dMonocyteIFN-gamma-Inducible Protein-lOProductionisRegulatedbyPlasmacytoidDendriticCellDerived IFN-alpha"，J.Immunol. 170:4061-4068,2003 ;Krieg，"FromAtoZonCpG"，T肥NDSin Immunology23:64-65, 2002,和WOOl/95935。
[0108] 在一些方面，CpG寡核骨酸可被構(gòu)建為其5'末端可被受體識別?？蛇x地，兩 種CpG寡核骨酸序列可被連接至其3'末端W形成"免疫體（immunomer)"。參見，例 女日，Kandimalla等人，"SecondarystructuresinCpGoligonucleotidesaffect immunostimulatoiTactivity",BBRC306:948-95,2003;Kandimalla等人，"Toll-like receptor9:modulationofrecognitionandcytokineinductionbynovelsynthetic GpGDNAs"，BiochemicalSocietyTransactions31:664-658,2003;趾agat等人，"CpG penta-andhexadeoxyribonucleotidesaspotentimmunomodulatoryagents，，BB民C 300:853-861，2003,和W003/035836。
[0109] (4)ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。
[0110] 細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可被用作本發(fā)明的佐劑。例如，毒素可 ^衍生自大腸桿菌（即，大腸桿菌不耐熱腸毒素化T))、霍亂（CT)、或百日咳巧TX)。脫 毒ADP-核糖基化毒素作為黏膜佐劑的應(yīng)用描述于W095/17211，作為腸道外佐劑描述于 W098/42375。在一些方面，佐劑可W是脫毒LT突變體例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。 ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72,作為佐劑的應(yīng)用可^在 W下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，其分別在此全文引入作為參考：Beignon等人，"化eLTR72Mutantof Heat-LabileEnterotoxinofEscherichiacoliEnahncestheAbilityofPeptide AntigenstoElicitCD4+TCellsandSecreteGammaInterferonafterCoapplication ontoBareSkin",InfectionandImmunity70:3012-3019,2002;Pizza等人，"Mucosal vaccines:nontoxicderivativesofLTandCTasmucosaladjuvants*'，Vaccine 19:2534-2541,2001;Pizza等人，"LTK63andLTR72，twomucosaladjuvantsreadyfor clinicaltrials"Int.J.Med.Microbiol290:455-461，2003 ;Scharton-Kersten等 人，"TranscutaneousImmunizationwithBacterialADP-民ibosylatingExotoxins， SubunitsandUnrelatedAdjuvants"，InfectionandImmunity68:5306-5313， 2000 ;民yan等人，"MutantsofEscherichiacoliHeat-LabileToxinActas EffectiveMucosalAdjuvantsforNasalDeliveryofanAcellularPertussis Vaccine:DifferentialEffectsoftheNontoxicABComplexandEnzymeActivity onThlandTh2Cells"InfectionandImmunity67:6270-6280,2003 ;Pa;rtidos等人， "Heat-labileenterotoxinofEscherichiacolianditssite-directedmutant LTK63enhancetheproliferativeandcytotoxicT-cellresponsestointranasally cQ-immunizedsyntheticpeptides"，Immunol.Lett. 67:09-216,1999;Peppoloni等人， "Mut曰ntsoftheEscherichi曰colihe曰t-l曰bileenterotoxin曰ss曰fe曰ndstrong adjuvantsforintranasaldeliveryofvaccines"，Vaccines2:285-293,2003 ;從及 Pine等人（2002)"Intranasalimmunizationwithinfluenzavaccineandadetoxified mutantofheatlabileenterotoxinfromEscherichiacoli(LTK63) "J.Control Release85:263-270,2002。