本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種基于rpa恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和側(cè)流層析試紙相結(jié)合，用于檢測(cè)間日瘧原蟲的引物探針組合、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶、亞熱帶發(fā)展中國(guó)家。盡管經(jīng)過(guò)多年努力，瘧疾流行得到了一定程度的控制，但全球瘧疾形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

2、目前比較常用的瘧疾診斷方法有：以鏡檢法為代表的傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法；以免疫層析試紙(immunochromatographic?trips，ict)為代表的免疫學(xué)診斷方法；以及以pcr為代表的核酸檢測(cè)方法。鏡檢法具有檢出率高，可以區(qū)分蟲種、鑒定蟲密度，價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)專業(yè)技術(shù)要求高，低密度感染容易漏檢等缺點(diǎn)。免疫層析試紙條，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，判斷直觀明確，不依賴專門儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)。目前已有多種瘧疾診斷的免疫試紙條產(chǎn)品問(wèn)世并廣泛在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)使用，如carestart、wondfo、binaxnow等。但這些產(chǎn)品都只能區(qū)分惡性瘧和非惡性瘧，不能區(qū)分其他三種人體瘧原蟲(間日瘧、卵形瘧、三日瘧)，同時(shí)對(duì)于低密度感染的樣品敏感性較低，給基層現(xiàn)場(chǎng)的診斷帶來(lái)了不便，不利于病人的對(duì)癥治療和流行病控制策略的及時(shí)制定和實(shí)施。核酸檢測(cè)近年來(lái)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病原體的檢測(cè)，進(jìn)一步發(fā)展而成的實(shí)時(shí)熒光pcr、巢氏pcr、多重pcr等技術(shù)檢測(cè)，敏感性、特異性高，同時(shí)可以區(qū)分蟲種，但缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)，必須依賴昂貴的儀器，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，不適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

3、近年來(lái)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)的pcr技術(shù)相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使得核酸在恒溫條件下得以擴(kuò)增，擺脫了昂貴的熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)儀器，并且可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目的片段的指數(shù)擴(kuò)增，使在多種非實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。在多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase?polymeraseamplification，rpa)以t4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為原理，可在恒溫條件下(37℃～42℃)實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的快速、特異性擴(kuò)增，且能夠在20min內(nèi)將核酸擴(kuò)增至可檢測(cè)水平，具有高敏感性和特異性。rpa結(jié)合膠體金側(cè)流層析試紙條(lateral?flow?dipstick，lfd)具有敏感特異、操作簡(jiǎn)便、快速和可肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。rpa-lfd目前已用于血吸蟲、巴貝斯蟲、隱孢子蟲、旋毛蟲等多種寄生蟲的檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于rpa恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和側(cè)流層析試紙相結(jié)合的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)間日瘧原蟲的引物探針組合、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，所述的這種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的引物探針組合、檢測(cè)試劑盒要解決現(xiàn)有間日瘧原蟲核酸診斷操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)及成本高昂的技術(shù)問(wèn)題。

2、本發(fā)明提供了一種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的引物、探針組合，該引物、探針組合根據(jù)間日瘧原蟲ssu?rrna基因序列設(shè)計(jì)，上游引物核苷酸序列如seq?id?no：1所示，下游引物核苷酸序列如seq?id?no：2所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no：3所示。

3、進(jìn)一步的，在下游引物5’端修飾biotin，探針的5’端和3’端分別修飾fam、c3spacer，在距離探針3’端15nt的位置修飾dspacer。

4、具體如下所示：

5、上游引物核苷酸序列：5’-tgttgcagttaaaacgctcgt-3’

6、下游引物核苷酸序列：5’-biotin-gctttgaacactctaatttactcaaag-3’

7、探針核苷酸序列：5’-6-fam-atcgatattttaagcaacgcttctagcttaat/dspacer/ccacataa?ctgata-c3?spacer-3’。

8、其中biotin是生物素，fam是熒光素，用來(lái)作為膠體金核酸試條識(shí)別捕獲的探針?lè)肿?。c3?spacer是聚合酶延伸阻斷基團(tuán)，dspacer是取代核苷酸的一種堿基內(nèi)核苷酸類似物，引入到寡核苷酸序列中的間臂修飾，c3?spacer目的是阻斷核酸擴(kuò)增，dspacer是核酸內(nèi)切酶nfo的切割位點(diǎn)。只有當(dāng)探針能夠結(jié)合到擴(kuò)增模板上時(shí)，dspacer位點(diǎn)的thf殘基才會(huì)被nfo酶切割，進(jìn)而繼續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)生兩端分別被fam和biotin修飾的擴(kuò)增產(chǎn)物。

