本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種神經(jīng)肽Corazonin和其受體基因及在桔小實(shí)蠅特異性控制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桔小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis，Hendel),又名東方實(shí)蠅、黃蒼蠅、果蛆，隸屬雙翅目Diptera，果實(shí)蠅科Tetriphitidae，該蟲具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和入侵?jǐn)U散能力，主要為害柑橘、番石榴、芒果等46個(gè)科250多種果樹、蔬菜和花卉，對(duì)我國的果蔬和花卉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成巨大危害。目前，歐、美、日及東南亞等多個(gè)國家和地區(qū)已經(jīng)將桔小實(shí)蠅列為重要的危險(xiǎn)性檢疫對(duì)象。在桔小實(shí)蠅的防治方面，化學(xué)殺蟲劑的是防治措施的重要組成部分，包括有機(jī)磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯和阿維菌素等，但是化學(xué)防治離我們的環(huán)保要求甚遠(yuǎn)，尤其是害蟲抗藥性的產(chǎn)生、環(huán)境殘留、食品安全隱患等問題嚴(yán)重威脅著人類健康，因此，新型殺蟲劑的研究開發(fā)有待繼續(xù)進(jìn)行。

Corazonin(CZ)是普遍存在于昆蟲體內(nèi)存在的一類相對(duì)保守的神經(jīng)肽，介導(dǎo)Corazonin作用的Corazonin受體是典型的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)。在不同昆蟲中，Corazonin信號(hào)系統(tǒng)具有多種不同的生理功能，如心率加速、體色改變、物質(zhì)代謝增減、發(fā)育與生理節(jié)律調(diào)控、蛻皮延遲、吐絲減少等。在果蠅中,通過RNAi沉默技術(shù)或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Corazonin調(diào)控果蠅對(duì)饑餓、高滲、低氧等環(huán)境脅迫的響應(yīng)。此外，果蠅Corazonin的表達(dá)隨著個(gè)體發(fā)育發(fā)生了位置變化，其表達(dá)具有組織、時(shí)期和性別的特異性，表明Corazonin在果蠅中可能存在較為廣泛的生理作用。而對(duì)煙草天蛾的研究表明，Corazonin receptor對(duì)煙草天蛾的蛻皮行為具有調(diào)控作用，Corazonin是調(diào)控?zé)煵萏於晖懫ば袨榈囊幌盗屑に刂凶钕缺会尫诺募に?，并且注射高劑量的Corazonin會(huì)導(dǎo)致幼蟲蛻皮時(shí)間推遲。當(dāng)前國際新藥研發(fā)進(jìn)入低谷，但是以G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)為靶標(biāo)的新藥研發(fā)卻一枝獨(dú)秀，引領(lǐng)著全球新藥研發(fā)的重大前沿。GPCR是細(xì)胞膜受體中的最大家族，具有7個(gè)特有的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色。目前，昆蟲中以GPCR作為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥鮮有報(bào)道，而在桔小實(shí)蠅中的研究和應(yīng)用更少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin及其受體的基因及擴(kuò)增方法、編碼的蛋白質(zhì)及應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因及其編碼的蛋白質(zhì)，所述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因的擴(kuò)增方法，包括如下步驟：提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用巢式PCR的擴(kuò)增方法，第一輪擴(kuò)增的引物為Corazonin-F1和Corazonin-R1，第二輪擴(kuò)增的引物為Corazonin-F2和Corazonin-R2，所述引物的序列為：

Corazonin-F1：CAAACGGCTTTTTATTAAAAC，

Corazonin-R1：CTACTAAATTCGTGTGGAGTC，

Corazonin-F2：CATCATGTTCAAATTATTCTTC，

Corazonin-R2：GCCATAATCATGTTTTAATGC。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin成熟肽(也稱CorazoninGPCR配體)基因及其編碼的蛋白質(zhì)，所述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin配體的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:12所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因及其編碼的蛋白質(zhì)，所述桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因的擴(kuò)增方法，包括如下步驟：提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用巢式PCR的擴(kuò)增方法，第一輪擴(kuò)增的引物為CorazoninGPCR-F1和CorazoninGPCR-R1，第二輪擴(kuò)增的引物為CorazoninGPCR-F2和CorazoninGPCR-R2，所述引物的序列為：

