本發(fā)明提供一種表達人或人源化(例如，人源化)fcgr3a蛋白的非人動物及其使用方法。

背景技術：

1、傳統(tǒng)的藥物研發(fā)通常使用體外篩選方法，然而這些篩選方法無法提供機體環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境、基質細胞、細胞外基質成分和免疫細胞相互作用等)，導致藥物開發(fā)失敗率較高。此外，鑒于人與動物之間的差異，使用常規(guī)實驗動物進行體內藥理試驗獲得的試驗結果可能無法反映真實的疾病狀態(tài)和靶向部位的相互作用，導致許多臨床試驗的結果與動物實驗結果存在顯著差異。

2、因此，開發(fā)適合人抗體篩選和評價的人源化動物模型將顯著提高新藥開發(fā)效率，降低藥物研發(fā)成本。

3、但是，人源化動物模型的構建十分困難，例如非專利文獻：generation?andutility?of?genetically?humanized?mouse?models(scheer?n，snaith?m，wolf?cr，seib1er?j.，drug?discovery?today；18(23-24)：1200-11，2013)公開了任何基因的人源化都帶有一定的風險，即便采用精心設計的策略也無法確保人基因在動物體內的表達及其功能。

技術實現思路

1、本技術提供一種具有人或人源化fcgr3a蛋白的動物模型。該動物模型可以表達人或人源化fcgr3a(如，人源化fcgr3a)蛋白。它可用于fcgr3a基因功能的研究，還可用于fcgr3a信號通路調節(jié)劑(例如，抗fcgr3a抗體、寡核苷酸藥物和/或多肽藥物)的篩選和評估。此外，通過本技術所述方法制備的動物模型可用于藥物篩選、藥效學研究、免疫疾病的治療和人fcgr3a靶位點的疾病治療；該模型還可以用于促進新藥開發(fā)和設計，節(jié)省時間和成本。綜上所述，本發(fā)明為研究fcgr3a蛋白的功能提供了強有力的工具，為篩選相關藥物提供了平臺。

2、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物或其構建方法，所述非人動物的基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或人源化fcγ受體iiia(fcgr3a)蛋白的核苷酸序列。在一些實施例中，所述編碼人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列可操作地連接至至少一條染色體的內源fcgr4基因座的調控元件(如，人或非人動物內源的啟動子、5'utr和/或3'utr)。在一些實施例中，所述編碼人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列的表達通過調控元件調控，所述的調控元件優(yōu)選為人或非人動物內源的調控元件(如，人或非人動物內源的啟動子、5'utr和/或3'utr)。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞外區(qū)、人或人源化的跨膜區(qū)和非人動物的胞質區(qū)。在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白還包含人或非人動物的信號肽。在一些實施例中，所述人或人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?idno：35第1-229位；或包含與seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seqid?no：35第1-229位同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位；或包含與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位氨基酸同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：7或seq?id?no：33；或，包含與seq?id?no：7或seq?id?no：33同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述非人動物包括哺乳動物，如猴子或嚙齒動物。在一些實施例中，所述的嚙齒動物包括小鼠或大鼠。在一些實施例中，所述非人動物是小鼠。在一些實施例中，所述非人動物內源fcgr4蛋白不表達或與野生型動物中fcgr4相比表達水平降低。在一些實施例中，所述非人動物的一個或多個細胞表達人或人源化fcgr3a蛋白。

3、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物或其構建方法，在非人動物內源fcgr4基因座處，用包含人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替換非人動物內源fcgr4基因。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的外顯子1-5的全部或部分被替換。在一些實施例中，被替換的非人動物內源fcgr4基因還包含非人動物內源fcgr4基因的5’utr上游至少50bp連續(xù)核苷酸序列和/或3’utr下游至少50bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，被替換的非人動物內源fcgr4基因包含內源5’utr上游至少6764bp，優(yōu)選的，所述核苷酸序列還包含內源3’utr下游至少872bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，所述非人動物的一個或多個細胞表達人或人源化fcgr3a，所述人或人源化fcgr3a包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)，所述胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)與人fcgr3a胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)一致或同一性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些實施例中，所述胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)與人fcgr3a胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個連續(xù)氨基酸一致。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的部分。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分可以為基因組dna序列、cds或cdna序列。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和/或外顯子6的部分，優(yōu)選的，人fcgr3a基因的外顯子6的部分包含外顯子6的5’端至少5bp連續(xù)核苷酸序列和/或3’端至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，所述編碼人或人源化fcgr3a的序列進一步包含人fcgr3a的5’utr和/或3’utr。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分還包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50bp連續(xù)核苷酸序列和/或3’utr下游至少50bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，所述編碼人或人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人5’utr上游至少4262bp，優(yōu)選的，所述核苷酸序列還包含人3’utr下游至少5724bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50bp連續(xù)核苷酸序列至外顯子6的5’端至少5bp連續(xù)核苷酸序列、外顯子6的3’端至少5bp連續(xù)核苷酸序列至人fcgr3a基因的3’utr下游至少50bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分的核苷酸序列包含或不包含突變，所述的突變例如第661位的t突變?yōu)間，導致編碼的蛋白的氨基酸序列中，f突變?yōu)関。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含編碼人fcgr3a胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)的核苷酸序列。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含編碼非人動物fcgr4胞質區(qū)的核苷酸序列。在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a的核苷酸序列還包含非人動物內源fcgr4基因的部分。在一些實施例中，所述非人動物內源fcgr4基因的部分可以為基因組dna序列、cds或cdna序列。在一些實施例中，所述的非人動物內源fcgr4基因的部分包含非人動物內源fcgr4基因的外顯子5的部分。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分至少包括非人動物編碼胞質區(qū)的核苷酸序列。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列從5’-3’包含：a)第一序列：編碼人fcgr3a胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列(優(yōu)選還包含編碼信號肽的核苷酸序列)；和b)第二序列：編碼非人動物內源fcgr4胞質區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。在一些實施例中，所述第一序列編碼的氨基酸序列與seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位氨基酸序列一致或同一性至少為70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％，所述第二序列編碼的氨基酸序列與seq?id?no：1第225-249位氨基酸序列一致或同一性至少為70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠，或包含與seqid?no：5或seq?id?no.5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述非人動物的基因組中修飾的fcgr3a基因轉錄的mrna包含seq?id?no：6或seq?id?no：34，或包含與seq?id?no：6或seq?idno：34所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列的表達通過調控元件調控，所述的調控元件優(yōu)選為人fcgr3a的調控元件和/或非人動物fcgr4的調控元件(如，啟動子、5'utr和/或3'utr)。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4蛋白不表達或與野生型動物中fcgr4相比表達水平降低。在一些實施例中，所述非人動物基因組中修飾的fcgr3a基因對于內源被替換的基因座為純合或雜合。

