本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥新型γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其檢測方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一。面粉加水形成面團(tuán)后可產(chǎn)生有彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這一特殊的品質(zhì)特質(zhì)決定了其適于制作面包、糕點等食品。隨著人們生活水平的提高，小麥的育種目標(biāo)不僅只關(guān)注小麥產(chǎn)量的提高，而且加強(qiáng)了對小麥品質(zhì)的改良。小麥獨特的加工品質(zhì)主要與種子的貯藏蛋白有關(guān)，而小麥醇溶蛋白作為貯藏蛋白主要的核心組成，其功能主要決定了面團(tuán)的可塑性。

醇溶蛋白是指溶解于70%乙醇的一種單鏈多態(tài)混合物，根據(jù)其在A-PAGE（pH=3.1）電泳遷移率的不同，可分為α、β、γ、ω四種類型。γ類型醇溶蛋白大小介于30-75kDa之間。γ類型醇溶蛋白一般由5個部分組成：20個氨基酸殘基的信號肽，N末端的非重復(fù)I區(qū)，高變重復(fù)區(qū)II區(qū)，一般包含六個半胱氨酸殘基的非重復(fù)III區(qū)，多聚谷氨酞胺區(qū)IV區(qū)和包含兩個半胱氨酸殘基的C末端非重復(fù)V區(qū)。

醇溶蛋白是小麥面筋蛋白的主要組成成分，占小麥籽粒總蛋白含量的40%-50%，主要影響面團(tuán)的延展性和粘性，是小麥優(yōu)良加工品質(zhì)的關(guān)鍵決定因素。但醇溶蛋白也是一種重要的過敏原，目前一些小麥過敏人群，比如乳糜瀉和小麥依賴運(yùn)動激發(fā)過敏癥，都對醇溶蛋白產(chǎn)生一定的過敏癥狀。

功能標(biāo)記是作物分子育種的理想標(biāo)記。它的開發(fā)是以被克隆的基因序列為前提, 結(jié)合標(biāo)記與性狀的相關(guān)性分析，確定標(biāo)記的有效性，進(jìn)而應(yīng)用于分子輔助育種。目前，國內(nèi)外已開發(fā)出60多個小麥分子標(biāo)記，其中多數(shù)為功能標(biāo)記，涉及的性狀為簡單遺傳的性狀如抗銹病、抗線蟲、抗吸漿蟲以及加工品質(zhì)等，先后選育成20個新品種。但對加工品質(zhì)和人類健康緊密相關(guān)的醇溶蛋白功能標(biāo)記研究報道較少。因此，對一些特定類型醇溶蛋白進(jìn)行鑒定、克隆、表達(dá)分析以及其功能標(biāo)記的研發(fā)尤為迫切，相關(guān)研究結(jié)果可為小麥加工和食品安全提供重要的保障。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種小麥新型γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其檢測鑒定方法，基于該檢測方法，可較為快速的檢測γ-醇溶蛋白TaWG05在小麥品種或面粉制品中的存在情況，從而為過敏人群的健康提供指導(dǎo)，同時也為小麥品種的改良提供理論基礎(chǔ)。

首先就小麥新型γ-醇溶蛋白TaWG05基因的發(fā)現(xiàn)過程簡要介紹如下。發(fā)明人前期在對小麥品種鄭麥366和鄭麥004種子不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，并通過熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)若干醇溶蛋白基因表達(dá)量在品種間存在差異差別，結(jié)合測序分析，最終確定編號為TaWG05的γ-醇溶蛋白基因在鄭麥004中正常表達(dá)，而在強(qiáng)筋品種鄭麥366中表達(dá)量最低，因此重點加強(qiáng)了對該基因的分析和研究。

為獲得TaWG05基因的全長cDNA序列，發(fā)明人采用了RACE技術(shù)進(jìn)行該基因的克隆，具體過程為：

（1）依據(jù)對TaWG05基因的測序結(jié)果，分別設(shè)計第一輪PCR引物與第二輪PCR引物，采用巢式PCR擴(kuò)增策略，以鄭麥004的cDNA為模板，利用高保真酶Phusion 分別進(jìn)行3’端和5’末端序列擴(kuò)增，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進(jìn)行測序和序列的拼接分析，并進(jìn)一步推測其可能的末端側(cè)翼序列；