CorazoninGPCR-F1：ACCTCGAAAAATCACTAAATGG，

CorazoninGPCR-R1：CACATACTCCCCTCCACAGAC，

CorazoninGPCR-F2：CTAAATGGAAGGTGCAAGTGTG，

CorazoninGPCR-R2：CTCGCTTACACATTAGAGATATGC。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種前述的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因及其編碼的蛋白質(zhì)、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin成熟肽基因及其編碼的蛋白質(zhì)、或者桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因及其編碼的蛋白質(zhì)，在實(shí)蠅神經(jīng)調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用，在實(shí)蠅防治上的應(yīng)用，或者在制備實(shí)蠅殺蟲劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor的配體多肽與Corazonin receptor具有很好的結(jié)合能力，證明本發(fā)明提供的配體具有體外活性，提供的配體多肽和編碼該配體多肽的DNA可以用于針對(duì)該GPCR開發(fā)藥物，例如桔小實(shí)蠅神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。按照本發(fā)明中的重組G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白的表達(dá)體系以及受體結(jié)合測(cè)定系統(tǒng)，可以篩選桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin特異性的激動(dòng)劑和拮抗劑(對(duì)模式配體活性有促進(jìn)作用的為激動(dòng)劑，對(duì)模式配體活性起拮抗作用的為拮抗劑)，所獲得的激動(dòng)劑或拮抗劑可以用于桔小實(shí)蠅的防治，在制備實(shí)蠅殺蟲劑方面有潛在的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin成熟肽對(duì)Corazonin受體的活性測(cè)定結(jié)果圖。

圖2為RNA干擾后Corazonin receptor基因的相對(duì)表達(dá)量。

圖3為RNA干擾后幼蟲化蛹時(shí)間及化蛹率統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

主要試劑及生產(chǎn)者：

2×PrimeSTARMax Premix(Takara公司，日本)

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司，中國)

pGEM-T Easy Vector(Promega公司，美國)

DNA連接試劑盒(Takara公司，日本)

Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(Transgen公司，中國)

pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(Invitrogen公司，美國)

酶NotI(NEB公司，美國)

質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN，德國)

DMEM/F-12medium(Gibco公司，美國)

T4DNA連接酶(Takara公司，日本)

水母素Aequorin質(zhì)粒由美國堪薩斯州立大學(xué)提供

ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(Promega公司，美國)

腔腸素Coelanterazine H儲(chǔ)存溶液(Life-technologies公司，美國)

CHO細(xì)胞(西南大學(xué)昆蟲分子生態(tài)研究室保存提供)

本發(fā)明實(shí)施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例一、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin及其受體的開放閱讀框序列的獲得

1、桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin及其受體Corazonin receptor的開放閱讀框序列引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

基于基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法，經(jīng)過對(duì)果蠅神經(jīng)肽Corazonin(Genbank No.NP_524350.1)和果蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor(Genbank No.AF373862.3)反復(fù)比對(duì)及分析，設(shè)計(jì)桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin及其受體的巢氏PCR特異性引物，序列如下：

用RNA提取試劑盒提取桔小實(shí)蠅總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

擴(kuò)增桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin序列：50μL的反應(yīng)體系包含24μL去離子水,20μL 2×PrimeSTAR Max Premix,引物Corazonin-F1和Corazonin-R1各2μL(濃度均為10μM),2μL桔小實(shí)蠅cDNA模板。第一輪PCR擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性：98℃反應(yīng)2min；隨后，98℃變性10s,55℃退火15s,72℃延伸1.5min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。取第一輪PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物2μL作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增引物用Corazonin-F2和Corazonin-R2，50μL的反應(yīng)體系的其余組分與第一輪擴(kuò)增時(shí)相同，第二輪PCR擴(kuò)增條件與第一輪相同。