4、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動物或其構建方法，所述非人動物包含至少一個編碼人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列的細胞，其中所述人源化fcgr3a蛋白包含與人fcgr3a蛋白至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240、250、251、252、253或254個連續(xù)氨基酸序列一致。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229個連續(xù)氨基酸與人fcgr3a信號肽、胞外區(qū)和跨膜區(qū)的連續(xù)氨基酸序列一致。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白與seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位氨基酸序列一致或同一性至少為70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、21、22、23、24或25個連續(xù)氨基酸與非人動物內源胞質區(qū)的連續(xù)氨基酸序列一致。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白與seqid?no：1第225-249位氨基酸序列一致或同一性至少為70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或99.5％。在一些實施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地連接至人或內源調控元件。在一些實施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可被整合至所述非人動物內源fcgr4基因座。在一些實施例中，所述人或人源化fcgr3a蛋白具有至少一種活性，例如非人動物fcgr4活性和/或人fcgr3a活性。

5、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物的構建方法，所述非人動物的至少一個細胞中，在非人動物內源fcgr4基因座處，用包含人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替換非人動物內源fcgr4基因。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的部分。在一些實施例中，所述的人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和/或外顯子6的部分，優(yōu)選的，人fcgr3a基因的外顯子6的部分包含外顯子6至少5-1441bp，例如5、10、50、100、110、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1253、1300、1350、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1400、1440或1441bp連續(xù)核苷酸。進一步優(yōu)選的，人fcgr3a基因的外顯子6的部分包含外顯子6的5’端至少5-110bp，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105或110bp連續(xù)核苷酸序列，和/或，包含外顯子6的3’端至少5-1253bp，例如5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200或1253bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、4262、5000、6000、7000、8000、9000或10000bp連續(xù)核苷酸序列(優(yōu)選包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少4000-5000bp連續(xù)核苷酸序列)，和/或，人fcgr3a基因的3'utr下游至少50-10000bp例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、5724、6000、7000、8000、9000或10000bp連續(xù)核苷酸序列(優(yōu)選包含人fcgr3a基因的3’utr下游至少5000-6000bp連續(xù)核苷酸序列)。在一些實施例中，所述人fcgr3a基因的部分包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3。在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a的核苷酸序列還包含非人動物內源fcgr4基因的部分。在一些實施例中，所述的非人動物內源fcgr4基因的部分包含非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分；優(yōu)選的，非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分包含至少5-625bp，例如5、10、50、70、75、76、77、78、79、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、610、620或625bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選的，非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分包含編碼非人動物內源fcgr4胞質區(qū)的核苷酸序列。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含seq?idno：7或seq?id?no：33，或包含與seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的外顯子1-5的全部或部分被替換。在一些實施例中，被替換的非人動物內源fcgr4基因還包含非人動物內源fcgr4基因的5’utr上游至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、6500、6700、6764、7000、8000、9000或10000bp連續(xù)核苷酸，和/或，包含非人動物內源fcgr4基因的3’utr下游至少50-1000bp，例如50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、800、872、900、950或1000bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，所述非人動物的內源fcgr4蛋白不表達或與野生型動物中fcgr4相比表達水平降低。在一些實施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地連接至人或非人動物內源調控元件，所述的調控元件如，啟動子、5’utr和/或3’utr。在一些實施例中，所述非人動物為哺乳動物，如，猴子或嚙齒動物。在一些實施例中，所述的嚙齒動物包括小鼠或大鼠。在一些實施例中，所述非人動物還包括其他基因編碼的人或人源化蛋白的核苷酸序列，所述人或人源化蛋白包括nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