（2）在根據(jù)測序結(jié)果和上述RACE擴(kuò)增結(jié)果，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站進(jìn)行同源序列比對，根據(jù)比對到的序列的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計簡并引物，分別以鄭麥004基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得26條核苷酸序列，克隆測序后的片段再與RACE擴(kuò)增的3’端和5’端序列進(jìn)行拼接，最終獲得的基因命名為γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因，堿基序列具體如SEQ ID No.1所示；而γ-醇溶蛋白TaWG05的氨基酸序列具體如SEQ ID No.2所示。

進(jìn)一步地，發(fā)明人對所獲得的γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，具體過程及結(jié)論簡要介紹如下：

（1）通過Signal 4.1 server軟件分析，預(yù)測表明，γ-醇溶蛋白TaWG05含有21個氨基酸的信號肽序列，是一種跨膜蛋白，且含有8個保守的半胱氨酸殘基S，在II重復(fù)區(qū)具有典型的γ-醇溶蛋白基本的結(jié)構(gòu)F/L/PP(QQ_)2-3；

（2）利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合γ-醇溶蛋白TaWG05的結(jié)構(gòu)分析，確定TaWG05基因是一種多基因家族的γ類醇溶蛋白。

基于上述研究結(jié)果，本申請的主要技術(shù)方案主要如下。

γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。

γ-醇溶蛋白TaWG05，其氨基酸序列具體如SEQ ID No.2所示。

針對γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因的克隆方法，采用簡并引物法設(shè)計引物，并進(jìn)行克隆獲得。

簡并引物法，一種獲得序列未完全清楚的核酸的引物設(shè)計方案，其特點為所設(shè)計的引物序列某位置的核苷酸可以分別是兩個或兩個以上不同的堿基，所合成的引物是該位置上不同序列的混合物。以小麥鄭麥004種子cDNA為模板，利用如下簡并引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，簡并引物對為：

引物1：5’-ATGAAGATCT(C)TCA(T)TGGTCTTTGCC(T)-3’，

引物2：5’-TCAT(C)TGTCCACCA(G)TTG(C)TAGGCG-3’；

需要解釋的是，以上述簡并引物序列進(jìn)行克隆表達(dá)時，以引物1或引物2進(jìn)行克隆表達(dá)，而所述引物1或引物2為括號中堿基替換前一個堿基后的不同引物序列的混合物。

另外，基于上述結(jié)果，針對γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因可開發(fā)針對性的檢測標(biāo)記，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，可較為便捷的檢測γ-醇溶蛋白TaWG05在不同小麥品種中的表達(dá)情況，以及為醇溶蛋白過敏人群的小麥?zhǔn)称愤x擇提供健康指導(dǎo)。具體而言：

一對檢測γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因用檢測標(biāo)記引物對，利用該引物對，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，可以有效的標(biāo)識和檢測該基因在小麥品種中的表達(dá)情況，所述引物對具體如下：

引物3： 5’-TCTTCTTGGTCTTTGCCCTCC-3’，

引物4： 5’- TTGGGTAAGTGGTTGCTGCT-3’。

利用所述檢測標(biāo)記引物對檢測小麥中γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因的鑒定方法，具體包括如下步驟：

（1）提取待檢小麥種子RNA，

（2）以Actin基因作為內(nèi)參基因，利用引物對（引物3和引物4）進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，

（3）采用2 ^-△△CT方法檢測目標(biāo)基因的相對表達(dá)量情況，如果目標(biāo)基因TaWG05基因有表達(dá)，那么表明該品種的小麥種子中含有γ-醇溶蛋白TaWG05，如果沒有表達(dá)，那么表明該品種的小麥種子中不含有γ-醇溶蛋白TaWG05。