擴(kuò)增桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin受體序列：50μL的反應(yīng)體系，以及第一、二輪的PCR擴(kuò)增條件與前述擴(kuò)增Corazonin序列時(shí)相同，只需將第一輪的引物換為CorazoninGPCR-F1和CorazoninGPCR-R1，第二輪的引物換為CorazoninGPCR-F2和CorazoninGPCR-R2即可。

2、擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建到T載體上

將前述擴(kuò)增的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin和Corazonin受體產(chǎn)物分別構(gòu)建到T載體上，操作步驟如下：

1)連接：將桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin擴(kuò)增產(chǎn)物或者Corazonin受體擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy Vector上，具體操作見DNA連接試劑盒。

2)轉(zhuǎn)化：在超凈工作臺(tái)將2.5μL步驟1)中的連接產(chǎn)物加入到50μL的Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰上冰浴30min。42℃水浴熱擊65sec，再放入冰浴中5min。加入無氨芐抗性的200μL LB液體培養(yǎng)基，37℃條件下250rpm振蕩培養(yǎng)1h。在已加入氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，將活化好的菌液80μL均勻涂布在上述LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色正圓型的菌斑菌落37℃搖菌培養(yǎng)3-5h，用通用引物M13(上游：GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA，下游：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)進(jìn)行PCR快速鑒定，電泳檢測(cè)出約1000bp左右的條帶，說明連接產(chǎn)物成功構(gòu)建到T載體上，將檢測(cè)出目的條帶的菌液送去測(cè)序，測(cè)序確定序列無誤后，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，保存于-20℃。

通過測(cè)序，得到桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin及其受體的cDNA序列。

桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin的cDNA序列如下(如序列表中SEQ ID NO:9所示)：TACACAAGCAAACGGCTTTTTATTAAAACATAAACATCATGTTCAAATTATTCTTCTCATTGGCTGTCCTCTGCTTCTTGGCCACATGCTTCGGCCAAACGTTTCAATACTCACACGGCTGGACCAGCGGCAAACGAGCGGTGAACACTCATCGTGACAATGATATTGCCGAAATGCTCCAACAAGATGGCGACCGCAAATTGGAAAGATGTCTCATGCAGTTGCAATATTTATTACACAATCCCCTGTCGATCCGTGCCGGCGTTCAAGCCCTGACTCCAGCAAATGGTAATCTATTTGGAAATCGTCATCAATCAAATGAATTGTATGAAGAGCTGAATGCTGCCGAGACGAACGATTATGGAAAGCATTAAAACATGATTATGGCCATAAAATATTAATAAAACGAAGCGACTCCACACGAATTTAGTAGTATATTTAATAGAATATTTGGAACAGCATACATACACATTTACATAATACAGTTATTTATTGTACATATGTATGATTTCGTTAACATATTTTACGAACTACAATTATACTATTATATGCATTTGCAAGTTTAAAAATACTATGATTGTGCATACTTTTACATATATACATGCATACATACCATATGTGTGAAAAATAAAAAAAATCTTGAAAGTAAAAATCTAAAAAACGCAAATATAGCAGAAAGCTAAGTTGAAAAACAAGTAAAGTGTATGTTAGTGTCAAAGAAGGGAGTAAAAAGATGTTTA

神經(jīng)肽Corazonin編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。通過對(duì)神經(jīng)肽序列結(jié)構(gòu)特征(成熟肽的切割位點(diǎn)通常為“Arg”，“Lys”組合；“Gly”為酰胺化位點(diǎn))的分析得出，下劃線部分為桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin配體的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:11所示)，以下為該配體翻譯的多肽序列：

BdCZ：QTFQYSHGWTSa(如序列表中SEQ ID NO:12所示)