6、在一方面，本發(fā)明提供了一種表達人或人源化fcgr3a的基因修飾非人動物細胞的構建方法，所述構建方法包括在非人動物內源fcgr4基因座處，編碼非人動物內源fcgr4區(qū)域的核苷酸序列被人或嵌合fcgr3a的核苷酸序列(如，人源化fcgr3a的核苷酸序列)替換，產生基因修飾的非人動物細胞，所述基因修飾的非人動物細胞表達人或人源化fcgr3a蛋白。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和/或外顯子6的部分，以及非人動物內源fcgr4基因的外顯子5的部分。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含或不包含內含子4和內含子5。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列包含人fcgr3a基因5’utr上游至少50bp連續(xù)核苷酸，和/或，3’utr下游至少50bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，人源化fcgr3a的核苷酸序列編碼的氨基酸序列與seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a的核苷酸序列與seq?id?no：5或seq?m?no：5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，被替換的編碼非人動物內源fcgr4區(qū)域的核苷酸序列包含非人動物內源fcgr4基因外顯子1-5的全部。在一些實施例中，被替換的編碼非人動物內源fcgr4基因還包含非人動物內源5’utr上游至少50bp連續(xù)核苷酸，和/或，非人動物內源3’utr下游至少50bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，所述人或人源化fcgr3a的核苷酸序列可操作地連接至人或非人動物內源的調控元件，所述的調控元件如，啟動子、5’utr和/或3’utr。在一些實施例中，所述非人動物是小鼠。

7、在一方面，本發(fā)明提供了一種測定治療劑治療疾病有效性的方法，所述方法包括：1)向上述非人動物或上述構建方法獲得的非人動物施用治療劑，其中所述非人動物患有疾?。?)確定治療劑對疾病的抑制作用。在一些實施例中，所述治療劑包括抗fcgr3a抗體、寡核苷酸藥物或多肽藥物中的一種或兩種以上。在一些實施例中，所述的治療劑還包括附加治療劑，所述的附加治療劑例如抗pd-1抗體、抗pd-l1抗體或抗ctla4抗體中的一種或兩種以上。在一些實施例中，所述疾病包括腫瘤、炎癥或免疫疾病。在一些實施例中，所述的腫瘤包括實體瘤、消化道癌、黑色素瘤、胃癌、子宮內膜癌、腸癌、淋巴瘤、乳腺癌、內分泌癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或卵巢癌中的一種或兩種以上。在一些實施例中，所述的免疫疾病包括艾滋病、骨質疏松、重癥肌無力、移植物抗宿主病(gvhd)、銀屑病、過敏、哮喘、特異性皮炎、心肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫肝病、疼痛或神經系統(tǒng)疾病中的一種或兩種以上。在一些實施例中，所述的炎癥包括退行性炎癥、滲出性炎癥(例如漿液性炎癥、纖維蛋白炎癥、化膿性炎癥、出血性炎癥、壞死性炎癥、卡他性炎癥)、增殖性炎癥、特異性炎癥(如肺結核、梅毒、麻風病或淋巴肉芽腫)或炎性腸病中的一種或兩種以上。在一些實施例中，所述腫瘤包含一個或多個腫瘤細胞注射到非人動物體內。在一些實施例中，通過測量非人動物的腫瘤體積，判定治療劑對腫瘤的抑制作用。

8、在一方面，本發(fā)明提供了一種測定fcgr3a治療劑毒性的方法，所述方法包括：1)向上述非人動物或上述構建方法獲得的非人動物施用fcgr3a治療劑；2)測定fcgr3a治療劑對非人動物的作用。在一些實施例中，所述測定fcgr3a治療劑對非人動物的作用包括測量非人動物的體重或血液檢查。在一些實施例中，所述的血液檢查包括紅細胞計數、血細胞比容或血紅蛋白含量中的一種或兩種以上。

9、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化fcgr3a蛋白，所述人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的部分和非人動物內源fcgr4蛋白的部分。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的跨膜區(qū)、人fcgr3a蛋白的胞外區(qū)以及非人動物內源fcgr4蛋白的胞質區(qū)。在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no.2或seqid?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位；或包含與seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no.35或seq?id?no：35第1-229位同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位；或包含與seq?id?no：1或seq?idno：1第225-249位氨基酸同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白包含seq?id?no：7或seq?id?no：33，或包含與seqid?no：7或seq?id?no.33所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

10、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化fcgr3a基因，所述人源化fcgr3a基因編碼上述人源化fcgr3a蛋白。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和/或外顯子6的部分，優(yōu)選的，所述人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3。所述人源化fcgr3a基因還包含非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含的核苷酸序列包含seq?id?no：3、4、5、6、8、9、27、28、29、30或34所示核苷酸序列，或包含與seq?id?no：3、4、5、6、8、9、27、28、29、30或34所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。

11、在一方面，本發(fā)明提供了一種細胞、組織或器官，所述細胞、組織或器官表達所述的人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述細胞、組織或器官中包含所述的人源化fcgr3a基因。

12、在一方面，本發(fā)明提供了一種動物模型，所述的動物模型表達所述的人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述的動物模型包含所述的人源化fcgr3a基因。