需要說明的是，由于語言習(xí)慣及其他原因，文中的TaWG05基因、醇溶蛋白TaWG05基因等均指γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因，TaWG05蛋白、醇溶蛋白TaWG05等均指γ-醇溶蛋白TaWG05，相關(guān)表述盡管不夠統(tǒng)一和規(guī)范，但并不影響本領(lǐng)域技術(shù)人員對本申請技術(shù)方案的理解。

本發(fā)明在對γ-醇溶蛋白TaWG05深入研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加強(qiáng)了對該基因的開發(fā)利用。通過特定引物對設(shè)計，可檢測、判定其他小麥品種中是否特定表達(dá)有γ-醇溶蛋白TaWG05。對部分小麥品種檢測結(jié)果表明：豫麥50、云麥51、矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、鄭麥004、周麥13中等小麥品種中該基因有表達(dá)，進(jìn)而可以認(rèn)為這些小麥品種對應(yīng)面粉中含有γ-醇溶蛋白TaWG05；而在師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥366、鄭麥9023中檢測到該基因無表達(dá)，表明這些小麥品種對應(yīng)面粉中不含γ-醇溶蛋白TaWG05?；诖藱z測結(jié)果，可為醇溶蛋白過敏人群的小麥?zhǔn)称愤x擇提供了重要的安全保障，同時也為小麥品種改良提供了較好的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)；同時也為其他過敏原蛋白的檢測提供了較好的借鑒和參考。

附圖說明

圖1為 TaWG05基因cDNA末端快速擴(kuò)增電泳圖，其中A圖: TaWG05基因3’端兩輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；B圖：TaWG05基因5’端兩輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中1代表：第一輪PCR擴(kuò)增；2代表：第二輪PCR擴(kuò)增；M為DNA Marker；

圖2 為TaWG05基因在鄭麥004基因組DNA和cDNA中的擴(kuò)增序列；1、2、3：分別是利用鄭麥004基因組DNA擴(kuò)增TaWG05基因；4、5、6：分別是利用鄭麥004的成熟種子 cDNA擴(kuò)增TaWG05基因；

圖3 為TaWG05全長cDNA序列與推導(dǎo)的氨基酸序列分析圖；

圖4為γ-醇溶蛋白TaWG05結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5 為TaWG05多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析圖；利用MEGA6.0軟件對TaWG05多基因序列與NCBI數(shù)據(jù)公布的醇溶蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；共分為兩大類2類分別以I、II表示，TaWG05多基因?qū)儆讵毩⒌腎I大類，表明其為新型的γ-醇溶蛋白；

圖6為TaWG05基因在不同類型品種籽粒中表達(dá)量分析；分別提取師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥366、鄭麥9023、矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、鄭麥004、周麥13等不同品種成熟的種子RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在不同小麥品種類型中，利用檢測標(biāo)記進(jìn)行檢測；Actin作為內(nèi)標(biāo)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中部分實驗背景情況簡要介紹如下。

生物材料：

師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥366、鄭麥9023、矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、鄭麥004、周麥13等，均為商品化小麥品種；

大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自北京全式金公司；

主要試劑：

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回試劑盒、RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；

5'-Full RACE Kit with TAP試劑盒、DNA分子量標(biāo)記、PCR mix、T4連接酶等購自TaKaRa 公司；

高保真酶Phusion、PMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自Fermentas公司；

實時定量熒光PCR（qPCR）試劑盒購置于TOYOBO公司；

主要實驗設(shè)備：

PCR儀，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

實施例1

本實施例首先就TaWG05基因的獲得過程簡要介紹如下。

（1）設(shè)計引物

根據(jù)TaWG05基因的測序結(jié)果，利用primer 5.0，分別設(shè)計3’和5’的接頭引物與2對特異性擴(kuò)增引物（如下表所示，表中：31PCR表示3’端第一輪PCR引物，32PCR表示3’端第二輪PCR引物；51PCR表示5’端第一輪PCR引物，52PCR表示5’端第二輪PCR引物）；