9、本發(fā)明還提供了一種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的試劑盒，包括一個(gè)檢測(cè)rpa擴(kuò)增結(jié)果的側(cè)流層析試紙，所述側(cè)流層析試紙包括一個(gè)樣品墊，所述的樣品墊的一端緊密連接于含有膠體金標(biāo)記探針的膠體金墊的一端，所述的膠體金墊的另外一端與纖維素膜的一端緊密連接，所述的纖維素膜的另外一端緊密連接吸水墊的一端，所述膠體金標(biāo)記探針是由膠體金標(biāo)記的可以與下游引物標(biāo)記的生物素形成受體-配體特異性結(jié)合的鏈霉親和素探針(streptavidin，sa)組成；所述纖維素膜上靠近膠體金探針墊的一端設(shè)置一條檢測(cè)線，由可以與探針標(biāo)記熒光素特異性結(jié)合的抗熒光素抗體組成，在檢測(cè)線和吸水墊之間的纖維素膜上設(shè)置一條質(zhì)控線，所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合所述膠體金標(biāo)記探針抗鏈霉親和素抗體組成。

10、進(jìn)一步的，上述的一種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的試劑盒，包括一個(gè)rpa反應(yīng)系統(tǒng)，rpa反應(yīng)系統(tǒng)由四部分構(gòu)成，

11、1)凍干試劑，包括重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、聚合酶、核酸內(nèi)切酶nfo、dntps、三磷酸腺苷；在所述的rpa反應(yīng)系統(tǒng)中，重組酶的終濃度為200

12、ng/μl、單鏈dna結(jié)合蛋白的終濃度為508ng/μl、聚合酶的終濃度為160ng/μl、核酸內(nèi)切酶nfo的終濃度為50ng/μl、dntps的終濃度為4mm、三磷酸腺苷的終濃度為5mm；

13、2)再水合緩沖液，包括tris緩沖液、磷酸肌酸、肌酸激酶、二硫蘇糖醇、聚乙二醇；在所述的再水合緩沖液中，tris緩沖液的濃度為100mm、磷酸肌酸的濃度為100mm、肌酸激酶的濃度為200ng/μl、二硫蘇糖醇的濃度為10mm、聚乙二醇的濃度為0.1092g/ml；

14、3)反應(yīng)引發(fā)劑醋酸鎂(mgoac)，所述的醋酸鎂的濃度為140mm；

15、4)上述的引物探針組合物。

16、進(jìn)一步的，rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系為：取10μm的上、下游引物各2.1μl、10μm的探針0.6μl、再水合緩沖液29.5μl、醋酸鎂2.5μl、dna模板2μl、無(wú)核酸酶水11.2μl，將上述混合液加入一個(gè)含所述的凍干試劑的擴(kuò)增反應(yīng)管中。

17、本發(fā)明還提供了一種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

18、a.dna提取：利用血液dna提取試劑盒提取患者血樣中的dna；

19、b.rpa擴(kuò)增：利用權(quán)利要求5所述試劑盒對(duì)提取到的dna進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)；rpa擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：將上、下游引物、探針、再水合緩沖液及無(wú)核酸酶水混勻后，加入含有凍干試劑的反應(yīng)管中，待完全溶解后，加入待檢測(cè)dna模板，離心后，將醋酸鎂滴加在反應(yīng)管側(cè)壁，再次離心后，將反應(yīng)管于39℃金屬浴孵育4min后取出反應(yīng)管，上下顛倒混勻3-5次，離心后再置于39℃金屬浴中孵育8-15min；

20、c.lfd檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液滴加在所述側(cè)流層析試紙上進(jìn)行檢測(cè)，

21、根據(jù)試紙檢測(cè)線和質(zhì)控線的條帶顯示情況判斷是否感染間日瘧原蟲。

22、具體的，所述纖維素膜可以是硝酸纖維素膜(nc膜)或醋酸纖維素膜或混合膜；所述膠體金探針墊為玻璃纖維膜或聚酯纖維膜；所述樣品墊可以是玻璃纖維或聚酯纖維或混合纖維；所述吸水墊由吸水材料制備，如吸水紙。