氨基酸取代的數(shù)字基準(zhǔn)優(yōu)選地基于ADP-核糖基化毒素A和B 亞基的比對，參見Domeni曲ini等人，Mol.Microbiol15:1165-1167,1995,其在此整體引 入作為參考。 陽1川 牛物粘附劑巧黏腸粘附劑
[0112] 生物粘附劑和黏膜粘附劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘附劑可包括醋化 的透明質(zhì)酸微球（Sin曲等人，J.Cont.Rele. 70:267-276,2001)或黏膜粘附劑例如聚丙締 酸、聚乙締醇、聚乙締化咯酬聚糖和簇甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用 作本發(fā)明的佐劑。參見，例如，W099/27960。 。…]化劑微顆粒
[0114] 微顆粒也可用作本發(fā)明的佐劑。其可W考慮形成自生物可降解和/或無毒材料 (例如，聚α-徑基酸、聚徑基下酸、聚原酸醋、聚酢、聚己內(nèi)醋等等）、具有聚（丙交醋-乙 交醋）的微顆粒（即，顆粒直徑約100皿至約150μm，或直徑200皿至約30μm，或直徑約 500nm至約10μm)，可選地將其處理為具有負(fù)電荷表面（例如，用SDS處理）或正電荷表面 (例如，用陽離子去垢劑，例如CTAB處理）。
[0115]化劑胎質(zhì)體
[0116] 適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子參見美國專利號6, 090, 406、美國專利號 5,916,588 和EP0 626 169。 陽117]I.聚氧乙締酸和聚氧乙締醋制劑
[0118] 適合用作本發(fā)明的佐劑還包括聚氧乙締酸和聚氧乙締醋。W099/52549。該制劑 可W進(jìn)一步包括聚氧乙締山梨醇醋表面活性劑與辛基酪聚酸的組合（W001/21207)W及 聚氧乙締烷基酸或醋表面活性劑與至少一種非離子表面活性劑例如辛基酪聚酸的組合 (W001/21152)〇
[0119]在一些方面，聚氧乙締酸可包括：聚氧乙締-9-月桂基酸（月桂酸9)、聚氧乙 締-9-硬脂基酸、聚氧乙締-8-硬脂基酸、聚氧乙締-4-月桂基酸、聚氧乙締-35-月桂基酸 或聚氧乙締-23-月桂基酸。 陽120] 聚磯臘巧CP巧 陽121] 用作佐劑的PCPP制劑描述于，例如，An化ianov等人，"Preparationofhy化ogel microspheresbyco曰cerv曰tionof曰queouspolyphoph曰zenesolutions"，Biomaterials19:109-115,1998,和化yne等人，"ProteinReleasefromPolyphosphazeneMatrices", Adv.Drug.DeliveryReview31:185-196,1998。 陽1。]胸肆化
[0123] 適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁膚的例子可包括N-乙酷-胞壁酷A-蘇氨酷-D-異 谷酷胺（t虹-MDP)、N-乙酷-降胞壁酷-1-丙氨酷-d-異谷酷胺（nor-MDP)、和N-乙酷胞壁 酷-1-丙氨酷-d-異谷酷-1-丙氨酸-2-0--2' -二棟桐酷-s-n-甘油-3-徑基憐酸氧）-乙 胺（MTP-陽）。 陽124] 睞畔并睡腑化合物
[01巧]適合用作本發(fā)明佐劑的咪挫并哇嘟化合物的例子可包括咪哇莫特及其同系 物，其進(jìn)一步描述于St曰nley，"Imiquimodandtheimid曰zoquinolones:mech曰nismof actionandtherapeuticpotential"ClinExpDermatol27:571-577,2002 和Jones， "Resiquimod3M"，Qi;r;rOpinInvestigDrugs4:214-218,2003。 陽1%]人免巧調(diào)節(jié)劑
[0127] 適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑可包括細(xì)胞因子，例如白介素（例如，比-1、 比-2、比-4、比-5、比-6、比-7、比-12,等等）、干擾素（例如，干擾素-丫）、巨隧細(xì)胞集落刺 激因子和腫瘤壞死因子。 陽12引 化劑紀(jì)合
[0129] 本發(fā)明還可含有上述一種或多種佐劑的組合。例如，佐劑組合物可包括： 陽130] (1)皂素和水包油乳液（W099/11241);