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。

RACE用擴(kuò)增引物：

。

另一方面，利用生物信息學(xué)分析TaWG05基因序列，通過National Center for Biotechnology Information(NCBI) 中Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)進(jìn)行同源序列比對，查找同源序列相似度最高的小麥屬（Triticum aestivum）基因序列；進(jìn)而通過ORF Finder網(wǎng)上在線軟件分析同源序列，預(yù)測該基因的ORF區(qū)的長度與編碼方式，最終根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計PCR擴(kuò)增用簡并引物對如下：

引物1：5’-ATGAAGATCT(C)TCA(T)TGGTCTTTGCC(T)-3’，

引物2：5’-TCAT(C)TGTCCACCA(G)TTG(C)TAGGCG-3’；

引物序列中括號里的堿基為可替代堿基

（2）利用RACE技術(shù)，克隆TaWG05基因的側(cè)翼序列

A、提取鄭麥004種子RNA，具體步驟為：

選取鄭麥004成熟小麥籽粒樣品，放入研缽中，加入少量液氮，充分研磨；

按100mg樣品/mL TPI比例加入TPI（試劑盒提供的裂解劑），室溫放置不少于5min使其充分裂解，然后4℃、12000×g離心5min；

小心吸取600μL上清至新的2mLRNase-free離心管中；加入等體積的TPII溶液，顛倒混勻數(shù)次，加入150μL氯仿，再次顛倒混勻，室溫放置5min后，4℃、12000×g離心5min；

吸取上層水相500μL，轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中；加入等體積異丙醇混勻，室溫放置5~10min；4℃、12000×g離心5min，棄上清，RNA沉于管底；

加入1mL、75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃、10000×g離心10min；棄上清，然后室溫晾干或真空干燥5~10min；

最后用30μL RNA溶解液溶解沉淀，即得到小麥鄭麥004的總RNA。

、TaWG05基因3’端cDNA鏈合成，按如下比例配置反應(yīng)體系，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA鏈合成：

。

、TaWG05基因5’端cDNA鏈合成，采用5'-Full RACE Kit with TAP試劑盒，應(yīng)用“去帽法”原理，高特異性地擴(kuò)增 cDNA 的5’末端的全長序列；主要原理如下：

利用試劑盒中的Alkaline Phosphatase 去掉RNA樣品中5’端序列的磷酸基團(tuán)（mRNA中具有特殊的帽子結(jié)構(gòu)，主要通過 Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個磷酸基團(tuán)）；

利用T4 RNA Ligase與5’Adaptor primer進(jìn)行連接反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序如下：30℃、10 min；42℃、1h；70℃再延伸15min，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

、TaWG05基因的3’端cDNA末端序列擴(kuò)增，具體程序為：

第一輪PCR：

20μL反應(yīng)體系設(shè)計如下：

2.5mM dNTP，3.2μL；

10×buffer，2μL；

31F，1μL；

31R，1μL；

LA Taq Polymerase，0.4μL；

cDNA，1μL；

ddH₂O，11.4μL；

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃、30s，55℃、45s，72℃、1.5min，20個循環(huán)；72℃再延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存；

第二輪PCR：

第二輪PCR擴(kuò)增是以第一輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系參考第一輪PCR的反應(yīng)體系設(shè)計即可，僅調(diào)整引物采用32F和32R；

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1.5min，34個循環(huán)，72℃再延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

對第二輪PCR擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1A所示，擴(kuò)增到約400bp左右的DNA片段，1、2點樣孔為實驗的兩次獨立重復(fù)。

、TaWG05基因的5’端cDNA末端序列擴(kuò)增，具體程序為：

第一輪PCR：

50μL反應(yīng)體系設(shè)計如下：

cDNA，4μL；

1×cDNA Dilution Buffer II，7μL；

10×LA PCR Buffer，4μL；

MgCl₂，3μL；

LA Taq Polymerase，0.25μL；

51R，10μM、2μL；

51F，10μM、2μL；

ddH₂O，27.75μL；

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，20個循環(huán)；72℃再延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存；