13、在一方面，本發(fā)明提供了一種所述非人動物、所述構建方法獲得的非人動物、所述的人源化fcgr3a蛋白、所述的人源化fcgr3a基因、所述的細胞、組織或器官或所述動物模型的應用。在一些實施例中，所述應用包含：a)涉及人類細胞的與fcgr3a相關的免疫過程的產品開發(fā)中的應用；b)作為藥理學、免疫學、微生物學和醫(yī)學研究的與fcgr3a相關的模型系統(tǒng)中的應用；c)涉及生產和利用動物實驗疾病模型用于與fcgr3a相關的病原學研究和/或用于開發(fā)診斷策略和/或用于開發(fā)治療策略中的應用；d)在體內研究人fcgr3a信號通路調節(jié)劑的篩選、藥效檢測、評估療效、驗證或評價中的應用；或者，e)研究fcgr3a基因功能，研究針對人fcgr3a靶位點的藥物、藥效，研究與fcgr3a相關疾病治療藥物方面的應用。

14、除非另有定義，本技術使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。本技術描述了用于本發(fā)明的方法和材料；可以使用本領域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實施例僅是示例性的而非限制性的。本技術提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目和其他參考文獻均通過引用整體并入。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。

15、本發(fā)明術語“全部或部分”，“全部”為整體，“部分”為整體中的局部，或者組成整體的部分個體。

16、本發(fā)明術語“基因座”廣義上講代表基因在染色體上所占的位置，狹義上講代表某一基因上的一段dna片段，既可以是一個基因也可以是一個基因的一部分。例如“非人動物內源fcgr4基因座”可以是fcgr4基因的任選一段的dna片段。

17、本發(fā)明術語“外顯子xx的部分”表示連續(xù)或間隔幾個、幾十個、幾百個或幾千個核苷酸序列與全部的外顯子核苷酸序列一致，例如人fcgr3a基因的外顯子6的部分，包括連續(xù)或間隔的5-1441bp，例如5、10、50、100、110、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1253、1300、1350、1360、1361、1362、1363、1364、1365、1400、1440或1441bp連續(xù)核苷酸。在一些實施例中，人fcgr3a基因的外顯子6的部分，包括間隔的幾段核苷酸序列，例如人fcgr3a基因的外顯子6的部分包含外顯子6的5’端至少5-110bp，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105或110bp連續(xù)核苷酸序列，和/或，包含外顯子6的3’端至少5-1253bp，例如5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1?100、1200或1253bp連續(xù)核苷酸序列。

18、本發(fā)明術語“外顯子xx-xxx”或“外顯子xx至xxx”或“外顯子xx至外顯子xxx”是指包含一個外顯子至另一個外顯子以及期間的內含子的全部核苷酸序列，例如外顯子1-5的全部包含外顯子1、內含子1、外顯子2、內含子2、外顯子3、內含子3、外顯子4、內含子4和外顯子5的全部核苷酸序列。

19、本發(fā)明術語“內含子xx”是指兩個外顯子之間的內含子，例如內含子1是指外顯子1和外顯子2之間的內含子。

20、本發(fā)明術語“包含”或“包括”為開放式寫法，含有所描述的指定成分或步驟，以及不會實質上影響的其他指定成分或步驟。當用于描述蛋白質或核苷酸的序列時，所述蛋白質或核苷酸可以是由所述序列組成，或在所述蛋白質或核苷酸的一端或兩端可以具有額外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有與原序列相同或相似的活性。

21、本發(fā)明術語“和/或”包含該術語連接的項目的所有組合，應視為各個組合已單獨地在本技術列出。例如“a和/或b”包括“a”、“b”以及“a和b”，再如“a、b和/或c”包括“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

22、本發(fā)明術語“嚴格條件”是指形成特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件，包括高、中或低嚴格條件，所述的嚴格條件是本領域技術人員公知的，例如可以參見molecularcloning(thirdedition,cold?spring?harbor?laboratory?press,new?york)、current?protocols?in?molecularbiology(edited?by?frederick?m.ausubel?et?al.,1987)and?short?protocols?in?molecular?biology，edausubel,et?a1.通過引用并入本技術，嚴格條件取決于序列。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。

23、本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本技術的其它方面和優(yōu)勢。

24、詳細說明

25、fcgr3a

26、在人的基因組中，fcgr3a基因(ncbi?gene?id：2214)包含6個外顯子，即外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5和外顯子6(圖1)。人fcgr3a?mrna的核苷酸序列為nm_001127595.2，人fcgr3a的氨基酸序列為np_001121067.1(seq?id?no：2)?；谵D錄本nm_001127595.2及其編碼蛋白np_001121067.1的核苷酸序列和氨基酸序列中每個外顯子對應位置如表1所示：

27、表1

28、

29、在小鼠的基因組中，fcgr4基因(ncbi?gene?id：246256)包含5個外顯子，即外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5(圖1)。小鼠fcgr4mrna的核苷酸序列為nm_144559.2，小鼠fcgr4的氨基酸序列為np_653142.2(seq?id?no：1)?；谵D錄本nm_144559.2及其編碼蛋白np_653142.2的核苷酸序列和氨基酸序列中每個外顯子對應位置如表2所示：

30、表2

31、

32、

33、本領域中其他物種的fcgr3a基因、蛋白和基因位點也是已知的。例如，rattusnorvegicus(大鼠)、macaca?mulatta(恒河猴)、canis?lupus?familiaris(狗)，sus?scrofa(豬)。這些基因的相關信息(如，內含子序列、外顯子序列和氨基酸序列)均可以在ncbi中查找到，其全部內容通過引用并入本技術。