[0131] (2)皂素（例如，QS2D+無毒性LPS衍生物（例如，3dMPL)(參見W094/00153); 陽132] (3)皂素（例如，QS21) +無毒性LPS衍生物（例如，3dMPL) + -種膽固醇； 陽 13引（4)皂素（例如，QS21)+3dMPL+IL-12(可選的 + 醬醇）（W098/57659);
[0134] (5)將SdMI^L與例如QS21和/或水包油乳液進(jìn)行組合（參見歐洲專利申請 0835318、0735898 和 0761231); 陽135] (6)SAF，含有10 %角整燒、0. 4 %吐溫80、5 %Pluronic嵌段共聚物L(fēng)121和 thr-MDP，其或者進(jìn)行微流乳化成亞微米乳液，或者縱滿振蕩產(chǎn)生較大顆粒的乳液。 陽136] (7)化bi佐劑系統(tǒng)（RA巧巧ibiImmunochem)，含有2%整締、0. 2%吐溫80、和選自 單憐酷脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸醋燈DM)和細(xì)胞壁骨架（CW巧的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞 壁成分，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);和
[0137] 做一種或多種礦物鹽（例如侶鹽）+LPS無毒性衍生物（例如3dPML)。
[0138] 侶鹽和MF59是用于可注射的流感疫苗佐劑的例子。細(xì)菌毒素和生物粘附劑是與 例如鼻腔疫苗的黏膜遞送疫苗一起使用的佐劑的例子。所有上述佐劑W及本領(lǐng)域一般技術(shù) 人員公知的其它佐劑都可W使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行配制用于鼻內(nèi)給藥。 制劑巧裁體
[0140] 用于治療或預(yù)防流感病毒感染相關(guān)疾?。?xì)節(jié)見下文）的方法也被本發(fā)明所涵 蓋。所述本發(fā)明的方法包括給藥治療上有效量的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物可配制 為藥物組合物。運些組合物除了一種或多種的該菌株外還可W包括藥學(xué)上可接受的賦形 劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑，或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的材料。運些材料一般應(yīng)該是無毒性 的，且一般不應(yīng)當(dāng)與活性成分的效果發(fā)生沖突。載體或其它材料的準(zhǔn)確性質(zhì)可W根據(jù)給藥 途徑判斷，例如，口服、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻腔、肌肉內(nèi)、或腹膜內(nèi)途徑。 陽141] 口服給藥的藥物組合物可W是藥片、膠囊、粉末或液體形式。藥片可包括固體載體 例如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包括液體載體例如水、石油、動物或植物油、礦物油、 或合成油。還可化含有生理鹽水溶液、葡萄糖或其它多糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇 或聚乙二醇。
[0142] 對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射，或在病痛部位注射，活性成分W腸道外可接受的水 溶液的形式存在，其不含熱原，且其具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員 有能力使用例如等張賦形劑來配制合適的溶液，例如氯化鋼注射、林格氏注射或乳酸林格 氏注射。也可根據(jù)需要含有防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其它添加劑。 陽143] 給藥量優(yōu)選的為"治療上有效量"或"預(yù)防性有效量"（根據(jù)可能的情況，盡管預(yù)防 可W被認(rèn)為是治療），其足W對個體顯示出益處。實際給藥量W及給藥速率和時間將會取決 于正在治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，例如對于劑量等的決定，是全科醫(yī)生和其 它醫(yī)師的責(zé)任，且一般要考慮待治療的疾病、患者個體的情況、給藥位置、給藥方法和醫(yī)生 知曉的其它因素。上述技術(shù)和方案的例子可W在最新版的Remington's化armaceutical Science，MackPublishingCompany，Easton，PA( "Remington'S")中找到。
[0144] 一般，組合物可單獨給藥，或者與其它治療劑組合給藥，其根據(jù)待治療的病情可W 同時給藥也可W相繼給藥。