注：“a”表示酰胺化。

測(cè)得桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，Corazonin receptor的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示。

實(shí)施例二、基于細(xì)胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)檢測(cè)的方法測(cè)定桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin與其受體Corazonin receptor的結(jié)合能力

1、構(gòu)建桔小實(shí)蠅Corazonin receptor的CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)表達(dá)質(zhì)粒

將實(shí)施例一中回收得到的連接在T載體上的桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin receptor質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，分別經(jīng)NotI單酶切酶切后連接(T4DNA連接酶)，連接后參照實(shí)施例一中的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，菌液陽性鑒定無誤后(用通用引物T7/BGH進(jìn)行PCR檢測(cè)，T7：TAATACGACTCACTATAGGG，BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG)，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，即得到構(gòu)建有Corazonin receptor片段的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。

共轉(zhuǎn)染，按照如下步驟操作：

1)準(zhǔn)備1.5mL無血清培養(yǎng)基DMEM/F-12medium于EP管。

2)在EP管中加入構(gòu)建有Corazonin receptor片段的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和水母素Aequorin質(zhì)粒各7.5μg。

3)在EP管中加入45uL ViaFect轉(zhuǎn)染試劑，使用移液器來回輕柔地混合均勻。

4)室溫靜置15min。

5)將上述轉(zhuǎn)染的混合液體均勻點(diǎn)滴加入事先準(zhǔn)備好的CHO細(xì)胞，過夜培養(yǎng)至少24h。

2、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子：

1)收集細(xì)胞：前述共轉(zhuǎn)染過夜培養(yǎng)結(jié)束后，倒去本來的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入2-3mL胰蛋白酶，3min后，用一次性的洗耳球管吹打細(xì)胞，收集到50mL的離心管中。

2)將離心管在室溫，1000g(2500rpm)條件下離心3min。

3)將上清液轉(zhuǎn)移至避光小瓶中，并加入3mL的無血清培養(yǎng)基并重懸細(xì)胞。

4)在避光小瓶中添加30μL腔腸素Coelanterazine H儲(chǔ)存溶液(500μM)(最終濃度應(yīng)為5μM)。

5)在避光小瓶中進(jìn)行磁力攪拌3h。

6)在避光小瓶中加入27mL無血清培養(yǎng)基，使其最終體積為30mL，并不斷磁力攪拌30min。

7)利用多功能酶標(biāo)儀對(duì)合成的配體多肽與受體的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。

合成的配體多肽對(duì)Corazonin receptor的結(jié)合能力檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，顯示配體BdCZ對(duì)該受體具有激活能力，而對(duì)照BmAKH(多肽序列為：Cys-Glu-Leu-Thr-Phe-Ser-Pro-Asp-Thr-NH2)對(duì)該受體不具有活性。其中BdCZ的EC50值(最大發(fā)光值中濃度)分別為52.5nM。以此確定BdCZ為模式配體。實(shí)施例三、基于RNA干擾方法測(cè)定桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor沉默效率

1)用RNA提取試劑盒提取桔小實(shí)蠅總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以該cDNA為模板，利用含T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃條件下延伸10min。PCR反應(yīng)體系共25μl，包括：濃度為1000ng/μl的cDNA模板0.5μl，濃度為0.15-0.25μM的上、下游引物(CorazoninGPCR-dsF、CorazoninGPCR-dsR)各1μl，PrimeSTAR Max Premix 12.5μl以及去核酸酶水10μl，引物詳細(xì)信息見下表：

注：引物序列中劃線部分表示T7啟動(dòng)子序列

2)將步驟1)中的PCR產(chǎn)物用膠回收純化試劑盒按照說明書純化回收之后作為合成dsRNA的轉(zhuǎn)錄模板，用體外合成RNA試劑盒TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit按照使用說明轉(zhuǎn)錄合成并純化得到桔小實(shí)蠅Corazonin receptor的dsRNA溶液，將dsRNA溶液濃度稀釋到3000ng/μl。dsRNA合成反應(yīng)體系為20μl，其中包括：cDNA模板4μl(約1μg)、5×TranscrptAid Reaction Buffer 4μl、濃度為100mM的ATP/CTP/GTP/ΜTP Mix 8μl、TranscriptAid Enzyme Mix 2μl和DEPC-treated water 2μl；反應(yīng)條件為：37℃孵育4h。