23、具體的，所述纖維素膜寬度控制在20～30mm；所述吸水墊的寬度為20～40mm，所述膠體金探針墊的寬度為5～10mm；所述樣品墊寬度為10～40mm。

24、進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)線上的抗熒光素抗體工作濃度為0.1～2.0mg/ml，噴涂量為0.5～1μl/cm；所說(shuō)的質(zhì)控線兔抗鏈霉親和素抗體工作濃度為0.1～2.0mg/ml，噴涂量為0.5～1μl/cm；膠體金標(biāo)記的鏈霉親和素探針的工作濃度(以蛋白濃度計(jì))為10～60μg/ml，噴涂量為40～50μl/cm。

25、進(jìn)一步的，所述的側(cè)流層析試紙背面設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板，背板材料的選擇是多種多樣的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(pvc)等。

26、本發(fā)明公開了一種基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的引物、探針組合，該組合包含根據(jù)間日瘧原蟲ssu?rrna基因序列設(shè)計(jì)的上游引物、下游引物和探針，探針為3’端阻斷的寡聚核苷酸，非末端位置還含有核酸內(nèi)切酶nfo識(shí)別位點(diǎn)；探針的5’端標(biāo)記第一標(biāo)記物，下游引物的5’端標(biāo)記第二標(biāo)記物，第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物與不同的分子特異性結(jié)合。在本發(fā)明中，兩個(gè)標(biāo)記為分別為生物素(biotin)和熒光素(6-fam)。

27、本發(fā)明在檢測(cè)過(guò)程中，一旦被檢測(cè)樣品中含有間日瘧ssu?rrna模板，就會(huì)在rpa恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)中進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端分別含有生物素與熒光素的標(biāo)記物。

28、將擴(kuò)增產(chǎn)物用本發(fā)明所述側(cè)流層析試紙進(jìn)行檢測(cè)，所述試紙采用膠體金標(biāo)記的鏈霉親和素作為檢測(cè)探針，附著于膠體金探針墊上。檢測(cè)過(guò)程中，復(fù)溶的膠體金標(biāo)記探針可以與擴(kuò)增出的間日瘧ssu?rrna核酸片段上標(biāo)記的生物素進(jìn)行受體-配體特異性結(jié)合，形成復(fù)合物，在毛細(xì)作用動(dòng)力下層析到纖維素膜上。

29、本發(fā)明所述側(cè)流層析試紙將抗熒光素抗體固定在纖維素膜上，形成一條檢測(cè)線。當(dāng)擴(kuò)增出的核酸片段探針復(fù)合物流過(guò)檢測(cè)線時(shí)，固定在纖維素膜上的抗熒光素抗體會(huì)捕獲核酸探針復(fù)合物上標(biāo)記的熒光素，從而形成肉眼可見的沉淀線(色帶)。

30、本發(fā)明將可與檢測(cè)探針特異性結(jié)合的抗體固定在纖維素膜上作為質(zhì)控線。膠體金標(biāo)記探針是鏈霉親和素(streptavidin，sa)，相應(yīng)的質(zhì)控線采用兔抗鏈霉親和素的多克隆抗體。無(wú)論待檢樣品中是否含有間日瘧ssu?rrna的擴(kuò)增產(chǎn)物，本發(fā)明的診斷試條質(zhì)控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測(cè)過(guò)程是否正常和診斷試條是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

31、本發(fā)明的免疫層析試條具有以下優(yōu)點(diǎn)：

32、(1)本發(fā)明基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，對(duì)低密度感染敏感性及特異性高：實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果顯示，本發(fā)明所述基于rpa檢測(cè)間日瘧原蟲的試劑盒的敏感性為

33、100.00％，特異性為100.00％。

34、(2)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)過(guò)程中不需要專門儀器和人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說(shuō)明書即可操作，檢測(cè)時(shí)間短，半小時(shí)左右迅速觀察結(jié)果，很適合現(xiàn)場(chǎng)和基層使用；適合野外快速檢測(cè)。

35、(3)穩(wěn)定性好，易于保存。成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在瘧原蟲診斷和治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。