34、本發(fā)明提供一種人或嵌合(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列或人或嵌合(如，人源化)fcgr3a氨基酸序列。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的全部或部分核苷酸序列，和/或，編碼非人動物內源fcgr4蛋白的信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和/或胞質區(qū)的全部或部分核苷酸序列被人或人源化fcgr3a基因的核苷酸序列替換。所述“部分”是指至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、650、700、800、900、1000、1200、1250、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、10836、11000、11708、12000、15000、17600、18000或18472bp連續(xù)核苷酸序列，或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、210、220、221、222、223、224、225、230、240、245或249個連續(xù)氨基酸序列。在一些實施例中，所述“部分”與非人動物內源fcgr4基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5，或者，編碼非人動物內源fcgr4蛋白的信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和/或胞質區(qū)的核苷酸序列一致或同一性至少為50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.5％。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和外顯子5的“部分”或“全部”序列(例如，非人動物內源fcgr4基因5'utr上游核苷酸序列至3'utr下游核苷酸序列)被人或人源化fcgr3a基因序列替換(例如，人fcgr3a基因的5'utr上游核苷酸序列至外顯子6的5’端、非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分、人fcgr3a基因的外顯子6的3’端)至3’utr下游核苷酸序列)。

35、在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物，基因修飾的非人動物的基因組包括人或嵌合(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列。在一些實施例中，所述嵌合fcgr3a核苷酸序列編碼的蛋白包含人或人源化的信號肽，人或人源化的胞外區(qū)，人或人源化的跨膜區(qū)，非人動物內源的胞質區(qū)。在一些實施例中，嵌合fcgr3a核苷酸序列編碼的蛋白與seqid?no：1、2或7的全部或部分所示氨基酸序列一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，基因修飾的非人動物基因組包含的核苷酸序列與seq?idno：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99.5％。

36、在一些實施例中，基因修飾的非人動物包含編碼人或人源化fcgr3a蛋白的序列。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白從n端-c端包含，信號肽，胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞質區(qū)。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的信號肽，例如，人或人源化的信號肽包含的序列與seq?id?no：2第1-16位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人動物內源的信號肽，例如，非人動物內源的信號肽包含的序列與seq?id?no：1第1-20位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞外區(qū)，例如，人或人源化的胞外區(qū)包含的序列與seq?id?no：2第17-208位或seq?id?no：35第17-208位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99.5％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人動物內源的胞外區(qū)，例如，非人動物內源的胞外區(qū)包含的序列與seq?id?no：1第21-203位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的跨膜區(qū)，例如，人或人源化的跨膜區(qū)包含的序列與seq?id?no：2第209-229位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人動物內源的跨膜區(qū)，例如，非人動物內源的跨膜區(qū)包含的序列與seq?id?no：1第204-224位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人或人源化的胞質區(qū)，例如，人或人源化的胞質區(qū)包含的序列與seq?id?no：2第230-254位氨基酸一致或同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含非人動物內源的胞質區(qū)。例如，非人動物內源的胞質區(qū)包含的序列與seq?id?no：1第225-249位氨基酸一致同一性至少為70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含人fcgr3a蛋白的信號肽、人fcgr3a蛋白的胞外區(qū)、人fcgr3a蛋白的跨膜區(qū)以及非人動物內源fcgr4蛋白的胞質區(qū)，例如人源化fcgr3a蛋白包含seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位，以及seq?id?no：1第225-249位氨基酸序列。

37、在一些實施例中，編碼非人動物內源fcgr4蛋白(seq?id?no：1)信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)全部或部分的核苷酸序列被替換或失活。在一些實施例中，被編碼人或人源化fcgr3a的核苷酸序列(seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠)替換。在一些實施例中，編碼seq?id?no：1或seq?id?no：1第1-224位氨基酸的核苷酸序列被替換。

38、在一些實施例中，基因修飾的非人動物包含人或人源化fcgr3a基因。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因從5’-3’依次包含：人fcgr3a基因的外顯子1，人fcgr3a基因的外顯子2，人fcgr3a基因的外顯子3，人源化的外顯子4，優(yōu)選的，人源化的外顯子4為人和非人動物嵌合序列，包含人fcgr3a基因和非人動物內源fcgr4的嵌合cds序列的部分。優(yōu)選包含人fcgr3a基因的外顯子4的全部、人fcgr3a基因的外顯子5的全部、人fcgr3a基因的外顯子6的部分和非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分。在一些實施例中，人源化fcgr3a基因還包含人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列和/或3'utr下游核苷酸序列。

39、在一些實施例中，基因修飾的非人動物包含人或人源化fcgr3a基因。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含4個外顯子。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人或人源化5'utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含人或人源化3'utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含非人動物內源fcgr4基因的5’utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因包含非人動物內源fcgr4基因的3’utr。

40、在一些實施例中，基因修飾的非人動物可以表達人fcgr3a和/或嵌合(如，人源化)fcgr3a蛋白。進一步的，所述人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列與seq?id?no：7或seq?idno：：33一致或同一性至少為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

41、在一些實施例中，基因修飾的非人動物在人和/或內源調控元件(所述的調控元件如啟動子、5'utr和/或3'utr)下表達人fcgr3a和/或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a)。非人動物內源fcgr4基因座的替換提供了一種在相同類型細胞中表達人或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a)的非人動物。經基因修飾的非人動物并未出現本領域已知的在某些其它轉基因非人動物中觀察到的潛在疾病。在非人動物中表達的人fcgr3a或嵌合fcgr3a蛋白可以維持一種或多種功能，例如野生型非人動物內源fcgr4蛋白的功能和/或人fcgr3a蛋白的功能。在一些實施例中，基因修飾的非人動物不表達非人動物內源fcgr4蛋白。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的內源fcgr4蛋白表達降低。所述“內源fcgr4蛋白”是指基因修飾前的非人動物(如，小鼠)的內源fcgr4核苷酸序列編碼的fcgr4蛋白。