同時(shí)利用上述方法合成并純化得到GFP(綠色熒光蛋白)的dsRNA溶液作為陰性對(duì)照，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)使用的上下游引物序列(GFP-dsF，GFP-dsR)如上表所示。

3)取桔小實(shí)蠅同一批次的7日齡幼蟲進(jìn)行顯微注射。注射時(shí)將蟲體置于手上，輕輕按住，用Nanoject IIAuto_NaIloliter顯微注射儀(Dmmmond)向桔小實(shí)蠅體內(nèi)注射dsRNA，注射位置位于蟲體倒數(shù)第三節(jié)的節(jié)間處，注射量為2μg/頭。注射完畢后，將幼蟲置于溫度27士l℃、相對(duì)濕度75士5％、全黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng)。每組注射45頭幼蟲，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

對(duì)照組設(shè)置：注射與桔小實(shí)蠅沒有同源性的GFP基因作為陰性對(duì)照，檢測(cè)dsRNA的毒性，觀察注射效率以及dsRNA在蟲體內(nèi)的移動(dòng)情況。

4)為了檢測(cè)注射dsRNA后對(duì)靶標(biāo)基因的干擾效果，采用qPCR技術(shù)對(duì)RNAi后的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。在注射PBS、GFP或Corazonin receptor的dsRNA24h后，收集存活的蟲體液氮處理后，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別檢測(cè)基因的表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明Corazonin receptor顯著性降低，結(jié)果如圖2所示，圖為注射PBS和GFP作為對(duì)照情況下的沉默效率檢測(cè)，結(jié)果表明PBS和GFP注射對(duì)基因表達(dá)量沒有顯著性影響，而Corazonin receptor dsRNA(dsCZR)注射組基因表達(dá)量顯著性下調(diào)，表明在RNA干擾過程中，相應(yīng)基因能夠被有效地沉默。

5)注射dsRNA后，使用LelcaMl65c顯微鏡觀察每組幼蟲的生長發(fā)育情況，直到化蛹為止，對(duì)累計(jì)表型率和化蛹時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明注射Corazonin receptor的dsRNA后，幼蟲化蛹時(shí)間顯著性延遲，結(jié)果如圖3所示，注射PBS和GFP作為對(duì)照情況下，RNA干擾后幼蟲化蛹時(shí)間及化蛹率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明PBS和GFP注射對(duì)幼蟲化蛹時(shí)間沒有明顯影響，其幼蟲均能在24h內(nèi)正?；迹悸式咏?00％，而Corazonin receptor dsRNA(dsCZR)注射組幼蟲化蛹顯著性延遲，24h時(shí)間段內(nèi)的化蛹率僅為17％，延遲時(shí)間約為72h。

序列表

<110> 西南大學(xué)

<120> 神經(jīng)肽Corazonin和其受體基因及在桔小實(shí)蠅特異性控制劑中的應(yīng)用

<160> 18

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Corazonin-F1

<400> 1

caaacggctt tttattaaaa c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Corazonin-R1

<400> 2

ctactaaatt cgtgtggagt c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Corazonin-F2

<400> 3

catcatgttc aaattattct tc 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Corazonin-R2

<400> 4

gccataatca tgttttaatg c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-F1

<400> 5

acctcgaaaa atcactaaat gg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-R1

<400> 6

cacatactcc cctccacaga c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-F2

<400> 7

ctaaatggaa ggtgcaagtg tg 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-R2

