(lǐng)域公知的。
[0077] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，該突變的菌株被稱為BPZE1菌株，其已于2006年3月9日按 照布達(dá)佩斯條約保藏于法國己黎的國家微生物菌種保藏中屯、（CNCM)，分配的保藏號為CNCM 1-3585。引入BPZE1的突變一般導(dǎo)致減弱，但是仍然允許細(xì)菌菌落繁殖并維持。從而，在 另一方面，本發(fā)明提供了BPZE1，其在給藥至有需求的哺乳動物時(shí)能夠誘導(dǎo)黏膜免疫和全身 免疫。在本發(fā)明的另一方面，構(gòu)建了表達(dá)Ξ拷貝M2e多膚的BPZE1重組菌株。該菌株已于 2009年4月27日按照布達(dá)佩斯條約保藏于澳大利亞3207維多利亞州墨爾本港的國家測量 研究院（化tionalMeasurementInstitute,之前的AGAL)，分配的保藏號為V09/009169。 M2e是流感病毒M2蛋白的胞外部分。其在所有甲型流感病毒中都高度保守，已發(fā)現(xiàn)其能夠 誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的對甲型流感病毒的抵抗。重組產(chǎn)M2e的BPZE1菌株能夠誘發(fā)（例如，通過 活菌鼻腔給藥）大量抗-M2e抗體應(yīng)答（局部和全身），從而相對于單獨(dú)的BPZE1細(xì)菌而言 能夠?qū)疦1和冊N2攻擊進(jìn)行顯著性保護(hù)。
[0078] 本發(fā)明的突變博代氏桿菌菌株可被用在用于治療或預(yù)防流感病毒感染免疫原性 組合物中。該免疫原性組合物能用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答，或者是哺乳動物中的抗體應(yīng)答，或者是 T細(xì)胞應(yīng)答。例如，T細(xì)胞應(yīng)答可W是保護(hù)哺乳動物免受流感病毒感染或免受其影響/疾病 /癥狀。
[0079] 本發(fā)明的突變博代氏桿菌菌株可在疫苗或免疫原性組合物中作為活菌株使用。在 一個(gè)方面，活菌株被用于鼻腔給藥，而化學(xué)或熱法殺死的菌株可用于全身或黏膜給藥。在其 它方面該菌株是減毒的。
[0080] 在本發(fā)明的其它方面，該菌株除了上述的異源ampG基因W外不包含其他任何異 源基因。在其它方面，該菌株不包含異源的表達(dá)平臺（參見，例如，W02007104451)。一般， 異源表達(dá)平臺攜帶異源抗原。在一個(gè)方面，異源表達(dá)平臺可用于遞送異源抗原至哺乳動物 的呼吸道黏膜。
[0081]
[0082] 本發(fā)明的組合物可與包括佐劑的其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給藥。在此使用的術(shù)語"佐 劑"指一種增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物或混合物。特別的，組合物可W包含佐劑。用于本發(fā)明的 佐劑可W包括但不限于W下的一種或多種：
[0083] 含礦物化劑紀(jì)合物
[0084] 可作為佐劑用于本發(fā)明的含礦物組合物包括礦物鹽，例如侶鹽和巧鹽。本發(fā)明包 括例如徑化物（例如，氨氧化合物）、憐酸鹽（例如，徑基憐酸鹽、正憐酸鹽）、硫酸鹽等的 礦物鹽（例如，參見VaccineDesi即...（1995)，化well&Newman編輯，ISBN:030644867X. Plenum.的第8和9章），或不同礦物化合物的混合物（例如，憐酸鹽和氨氧化物佐劑和可 選的過量憐酸鹽的混合物），其化合物具有任何合適的形式（例如，凝膠、晶體、無定形，等 等），且被吸附至優(yōu)選的鹽。含礦物組合物也可制成金屬鹽的顆粒（W0/0023105)。
[00財(cái)本發(fā)明的組合物中可W包含侶鹽，其中A1/的量為0. 2至1.Omg/劑。
[0086] 油-到，化劑 W87] 可作為佐劑用于本發(fā)明的油-乳液組合物可W包括整締-水乳液，例如MF59 6%整締、0.5%吐溫80和0.5%Span85,使用均質(zhì)機(jī)制成亞微米顆粒）。參見，例 如，W090/14837。還參見，Podda，"Theadjuvantedinfluenzavaccineswithnovel adjuvants:experiencewiththeMF59-adjuvantedvaccine"，Vaccine19:2673-2680， 2001。