42、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包含編碼與人fcgr3a蛋白(seqid?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位)和/或非人動物內源fcgr4蛋白(seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位)所示氨基酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸的核苷酸序列。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包含與seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

43、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的一個或多個細胞表達人或嵌合fcgr3a蛋白(如，人源化fcgr3a蛋白)。在一些實施例中，人或人源化fcgr3a蛋白包含與seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位所示的氨基酸序列至少50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240、250、251、252、253或254個連續(xù)的氨基酸序列一致。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包含與seq?idno：1或seq?id?no：1第225-249位所示的氨基酸序列至少20、25、50、100、200、210、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、240或249個連續(xù)的氨基酸序列一致。

44、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組中，人源化fcgr3a基因對于內源被修飾基因座是雜合的或者是純合的。

45、在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因組包含人fcgr3a基因的5'utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因組包含內源的(如，小鼠)5'utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因組包含人fcgr3a基因的3'utr。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因組包含內源的(如，小鼠)3'utr。在適當的情況下，基于人和非人動物序列的相似性，可以合理地推測非人動物和人的基因受到相似的調控。如本發(fā)明所述，基因修飾的非人動物的基因組中的人源化fcgr3a，包含非人動物內源fcgr4基因座的替換，該替換保留人源調控元件，并包含人源化fcgr3a編碼序列?；蛐揎椀碾s合子非人動物或純合子非人動物中的人源化fcgr3a的表達是完全正常的。

46、在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物，基因修飾的非人動物基因組包含非人動物內源fcgr4基因的缺失，其中非人動物內源fcgr4基因的缺失包含外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5，或內源fcgr4基因座的部分。

47、在一些實施例中，所述非人動物內源fcgr4基因的缺失進一步包含一個或多個內含子或內含子的部分，所述內含子選自非人動物內源fcgr4基因內含子1、內含子2、內含子3和/或內含子4。

48、在一些實施例中，本發(fā)明提供一種人源化fcgr3a基因組dna序列，提供了一個表達人源化fcgr3a蛋白的氨基酸序列的構建體；或一種包含所述構建體的細胞；或一種包含所述細胞的組織或器官。

49、在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種嵌合的(如，人源化)fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列。在一些實施例中，所述嵌合的fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列與非人動物內源fcgr4mrna(如，nm_144559.2)、非人動物內源fcgr4氨基酸序列(如，np_653142.2，seqid?no：1)，或其部分(如，外顯子5的部分)序列一致或同一性至少為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。在一些實施例中，所述嵌合的fcgr3a核苷酸序列和/或氨基酸序列與人fcgr3amrna序列(如，nm_001127595.2)、人fcgr3a氨基酸序列(如，np_001121067.1，seq?id?no：2)，或其部分(如，5'utr上游核苷酸序列至外顯子6的5’端，外顯子6的3’端至3’utr下游核苷酸序列)序列一致或同一性至少為1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。

50、在一些實施例中，編碼非人動物fcgr4(例如小鼠fcgr4，seq?id?no：1)第1-249位氨基酸的核苷酸序列被編碼人fcgr3a(seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位)氨基酸以及編碼非人動物fcgr4(seq?id?no：1第225-249位)氨基酸的嵌合序列的核苷酸序列替換。

51、在一些實施例中，上述任一所述的核苷酸序列與調控元件可操作地連接，所述的調控元件如，人fcgr3a啟動子，非人動物內源fcgr4啟動子，誘導型啟動子或增強子。

52、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸，例如，連續(xù)或非連續(xù)核苷酸序列)不同于非人動物內源fcgr4核苷酸序列的全部或部分(例如，小鼠fcgr4基因轉錄本nm_144559.2的外顯子1的全部至外顯子5的部分)。

53、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸，例如，連續(xù)或非連續(xù)核苷酸序列)與非人動物內源fcgr4核苷酸序列的全部或部分相同(例如，小鼠fcgr4基因轉錄本nm_144559.2的外顯子5的部分)。

54、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸，例如，連續(xù)或非連續(xù)核苷酸序列)不同于人fcgr3a核苷酸序列的全部或部分(例如，人fcgr3a基因轉錄本nm_001127595.2的外顯子6的部分)。

55、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸，例如，連續(xù)或非連續(xù)核苷酸序列)與人fcgr3a核苷酸序列的全部或部分相同(例如，人fcgr3a基因轉錄本nm_001127595.2的5’utr上游核苷酸序列至外顯子6的5’端，以及，外顯子6的3’端至3’utr下游核苷酸序列)。

56、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸殘基，如，連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基)不同于非人動物內源fcgr4蛋白氨基酸序列的全部或部分(例如，非人動物內源fcgr4蛋白序列np_653142.2(seq?id?no：1)第1-224位氨基酸)。

57、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸殘基，例如，連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基)與非人動物內源fcgr4蛋白氨基酸序列的全部或部分相同(例如，非人動物內源fcgr4蛋白序列np_653142.2(seq?id?no：1)第225-249位氨基酸)。