<400> 8

ctcgcttaca cattagagat atgc 24

<210> 9

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因

<400> 9

tacacaagca aacggctttt tattaaaaca taaacatcat gttcaaatta ttcttctcat 60

tggctgtcct ctgcttcttg gccacatgct tcggccaaac gtttcaatac tcacacggct 120

ggaccagcgg caaacgagcg gtgaacactc atcgtgacaa tgatattgcc gaaatgctcc 180

aacaagatgg cgaccgcaaa ttggaaagat gtctcatgca gttgcaatat ttattacaca 240

atcccctgtc gatccgtgcc ggcgttcaag ccctgactcc agcaaatggt aatctatttg 300

gaaatcgtca tcaatcaaat gaattgtatg aagagctgaa tgctgccgag acgaacgatt 360

atggaaagca ttaaaacatg attatggcca taaaatatta ataaaacgaa gcgactccac 420

acgaatttag tagtatattt aatagaatat ttggaacagc atacatacac atttacataa 480

tacagttatt tattgtacat atgtatgatt tcgttaacat attttacgaa ctacaattat 540

actattatat gcatttgcaa gtttaaaaat actatgattg tgcatacttt tacatatata 600

catgcataca taccatatgt gtgaaaaata aaaaaaatct tgaaagtaaa aatctaaaaa 660

acgcaaatat agcagaaagc taagttgaaa aacaagtaaa gtgtatgtta gtgtcaaaga 720

agggagtaaa aagatgttta 740

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin基因編碼的蛋白質(zhì)

<400> 10

Met Phe Lys Leu Phe Phe Ser Leu Ala Val Leu Cys Phe Leu Ala Thr

1 5 10 15

Cys Phe Gly Gln Thr Phe Gln Tyr Ser His Gly Trp Thr Ser Gly Lys

20 25 30

Arg Ala Val Asn Thr His Arg Asp Asn Asp Ile Ala Glu Met Leu Gln

35 40 45

Gln Asp Gly Asp Arg Lys Leu Glu Arg Cys Leu Met Gln Leu Gln Tyr

50 55 60

Leu Leu His Asn Pro Leu Ser Ile Arg Ala Gly Val Gln Ala Leu Thr

65 70 75 80

Pro Ala Asn Gly Asn Leu Phe Gly Asn Arg His Gln Ser Asn Glu Leu

85 90 95

Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Ala Glu Thr Asn Asp Tyr Gly Lys His

100 105 110

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin配體基因

<400> 11

caaacgtttc aatactcaca cggctggacc agc 33

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽Corazonin配體多肽

<400> 12

Gln Thr Phe Gln Tyr Ser His Gly Trp Thr Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 2008