[0145] 方法 陽14引給藥旅巧
[0147] 本發(fā)明的組合物一般直接給藥至哺乳動物。直接遞送可W通過腸道外注射進(jìn)行 (例如，皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或給藥至組織間隙），或黏膜給藥，例如通過直 腸、口服（例如，藥片、噴霧）、陰道、局部、經(jīng)皮（參見例如，W099/27961)或透過皮膚（參 見例如，W002/074244和W002/064162)、吸入、鼻內(nèi)（參見例如，W003/028760)、眼睛、耳朵、 肺部或其它黏膜給藥。組合物也可W通過直接轉(zhuǎn)移到皮膚表面進(jìn)行局部用藥。局部用藥可 W不用任何設(shè)備進(jìn)行，或通過使用細(xì)帶或類似細(xì)帶的設(shè)備直接接觸裸露的皮膚來進(jìn)行（參 見，例如，美國專利號6, 348, 450)。
[0148] 在一些方面，給藥的方式是腸道外、黏膜、或黏膜和腸道外免疫的組合。在其它方 面，給藥的方式是腸道外、黏膜、或間隔1-3周共1-2次的黏膜和腸道外免疫的組合。在相 關(guān)的方面，給藥途徑包括但不限于鼻內(nèi)給藥。
[0149] 給藥流括巧劑量
[0150] 本發(fā)明可包括對哺乳動物給藥突變的博代氏桿菌菌株W誘發(fā)能夠攻擊例如H3N2 的流感病毒的免疫應(yīng)答（例如，TH1免疫應(yīng)答）。本發(fā)明的突變博代氏桿菌菌株的例子如上 所述。一般，該突變的博代氏桿菌菌株的給藥是通過針對流感病毒的保護(hù)性免疫，用于治療 或預(yù)防哺乳動物例如人的流感病毒感染。在一些方面，該突變的博代氏桿菌在流感病毒感 染前給藥W預(yù)防流感病毒感染。一般，突變的博代氏桿菌株菌株在流感病毒感染前約少于 1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或更多周被給藥至哺乳動物。 陽151] 在一個方面，治療或預(yù)防流感病毒感染的方法包括對有需求的受試者施用單一劑 量的本發(fā)明的組合物，例如，BPZE1。在相關(guān)方面，給藥步驟通過黏膜進(jìn)行，例如，鼻內(nèi)。 陽152] 在其它方面，本發(fā)明的組合物給藥多于一次，例如，兩次。用藥的次數(shù)可根據(jù)需要 進(jìn)行變化，例如對哺乳動物給藥的次數(shù)可W是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多次。在一個 方面，治療或預(yù)防流感病毒感染的方法包括對有需求的受試者施用本發(fā)明的第一免疫原性 組合物（含有例如，BPZEl)，繼而施用第二免疫原性組合物（含有例如，BPZEl)。一般，每 個劑量的組合物之間的時間范圍可W是約1-6天，或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或更多周。在相關(guān)方面，每個劑量之間的時間范圍是約3 周。在其它方面，可化施用免疫加強(qiáng)方法，其中本發(fā)明的組合物可先用于"誘發(fā)（priming)" 步驟，然后將本發(fā)明的組合物用于"加強(qiáng)化oosting)"步驟。 陽153]組合物一般可被用于誘發(fā)全身和/或黏膜免疫，例如誘發(fā)增強(qiáng)性的全身和/或黏 膜免疫。例如，可W通過所誘導(dǎo)的血清IgG和/或腸IgA免疫應(yīng)答來表征免疫應(yīng)答。一般， 對流感病毒感染的保護(hù)水平可W超過50%，例如，60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多。在一個方面，保護(hù)水平可達(dá)100%。在其它方 面，保護(hù)水平低于50 %，例如，20 %。在其它方面，對每個劑量中的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié)W在哺 乳動物中得到有效的免疫應(yīng)答。每個劑量中的細(xì)菌數(shù)量或C化可W是約1、10、100、1000、 10000、100000、1000000、5x1〇6、或更多或所述各劑量之間的任何劑量。
[0154]在其它方面本發(fā)明還可包括組合物與其它試劑的共同給藥。一般各種組合物/試 劑可W按照任何順序進(jìn)行遞送。從而，在遞送多種不同的組合物或試劑的各個方面，該突變 的博代氏桿菌菌株不需要都在例如藥物、siRNA、miRNA、免疫原性膚或能夠影響流感病毒感 染的小分子等試劑前進(jìn)行給藥。其它試劑的例子包括神經(jīng)氨酸巧酶抑制劑和M2抑制劑（金 剛燒）。例如，誘發(fā)步驟可包括遞送一種或多種試劑，加強(qiáng)步驟可包括遞送一種或多種突變 的博代氏桿菌菌株。在其它方面，突變的博代氏桿菌菌株的多次給藥可W在試劑的多次給 藥后進(jìn)行?？蒞按照任何順序進(jìn)行給藥。從而，在此描述的一種或多種突變的博代氏桿菌菌 株和一種或多種試劑可W按照任何順序W及任何本領(lǐng)域已知的給藥途徑來進(jìn)行共同給藥， 例如，W誘發(fā)免疫反應(yīng)。