58、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸殘基，例如，連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基)不同于人fcgr3a蛋白氨基酸序列的全部或部分(例如，人fcgr3a蛋白序列np_001121067.1(seq?id?no：2)第230-254位氨基酸)。

59、在一些實施例中，所述嵌合的核苷酸序列編碼的氨基酸序列至少有一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸殘基，例如，連續(xù)或非連續(xù)氨基酸殘基)與人fcgr3a蛋白氨基酸序列的全部或部分相同(例如，人fcgr3a蛋白序列np_001121067.1(seq?id?no：2)第1-229位氨基酸或seq?id?no：35第1-229位)。

60、本發(fā)明還提供一種人源化fcgr3a氨基酸序列，其中所述人源化fcgr3a氨基酸序列包含下列組中的任一種：

61、a)seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列；

62、b)與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列同一性至少為90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

63、c)由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在低嚴格條件或嚴格條件下與編碼seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸的核苷酸序列雜交；

64、d)與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過1個氨基酸；或

65、e)與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示的，包括替換、缺失和/或插入一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。

66、本發(fā)明還提供一種人源化fcgr3a核苷酸(如，dna或rna)序列，其中所述人源化fcgr3a核苷酸序列包含下列組中的任一種：

67、a)如seq?id?no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示的核酸序列或編碼人源化fcgr3a同源氨基酸序列的核酸序列；

68、b)能夠在低嚴格條件或嚴格條件下與seq?id?no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列雜交的核酸序列；

69、c)與seq?id?no：3、4、5、6、8、9、10、11、27、28、29、30或34所示核苷酸序列同一性至少為90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.9％的核酸序列；

70、d)其編碼的氨基酸序列與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no.35第1-229位或seq?id?no：7或seq?id?no：33所示氨基酸序列一致或同一性至少為90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；

71、e)編碼的氨基酸序列與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no.35第1-229位或seq?id?no：7或seqid?no：33所示氨基酸序列差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過1個氨基酸；或

72、f)編碼的氨基酸序列與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位或seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no.35第1-229位或seq?id?no：7或seqid?no：33所示的，包括替換、缺失和/或插入一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。

73、本發(fā)明進一步提供了一種人源化的fcgr3a基因組dna序列。該dna序列由其轉錄得到的mrna逆轉錄獲得，與seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠或seq?id?no：6或seq?id?no：34所示序列同源的dna序列一致或互補。

74、為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較的目的對序列進行比對(例如，為了最佳比對，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入間隙，并且為了比較的目的可以忽略非同源序列)。然后比較相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的一個位置被與第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，則分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是序列共享的相同位置的數量的函數，考慮到間隙的數量和每個間隙的長度，這需要引入以實現兩個序列的最佳比對。例如，序列的比較和兩個序列之間的同一性百分比的確定可以使用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的blossum?62評分矩陣來完成。

75、具有相似物理化學性質的保守殘基的百分比(同源性百分比)，例如亮氨酸和異亮氨酸，也可用于測量序列相似性。本領域已經定義了具有類似物理化學性質的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)的氨基酸，非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側鏈(如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨質、組氨酸)。在許多情況下，同源性百分比高于同一性百分比。

76、本發(fā)明還提供了包含本技術所述核苷酸序列的細胞、組織和非人動物(例如，小鼠)，以及在非人動物內源fcgr4基因座表達人或嵌合(例如，人源化)fcgr3a的細胞、組織和非人動物(如，小鼠)。

77、基因修飾的非人動物

78、本發(fā)明所述“基因修飾的非人動物”是指該非人動物基因組中至少一條染色體具有外源dna的非人動物。在一些實施例中，至少一個或多個細胞，例如，基因修飾的非人動物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的細胞具有外源dna。具有外源dna的細胞可以是各種細胞，例如，體細胞、免疫細胞(例如t細胞、b細胞、nk細胞、抗原呈遞細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)、生殖細胞、囊胚或腫瘤細胞。在一些實施例中，提供了一種基因修飾的非人動物，包含被修飾的內源fcgr4基因座，包含外源序列(如，人源序列)，例如，用一個或多個人序列或人/非人嵌合序列替換一個或多個非人序列，或插入一個或多個人序列或人/非人嵌合序列。非人動物通常能夠通過種系傳播將基因修飾傳遞給后代。

79、本發(fā)明所述“嵌合(x)基因”或“嵌合(x)核酸”是指基因或核酸，其中所述基因或核酸的兩個或多個部分來自不同物種，或者該基因或核酸的至少一部分的核苷酸序列與野生型動物中的核苷酸不同。在一些實施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸的至少一部分核苷酸序列具有兩個或多個不同的物種來源，例如，編碼不同蛋白的序列或編碼兩個或多個不同物種的相同(或同源)蛋白的序列。在一些實施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是指人源化(x)基因或人源化(x)核酸。

80、本發(fā)明所述“嵌合(x)蛋白”或“嵌合(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述多肽或蛋白的兩個或多個部分來自不同物種，或者該蛋白或多肽的至少一部分的氨基酸序列與野生型動物中的氨基酸序列不同。在一些實施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽的至少一部分氨基酸序列具有兩個或多個不同物種來源，例如，不同物種的相同(或同源)蛋白。在一些實施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是指人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽。