第二輪PCR：第二輪PCR擴(kuò)增是以第一輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系參考第一輪PCR的反應(yīng)體系設(shè)計即可，僅調(diào)整引物采用52F和52R；PCR反應(yīng)程序參考第一輪PCR程序即可，但反應(yīng)程序中增加10個循環(huán)，以獲得更多的目的條帶的擴(kuò)增。

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1B所示，可以擴(kuò)增到200bp左右的片段，1、2點樣孔為實驗的兩次獨立重復(fù)。

、特異性目標(biāo)DNA片段的回收、純化，具體為：

將步驟E中第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，在紫外燈下切出特異性片段，用DNA凝膠回收試劑盒（參考說明書進(jìn)行操作）回收目標(biāo)片段并進(jìn)行純化。

、將所回收DNA片段與pMD18-T Vector載體進(jìn)行連接，具體為：

將步驟F中所回收目標(biāo)DNA片段與pMD18-T Vector載體用Solution I（T4連接酶和T4連接酶buffer的混合液）進(jìn)行連接，連接時，10μL連接體系設(shè)計如下：

pMD18-T Vector，1μL；

Solution I，5μL；

模板（所回收產(chǎn)物），4μL；

混合均勻后，16℃過夜連接。

、將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行抗性篩選，具體為：

以1:10的比例將步驟G的連接產(chǎn)物加入到E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置10 min；42℃水中熱擊細(xì)胞90 s，迅速放置冰上90 s；

然后加入200 μL 的LB培養(yǎng)液（預(yù)熱至37 ℃），180 r/min、37℃培養(yǎng)45min；

取100μL培養(yǎng)液加到LB/Apm+平板表面放置片刻使之吸附，37℃ 培養(yǎng)過夜；

挑選生長良好的陽性單克隆菌斑，用克隆載體上的通用引物（M13）進(jìn)行菌落PCR檢測，

通用引物（M13）為：

M13-47F：5′- GCCTGCAGGTCGACGAT-3′，

M13-48R：5′- GGGGATCCTCTAGAGAT-3′；

20μL的PCR反應(yīng)檢測體系設(shè)計如下：

10×buffer，2μL；

2.5mM dNTPmix，1.6μL；

M13-47F，0.8μL；

M13-48R，0.8μL；

rTaq DNA Polymerase，0.2μL；

菌液，1μL；

ddH₂O，13.6μL；

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃、30s，55℃、45s，72℃、1.5min，34個循環(huán)；72℃再延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）提取鄭麥004 基因組DNA，采用CTAB法提取小麥鄭麥004基因組DNA，具體步驟為：

取5粒小麥種子，液氮研磨成粉末，加入650μL提前預(yù)熱至65℃的CTAB緩沖液，混勻；放入65℃水中15min左右，進(jìn)行顛倒混勻，放置1小時；

冷卻至室溫后，加入650μL氯仿-異戊醇（24:1）混合液，混勻，12000rpm離心10min重復(fù)此步驟一次；

取新的2.0mL離心管，加入500μL無水乙醇，吸取上述離心后上清500μL，顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置10min；

12000rpm離心10min，小心倒掉上清液，此時DNA沉淀于離心管底部；

加入75%的乙醇1mL，渦旋震蕩以充分洗滌DNA沉淀，然后8000rpm離心2min，倒掉上清，室溫晾干DNA；

加入30μL無DNA酶污染的TE(含2μL/mL RNase)重懸，溶解沉淀，冷藏備用。

（4）TaWG05全長DNA序列及CDS序列擴(kuò)增

分別以鄭麥004基因組DNA（步驟（3）所制備）和cDNA（步驟（2）中提取有總RNA，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書即可制備）為模板，利用步驟（1）中的簡并引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

20μL的PCR反應(yīng)體系設(shè)計如下：

10×buffer，2μL；

2.5mM dNTP，3.2μL；

引物1，1μL；

引物2，1μL；

LA Taq Polymerase，0.4μL；

DNA（或cDNA模板），1μL；

ddH₂O，11.4μL；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃、30s，55℃、1min，72℃、1.5 min，34個循環(huán)；72℃再延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增到約為1000bp的DNA片段，1、2、3泳道：分別是利用鄭麥004基因組DNA擴(kuò)增TaWG05基因；4、5、6泳道：分別是利用鄭麥004的成熟種子 cDNA擴(kuò)增TaWG05基因；