[0155]在本發(fā)明中，劑量治療可按照單劑量用藥法或多劑量用藥法。例如，多劑量可被用 于誘發(fā)免疫計劃和/或加強(qiáng)免疫計劃。在多劑量用藥計劃中，各種藥劑可W通過相同或不 同的途徑進(jìn)行給藥，例如，腸道外誘發(fā)和黏膜加強(qiáng)、黏膜誘發(fā)和腸道外加強(qiáng)，等等。在其它方 面，劑量控制可W增強(qiáng)抗體應(yīng)答的活性，導(dǎo)致具有中和性質(zhì)的抗體。體外中和分析可用于 檢測中和抗體（參見例如Asanaka等人，JVirology102 :10327,2005;Wobus等人，PL0S Biology2 ;e432 ;和Dubekti等人，JMedicalVirology66 :400)。 陽15d用于測定免巧麻答效力或存在的測試 陽157]評價本發(fā)明的組合物給藥后的治療效果的一種方法設(shè)及對感染進(jìn)行監(jiān)控。評價本 發(fā)明的組合物給藥后的預(yù)防效果的一種方法設(shè)及對組合物中的抗原的免疫應(yīng)答進(jìn)行監(jiān)控。 另一種評價本發(fā)明的組合物的免疫原性的方法是分離蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物W通過免疫 印跡篩選患者血清或黏膜分泌物。蛋白質(zhì)和患者血清之間發(fā)生陽性反應(yīng)則表明患者之前已 經(jīng)對組合物產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。
[0158]檢驗本發(fā)明的組合物給藥后的治療效果的另一種方法設(shè)及對感染進(jìn)行監(jiān)控。檢驗 本發(fā)明的組合物給藥后的預(yù)防效果的一種方法設(shè)及對組合物中的抗原的全身性（例如監(jiān) 控IgGl和I泌2a的生產(chǎn)水平）和黏膜性（例如監(jiān)控IgA的生產(chǎn)水平）的免疫應(yīng)答進(jìn)行監(jiān) 控。一般，在免疫后攻擊前檢測血清特異性抗體應(yīng)答，而在免疫后和攻擊后檢測黏膜特異性 抗體應(yīng)答。本發(fā)明組合物的免疫原性可W在對例如人的宿主給藥前在體外和體內(nèi)動物模型 中進(jìn)行評價。
[0159] 本發(fā)明的組合物的功效也可W通過用組合物攻擊例如小鼠的感染動物模型進(jìn)行 體內(nèi)檢測。組合物可W衍生自與攻擊菌株相同的菌株，或可W不衍生自與攻擊菌株相同的 菌株。體內(nèi)功效模型可包括但不限于：（i)使用人菌株的鼠類感染模型；（ii)鼠類疾病模 型，其為使用小鼠適應(yīng)性菌株的鼠類模型，例如對小鼠具有特殊毒性的菌株；和（iii)使用 人分離物的靈長類模型。
[0160] 本發(fā)明誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可W是Thl免疫應(yīng)答和TH2應(yīng)答的一種或兩種。免疫應(yīng)答 可W是改進(jìn)的或增強(qiáng)的或改變的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可W是全身性和黏膜性免疫應(yīng)答的一 種或兩種。例如，免疫應(yīng)答可W是增強(qiáng)的全身和/或黏膜應(yīng)答。增強(qiáng)的全身和/或黏膜免 疫反映在增強(qiáng)的TH1和/或TH2免疫應(yīng)答中。例如，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答可包括IgGl和/或 IgG2a和/或IgA的產(chǎn)量的增加。在另一方面黏膜免疫應(yīng)答可W是TH2免疫應(yīng)答。例如，黏 膜免疫應(yīng)答可包括IgA的產(chǎn)量增加。 陽161] -般，活化的TH2細(xì)胞增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生，從而在響應(yīng)胞外感染方面是有價值的?；?化的T肥細(xì)胞一般能夠分泌一種或多種IL-4、IL-5、比-6、和IL-10。T肥免疫應(yīng)答也能導(dǎo) 致IgGl、I姐、IgA和/或記憶B細(xì)胞的產(chǎn)生W提供未來的保護(hù)?？傊?，T肥免疫應(yīng)答可包括 一種或多種與T肥免疫應(yīng)答相關(guān)的一種或多種細(xì)胞因子（例如IL-4、比-5、IL-6和IL-10) 的增加，或IgGl、I姐、IgA和記憶B細(xì)胞的產(chǎn)量的增加。例如，增強(qiáng)的T肥免疫應(yīng)答可包括 IgGl產(chǎn)量的增加。 陽162] Thl免疫應(yīng)答可包括一種或多種CTL的增加、一種或多種與Thl免疫應(yīng)答相關(guān)的 細(xì)胞因子（例如IL-2JFN-丫和TNF-a)的增加、活化巨隧細(xì)胞的增加、NK活性的增加、或IgG