[0088] 在其它相關(guān)方面，用于組合物的佐劑為亞微米水包油乳液。在此使用的亞微米 水包油乳液的例子包括整締/水乳液，其可選地包含可變量的MTP-PE，例如包含4-5%w/ V整締、0. 25-1. 0%w/v吐溫80(聚氧乙締山梨醇酢單油酸醋）、和/或0. 25-1. 0%Span 85(山梨醇Ξ油酸酸醋）、W及可選的N-乙酷胞壁酷-k丙氨酷-D-異谷氨A-丙氨 酸-2-0--2' -二棟桐酷-s-n-甘油酸-3-徑基憐酷基氧基）-乙胺（MTP-P巧的亞微米 水包油乳液，例如，被稱為"MF59"的亞微米水包油乳液（國際公開號W090/14837 ;美國專 利號6, 299, 884和6, 451，325,在此整體引入作為參考；和Ott等人，"MF59--Desi即and EvaluationofaSafeandPotentAdjuvantforHumanVaccines"，發(fā)表于Vaccine Design:TheSubunitandAdjuvantApproach(Powell，！.F.和Newman，！.J.編輯：）Plenum Press,化w化rk，1995,卵.277-296)。MF59 可W含有 4-5 %w/v整締（例如，4. 3 % )、 0. 25-0. 5%w/v吐溫80、和0. 5%w/vSpan85W及可選的包含不同量的MTP-PE，使用例如 Model110Y均質(zhì)機(jī)（Microfluidics，Newton,MA)制成亞微米顆粒。例如，MTP-PE的含量 可W為約 0-500μg/劑、或 0-250μg/劑、或 0-100μg/劑。
[0089] 用于組合物的亞微米水包油乳液、該乳液W及免疫促進(jìn)劑例如胞壁膚的制備方法 的細(xì)節(jié)描述于國際公開號W090/14837和美國專利號6, 299, 884和6, 451，325,在此整體引 入作為參考。
[0090] 完全弗氏佐劑（CFA)和不完全弗氏佐劑（IFA)也可用作本發(fā)明的佐劑。
[0091] 皂素化劑制劑
[0092] 皂素制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂素是醬巧和Ξ祗巧的雜合物，發(fā)現(xiàn)于多種植 物品種的皮、葉、莖、根和甚至花。來自皂樹（如illaiasaponariaMolina)皮的皂素被作 為佐劑廣泛研究。皂素也可W商購自墨西哥費(fèi)奠（Smilaxornata)、滿天星（Gypso地ilia paniculata)和肥皂草（Saponariaofficianalis)(皂根）。皂素佐劑制劑可W包括純化 制劑，例如QS21，W及脂質(zhì)制劑，例如免疫刺激復(fù)合物（ISC0M;見下文）。
[0093] 已經(jīng)使用高效薄層色譜0PLC)和反相高效液相色譜（RP-冊LC)對皂素組合物進(jìn) 行了純化。使用運(yùn)些技術(shù)的特定純化組分已被鑒別，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B 和QH-C。生產(chǎn)QS21的方法公開于美國專利號5, 057, 540。皂素制劑也可含有醬體，例如膽 固醇（參見W096/33739)。
[0094] 皂素和膽固醇的組合可用于形成獨(dú)特的顆粒，稱為ISC0M。ISC0M-般還包括憐酸 脂質(zhì)，例如憐脂酷乙醇胺或憐脂酷膽堿。任何已知皂素均可被用于ISC0M。例如，ISC0M可 W包括一種或多種的如ilA、QHA和卵C。ISC0M進(jìn)一步描述于EP0109942、W096/11711和 W096/33739。可選地，ISCOM可W不含額外的去垢劑。參見WOOO/07621。 W巧]對于基于皂素的佐劑的研發(fā)可參見Barr等人的描述，"ISCOMsandother saponinbasedadjuvants"，AdvancedDrugDeliveryReviews32:247-27,1998。還參 見Sjol曰nder等人，"Upt曰ke曰nd曰djuv曰ntactivityoforallydeliveredsaponinand ISCOMvaccines",AdvancedDrugDeliveryReviews32:321-338,1998。 陽W6] 病毒顆粒巧病毒樣顆粒（VLP)
[0097] 病毒顆粒和病毒樣顆粒（VL巧也可用作本發(fā)明的佐劑。運(yùn)些結(jié)構(gòu)一般含有來自病 毒的一種或多種蛋白質(zhì)，可選的與憐酸脂質(zhì)進(jìn)行組合或制劑。它們一般是非病原的、非復(fù)制 的且一般不含有任何原始病毒基因組。病毒蛋白質(zhì)可W重組生產(chǎn)或從整病毒中分離。運(yùn)些 適用于病毒顆粒或VLP的病毒蛋白質(zhì)包括衍生自流感病毒（例如HA或NA)、乙肝病毒（例 如核屯、或衣殼蛋白質(zhì)）、戊肝病毒、麻疹病毒、Simlbis病毒、Rota病毒、口蹄疫疾病病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒、Norwa化病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-隧菌體、地-隧菌體（例如包被蛋白質(zhì)）、 GA-隧菌體、化-隧菌體、AP205隧菌體、和Ty(例如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白質(zhì)pi)的蛋白質(zhì)。 陽0巧]細(xì)蔭或微牛物衍牛物