（5）轉(zhuǎn)化，篩選，測序分析，并進(jìn)行序列拼接，具體為：

回收步驟（4）中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并與pMD18-T Vector載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆（相關(guān)操作參考步驟（2）中操作即可），將陽性克隆送生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用DNA STAR Lasergene7進(jìn)行序列拼接分析。

最終測序結(jié)果表明，γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因，其堿基序列如SEQ ID No.1所示。進(jìn)一步分析表明，γ-醇溶蛋白TaWG05的氨基酸序列具體如SEQ ID No.2所示。

依據(jù)測序結(jié)果，利用軟件SignalP4.1 server對γ-醇溶蛋白TaWG05的信號肽序列進(jìn)行了初步分析，結(jié)果如圖4所示，分析可以看出，其信號肽長度約為21bp。

對cDNA結(jié)果分析如圖3所示。結(jié)合PROSITE數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)家族中的同源序列進(jìn)行多重序列比對，檢測其保守型區(qū)域，TaWG05蛋白具有典型的γ-醇溶蛋白結(jié)構(gòu)，包含N端I非重復(fù)區(qū)，II重復(fù)區(qū)F/P/LP(QQ)2-3，且在III非重復(fù)區(qū)、IV多聚谷氨酰胺區(qū)、V非重復(fù)區(qū)含有8個半胱氨酸殘基S，兩兩連接形成4個分子內(nèi)二硫鍵。

利用MEGA6.0軟件采用Bootstrap構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示，與NCBI數(shù)據(jù)公布的醇溶蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，該家族共分為兩大類，2類分別以I、II表示，TaWG05多基因?qū)儆讵毩⒌腎I大類，表明其為新型的γ-醇溶蛋白；

實施例2

在上述實施例1基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)計了一對檢測γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因用檢測標(biāo)記引物對，利用該引物對，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，可以有效的標(biāo)識和檢測該基因在其它小麥品種中是否有所表達(dá)，從而為小麥品種改良和過敏人群過敏原選擇提供保障。具體而言，發(fā)明人所設(shè)計的γ-醇溶蛋白TaWG05編碼基因用檢測標(biāo)記引物對，序列如下：

引物3： 5’-TCTTCTTGGTCTTTGCCCTCC-3’，

引物4： 5’- TTGGGTAAGTGGTTGCTGCT-3’。

發(fā)明人以部分品種小麥種子（鄭麥366、鄭麥004、師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023、藁城8901、豫麥50、云麥51、矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、周麥13）為例，利用Real-time PCR技術(shù)，對這些品種中是否表達(dá)有γ-醇溶蛋白TaWG05進(jìn)行了檢測，相關(guān)實驗簡要介紹如下。

（1）提取小麥種子RNA，具體操作參考實施例1即可。

（2）以Actin基因作為內(nèi)參基因，利用上述檢測標(biāo)記引物對，進(jìn)行Real-time PCR；擴(kuò)增Actin基因時，引物設(shè)計如下：

Actin-L: 5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R: 5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

反應(yīng)程序為：95℃、1 min；95℃、15 s，60℃、50s，39個循環(huán)。

采用2 ^-△△CT方法檢測目標(biāo)基因的相對表達(dá)量情況，每次實驗每個樣本重復(fù)三次。先比較內(nèi)源基因的Ct值的差別（△Ct），再比較目標(biāo)基因的Ct值的差別（△Ct），把得到的兩個△Ct值進(jìn)行相減，得到的結(jié)果算為2的△△Ct方，即是計算的基因相對表達(dá)量值。

結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，在豫麥50、云麥51、矮抗58、焦麥266、豫麥13、鄂麥352、鄭麥004、周麥13中檢測到該基因有表達(dá)，而在藁城8901、師欒02-1、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥366、鄭麥9023中檢測到該基因無表達(dá)。