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因

<400> 13

tacaaattta cctcgaaaaa tcactaaatg gaaggtgcaa gtgtggtggc aacaaccatt 60

ctcaatcctc aagcagccgt gggagcaatg cttgaacatt tcgcagagaa tttaagccac 120

ccacagcagt attacgagag tcatgaaccc catgcacgat tggcggcagc cgcaattgcc 180

acaacaacac taccaaatat agcactgtca cgtttggcgc aagttctcac aataacacaa 240

aatttaacgg ataataccac aatatatcct tatctgccag acacgttaga cacaacactt 300

acaccgtcag caacgagtaa agaagttttc tacactcatg cgccacaatt ctccaccacc 360

acgctgataa aggtctgtgt gctgggtgtg atggcgattt tctcactctt cggcaatatg 420

ctcaccatgt ggaacatcta taagacacgc ttcaagcggc gtagcttgcg caactcttgg 480

aatgccatct attcgttgtt gtttcatcta tcgatcgccg atttgcttgt aactggtttc 540

tgtattatcg gcgaggcggc ctgggcgtac acggtgcaat ggcgtggcgg tgatcttttg 600

tgcaaattct tcaagctctt ccagatgttc agtttatatt tatccactta tgtgatggtg 660

ctaatcggtg tggatcgttg gtttgcggtg aaatttccca tgcgatcgtt atatatgacc 720

aagagatgct atcaatttct gggcattgtc tacatgtctt cgttcatatt gagcatacca 780

cagtttttca tatttcattt atcgcgcggc ccgttcatcg aagacttcca tcaatgcgtg 840

acgcatggca cctacacggc accctggcag gagcagagct acaccacatt cacgctattc 900

agcacatttc tgataccctt ttgtgtgctc accgtcacct acatttccac gttccgggcg 960

atttcacgaa gtgaaaagat atttttgggt ccgcaacagg agccgcacac gagcgccaat 1020

ttaatgcata cgaatcgaca acggctcata cataaggcga aaatgaattc gctgcgactg 1080

tcttttgtga taataattgc atttctcatt tgctgggcac cctactgtac gctcatggtg 1140

ctgctacagt ttgtcgacat cgacgatgcg accagcaaaa gattaattga tggcatattc 1200

ttctttggca tgtccaatag tctggtgaat cctctcatat acggcgcctt ccatctgcac 1260

actataaaga gtaaatcgag cgataaaggc gggaatggtg gctatagtct aaatagagcc 1320

gactcgcagc gtaatccatc catgctaacg gctgttacac aaatcgacgg cagcggacgc 1380

agcacacgcg tcaaccgaca gcccagctat tatcgcgccc aacacaattt cagcaactcc 1440

agcaaggagc aggccagcct gctgcagatg acccccacca ccgccatcgt gcataaattc 1500

aattcgaact ctgaacgcag ttcagtgggt tcatcgccgc aaacctgctc cacaaatttt 1560

acacgcagcg agatgggcga ccacgaacac gagagcggct gcgaagggaa cggtggcggt 1620

ggcgctaagc gcgatgcaaa ttcacacagc accacggtgg tgtatagctt taagaagcca 1680

gccattttgc gcgcacaaag tttcgaggca ttagcaattg cgccgcccaa taatcgtatg 1740

caagcgccga aagctgcgcc acctgtgtcc gagaatggct tccatcggtc ggtgtgtgtg 1800

ttgagcttgg aagattgtaa gatatgcgcc gatgagcata tctctaatgt gtaagcgagt 1860

gtctgtggag gggagtatgt gtgtatgtgg gggatttgca tacaaaatac ttttcgaaaa 1920

agttccttat ttaagtaaca catccggtta tgtgtgcgtg tacataactg cttgtttacg 1980

taagtatata tgtaggtata tatttata 2008

<210> 14

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 桔小實(shí)蠅神經(jīng)肽受體Corazonin receptor基因編碼的蛋白質(zhì)

<400> 14

Met Glu Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Thr Ile Leu Asn Pro Gln Ala

1 5 10 15

Ala Val Gly Ala Met Leu Glu His Phe Ala Glu Asn Leu Ser His Pro

20 25 30

Gln Gln Tyr Tyr Glu Ser His Glu Pro His Ala Arg Leu Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Ile Ala Thr Thr Thr Leu Pro Asn Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala

50 55 60

Gln Val Leu Thr Ile Thr Gln Asn Leu Thr Asp Asn Thr Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Pro Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Asp Thr Thr Leu Thr Pro Ser Ala Thr