[0099] 可用作本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，例如：
[0100] (1)腸桿菌脂多糖（LP巧的無毒性衍生物 陽1〇U 該衍生物包括單憐酸脂質(zhì)A(MPL)和3-0-去酷基MPL(3dMPL)。3dMPL是帶有4、5 或6酷化鏈的3脫-0-酷化單憐酸脂質(zhì)A混合物。3脫-0-酷化單憐酸脂質(zhì)A"小顆粒"形 式的一個(gè)例子公開于EP0 689 454。該3dMPL的"小顆粒"足夠小，可W通過0.22微米膜 進(jìn)行無菌過濾（參見EP0 689 454)。其它無毒性LI^衍生物包括單憐酸脂質(zhì)A模擬物， 例如氨烷基氨基葡糖巧憐酸衍生物，例如，RC-529。參見化hnson等人，BioorgMed化em Lett9 :2273-2278,1999ο 陽1〇2] (2)脂質(zhì)A衍生物 陽103] 脂質(zhì)A衍生物可包括來自大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于 例如Meraldi等人，"0M-174,aNewAdjuvantwithaPotentialforHumanUse,Induces aProtectiveResponsewithAdministeredwiththeSyntheticC-TerminalFragment 242-310fromthecircumsporozoiteproteinofPlasmodiumberghei"，Vaccine 21:2485-2491,2003;和化jak等人，"TheAdjuvant0M-174inducesboththemigration andmaturationofmurinedendriticcellsinvivo"，Vaccine21:836-842,2003。 [0104] (3)免疫刺激寡核巧酸
[01化]可用作本發(fā)明的佐劑的免疫刺激寡核巧酸可包括含有CpG基序的核巧酸序列（含 有未甲基化胞喀晚與鳥巧經(jīng)憐酸鍵連接的序列）。已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌雙鏈RNA或含有回文或聚 (dG)序列的寡核巧酸具有免疫刺激性。
[0106]CpG可包含核巧酸修飾/類似物例如硫代憐酸修飾，其可W是雙鏈或單鏈 的。可選地，鳥巧可W被替換為類似物例如2'-脫氧-7-去氮鳥巧。參見Kandimalla 等人，"Divergentsyntheticnucleotidemotifrecognitionp曰ttern:designand developmentofpotentimmunomodulatoryoligodeoxyribonucleotideagentswith distinctcytokineinductionprofiles"，NucleicAcidsResearch31:2393-2400， 2003 ;W002/26757和W099/62923中類似物取代的例子。CpG寡核巧酸佐劑效果進(jìn)一步 在1^ 下文獻(xiàn)中有所討論：Krieg，"CpGmotifs:theactiveingredientinbacterial extracts?"，Na化reMedicine(2003) 9 (7) :831-835;McCluskie等人，"Parenteraland mucosalprime-boostimmunizationstrategiesinmicewithhepatitisBsurface antigenandCpGDNA"，F(xiàn)EMSImmunologyandMedicalMicrobiology(2002)32:179-185 ; W098/40100 ;美國專利號6, 207, 646 ;美國專利號6, 239, 116和美國專利號6, 429, 199。
[0107]CpG序列可W針對Toll-樣受體（TLR9)，例如基序GTCGTT或TTCGTT。參 見Kandimalla等人，"Toll-likereceptor9:modulationofrecognitionand cytokineinductionbynovelsyntheticCpGDNAs''，BiochemicalSociety Transactions(2003) 31(part3) : 654-658。CpG序列可W特異性地誘導(dǎo)化1 免疫應(yīng) 答，例如CpG-AODN，或其可W更加特異性地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-BODN。CpG-A 和CpG-BODN參見Blackwell等人，"CpG-A-Induce