從上述結(jié)果可以看出，該檢測標(biāo)記引物對可對不同小麥品種中是否表達(dá)有γ-醇溶蛋白TaWG05做出準(zhǔn)確判定，因而可為醇溶蛋白過敏人群的小麥?zhǔn)称愤x擇提供重要的安全保障。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所

<120> 小麥γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其檢測方法

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

atgaagatct tcttggtctt tgccctcctc gttgtatcaa tgatcatcac caccgcgacc 60

gcgcagctcg atcctagcat ccatgtacaa gaaaggccac aacaatcgtt tccgcagcag 120

caaccactta cccaacaaca accattcccg ccgcaagagc cacaacaacc actattccag 180

caacaacaac cgcatccaca tcagtcactt ccccaacaac aacttcccca gcaacattta 240

tttccacagc aaccgccgca acaacaattt ccacagcaga tgccacttcc tcatcaacaa 300

caaatattcc cgcaacaaca aatattcccg caacaacaac aacccccaca acaacaacca 360

ttttaccaat atcaacaacc attaacacaa caaccatacc cgcaagagca accattgcca 420

caacaacaac cttctgtgga ggaaaaccaa caattgaact tgtgcaagga gttcctgctg 480

cagcagtgca acccggagga gaaactatca ttactgcagt cagtgatccc gttcctccga 540

ccaaagacct cgcaacagaa caactgccag ttgaagcggc aacaatgttg tcgacaactt 600

gcacatatca gcgagccgtc ccgatgcccg gccatccaca acattgtgca cgccatcatc 660

atgcaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa 720

catgtggata gaggtttcgt ccagcctcaa ccacaacagt tgggccaggg aatgcccatg 780

cagcctcaac atcaattggg ccagggctta agcctacctc aacaactagc ccagttcaag 840

ttggttaggt tacttgtgat tcagaccttg cctatgttat gcaatgtgca tgtcccatct 900

gattgctaca ccattagtgc accatttggt ggcatcactg cctacaacgg tggacaatga 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 2

Met Lys Ile Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Val Val Ser Met Ile Ile

1 5 10 15

Thr Thr Ala Thr Ala Gln Leu Asp Pro Ser Ile His Val Gln Glu Arg

20 25 30

Pro Gln Gln Ser Phe Pro Gln Gln Gln Pro Leu Thr Gln Gln Gln Pro

35 40 45

Phe Pro Pro Gln Glu Pro Gln Gln Pro Leu Phe Gln Gln Gln Gln Pro

50 55 60

His Pro His Gln Ser Leu Pro Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln His Leu

65 70 75 80

Phe Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met Pro Leu

85 90 95

Pro His Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln

100 105 110

Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Pro Phe Tyr Gln Tyr Gln Gln Pro Leu

115 120 125

Thr Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Glu Gln Pro Leu Pro Gln Gln Gln Pro

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn Gln Gln Leu Asn Leu Cys Lys Glu Phe Leu Leu

145 150 155 160

Gln Gln Cys Asn Pro Glu Glu Lys Leu Ser Leu Leu Gln Ser Val Ile

165 170 175

Pro Phe Leu Arg Pro Lys Thr Ser Gln Gln Asn Asn Cys Gln Leu Lys

180 185 190

Arg Gln Gln Cys Cys Arg Gln Leu Ala His Ile Ser Glu Pro Ser Arg

195 200 205

Cys Pro Ala Ile His Asn Ile Val His Ala Ile Ile Met Gln Gln Gln

210 215 220

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

His Val Asp Arg Gly Phe Val Gln Pro Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln

245 250 255

Gly Met Pro Met Gln Pro Gln His Gln Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu

260 265 270

Pro Gln Gln Leu Ala Gln Phe Lys Leu Val Arg Leu Leu Val Ile Gln

275 280 285

Thr Leu Pro Met Leu Cys Asn Val His Val Pro Ser Asp Cys Tyr Thr

290 295 300

Ile Ser Ala Pro Phe Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gly Gly Gln

305 310 315