85 90 95

Ser Lys Glu Val Phe Tyr Thr His Ala Pro Gln Phe Ser Thr Thr Thr

100 105 110

Leu Ile Lys Val Cys Val Leu Gly Val Met Ala Ile Phe Ser Leu Phe

115 120 125

Gly Asn Met Leu Thr Met Trp Asn Ile Tyr Lys Thr Arg Phe Lys Arg

130 135 140

Arg Ser Leu Arg Asn Ser Trp Asn Ala Ile Tyr Ser Leu Leu Phe His

145 150 155 160

Leu Ser Ile Ala Asp Leu Leu Val Thr Gly Phe Cys Ile Ile Gly Glu

165 170 175

Ala Ala Trp Ala Tyr Thr Val Gln Trp Arg Gly Gly Asp Leu Leu Cys

180 185 190

Lys Phe Phe Lys Leu Phe Gln Met Phe Ser Leu Tyr Leu Ser Thr Tyr

195 200 205

Val Met Val Leu Ile Gly Val Asp Arg Trp Phe Ala Val Lys Phe Pro

210 215 220

Met Arg Ser Leu Tyr Met Thr Lys Arg Cys Tyr Gln Phe Leu Gly Ile

225 230 235 240

Val Tyr Met Ser Ser Phe Ile Leu Ser Ile Pro Gln Phe Phe Ile Phe

245 250 255

His Leu Ser Arg Gly Pro Phe Ile Glu Asp Phe His Gln Cys Val Thr

260 265 270

His Gly Thr Tyr Thr Ala Pro Trp Gln Glu Gln Ser Tyr Thr Thr Phe

275 280 285

Thr Leu Phe Ser Thr Phe Leu Ile Pro Phe Cys Val Leu Thr Val Thr

290 295 300

Tyr Ile Ser Thr Phe Arg Ala Ile Ser Arg Ser Glu Lys Ile Phe Leu

305 310 315 320

Gly Pro Gln Gln Glu Pro His Thr Ser Ala Asn Leu Met His Thr Asn

325 330 335

Arg Gln Arg Leu Ile His Lys Ala Lys Met Asn Ser Leu Arg Leu Ser

340 345 350

Phe Val Ile Ile Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Ala Pro Tyr Cys Thr

355 360 365

Leu Met Val Leu Leu Gln Phe Val Asp Ile Asp Asp Ala Thr Ser Lys

370 375 380

Arg Leu Ile Asp Gly Ile Phe Phe Phe Gly Met Ser Asn Ser Leu Val

385 390 395 400

Asn Pro Leu Ile Tyr Gly Ala Phe His Leu His Thr Ile Lys Ser Lys

405 410 415

Ser Ser Asp Lys Gly Gly Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Asn Arg Ala Asp

420 425 430

Ser Gln Arg Asn Pro Ser Met Leu Thr Ala Val Thr Gln Ile Asp Gly

435 440 445

Ser Gly Arg Ser Thr Arg Val Asn Arg Gln Pro Ser Tyr Tyr Arg Ala

450 455 460

Gln His Asn Phe Ser Asn Ser Ser Lys Glu Gln Ala Ser Leu Leu Gln

465 470 475 480

Met Thr Pro Thr Thr Ala Ile Val His Lys Phe Asn Ser Asn Ser Glu

485 490 495

Arg Ser Ser Val Gly Ser Ser Pro Gln Thr Cys Ser Thr Asn Phe Thr

500 505 510

Arg Ser Glu Met Gly Asp His Glu His Glu Ser Gly Cys Glu Gly Asn

515 520 525

Gly Gly Gly Gly Ala Lys Arg Asp Ala Asn Ser His Ser Thr Thr Val

530 535 540

Val Tyr Ser Phe Lys Lys Pro Ala Ile Leu Arg Ala Gln Ser Phe Glu

545 550 555 560

Ala Leu Ala Ile Ala Pro Pro Asn Asn Arg Met Gln Ala Pro Lys Ala

565 570 575

Ala Pro Pro Val Ser Glu Asn Gly Phe His Arg Ser Val Cys Val Leu

580 585 590

Ser Leu Glu Asp Cys Lys Ile Cys Ala Asp Glu His Ile Ser Asn Val

595 600 605

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-dsF

<400> 15

taatacgact cactataggg ttacacaaat cgacggcagc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CorazoninGPCR-dsR

<400> 16

taatacgact cactataggg gctgtgtgaa tttgcatcgc 40

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-dsF

<400> 17

taatacgact cactataggg cagttcttgt tgaattagat g 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> GFP-dsR

<400> 18

taatacgact cactataggg tttggtttgt ctcccatgat g 41