81、本發(fā)明所述“人源化(x)蛋白”或“人源化(x)多肽”是指蛋白或多肽，其中所述蛋白或多肽的至少一部分來自人(x)蛋白或人(x)多肽。在一些實施例中，所述蛋白或多肽的至少一部分來自非人動物，在一些實施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人(x)蛋白或人(x)多肽。在一些實施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人/非人動物嵌合(x)蛋白或人/非人動物嵌合(x)多肽。

82、本發(fā)明所述“人源化(x)核酸”或“人源化(x)基因”是指核酸，其中所述核酸的至少一部分來自人。在一些實施例中，所述核酸中的至少一部分來自來源于非人動物。在一些實施例中，人源化(x)核酸或人源化(x)基因是指人源化外顯子，所述人源化外顯子可以是人的外顯子或嵌合外顯子。

83、在一些實施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸的至少一部分來源于人fcgr3a基因。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸的至少一部分來源于非人動物內源fcgr4基因。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸包含編碼人源化fcgr3a蛋白的序列。編碼的人源化fcgr3a蛋白至少具有一種人fcgr3a蛋白或非人動物內源fcgr4蛋白的活性。

84、在一些實施例中，所述嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽的氨基酸序列的至少一個或多個部分來自人fcgr3a蛋白。在一些實施例中，所述人源化fcgr3a蛋白或者人源化fcgr3a多肽的氨基酸序列的至少一個或多個部分來自非人動物內源fcgr4蛋白。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白或人源化fcgr3a多肽是功能性的，或至少具有一種人fcgr3a蛋白或非人動物內源fcgr4蛋白的活性。

85、在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白包括與人fcgr3a蛋白5-254個氨基酸(連續(xù)或非連續(xù))一致的多肽序列。在一些實施例中，多肽序列的長度為5-229、10-229或10-254個，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、229、230、240、250或254氨基酸。

86、在一些實施例中，人源化fcgr3a基因或人源化fcgr3a核酸包括與人fcgr3a基因20-2153bp、20-18965bp或20-14002bp(連續(xù)或非連續(xù))，例如20、50、100、500、1000、2000、2153、3000、4000、5000、6000、7000、8000、8979、9000、10000、11000、12000、13000、13240、13241、13500、13924、14000、14002、15000、16000、17000、18000或18965bp一致的核苷酸序列。

87、在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞外區(qū)是人或人源化fcgr3a的。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白的信號肽是人的或人源化fcgr3a的。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞質區(qū)是人或人源化fcgr3a的。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白的跨膜區(qū)是人的或人源化fcgr3a的。在一些實施例中，人源化fcgr3a蛋白的胞質區(qū)是非人動物內源fcgr4的。

88、在一些實施例中，基因修飾的非人動物包括非人動物內源fcgr4基因位點(基因座)的修飾。在一些實施例中，所述的修飾包含編碼至少一部分成熟fcgr3a蛋白的核苷酸序列(例如，與成熟的人fcgr3a蛋白氨基酸序列同一性至少為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。雖然在本發(fā)明中提供了可包含所述基因修飾的細胞(例如，es細胞、體細胞)，但在許多實施例中，基因修飾的非人動物包括對非人動物內源fcgr4基因位點的修飾。

89、在一些實施例中，基因修飾的非人動物可以在非人動物內源fcgr4基因座表達人fcgr3a和/或嵌合(例如人源化)fcgr3a，其中所述非人動物內源fcgr4基因已被人或人源化fcgr3a的基因和/或編碼人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列或與編碼人fcgr3a序列至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％或99％同一性的核苷酸序列取代或插入。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因座被編碼人或人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列修飾。

90、在一些實施例中，經基因修飾的非人動物可以在人或非人動物內源調控元件(如，啟動子、5'utr和/或3'utr)的控制下，表達人fcgr3a和/或嵌合fcgr3a(例如，人源化fcgr3a)。在非人動物內源fcgr4基因座處進行插入或替換提供了在合適的細胞中表達人fcgr3a或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)并且以不導致在本領域已知的一些其它轉基因非人動物中觀察到的潛在病理的方式獲得的非人動物。在非人動物中表達的人fcgr3a或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)可以在非人動物中維持野生型fcgr4或人fcgr3a的一種或多種功能。此外，在一些實施例中，非人動物不表達內源性fcgr4。在一些實施例中，與野生型動物中的fcgr4表達水平相比，非人動物內源fcgr4表達水平降低。本發(fā)明所用術語“內源fcgr4”是指在任何基因修飾之前由非人動物(例如小鼠)的內源fcgr4核苷酸序列表達的fcgr4蛋白。

91、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包括編碼與seq?id?no：2或seqid?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包含與seq?id?no：5或seq?id?no.5第6786位由g突變?yōu)閠或seq?id?no：6或seq?id?no：34一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包含與nm_001127595.2第1-822位，或其第661位包含突變，優(yōu)選第661位為t或g，和901-2153位一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包含與nm_144559.2第727-804位一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

92、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組可以包括在非人動物內源fcgr4基因座用編碼人或人源化fcgr3a的序列替換編碼非人動物內源fcgr4區(qū)域的序列。在一些實施例中，被替換的序列是非人動物內源fcgr4基因座的任何序列，例如外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、內含子1、內含子2、內含子3、內含子4，或其任何組合。在一些實施例中，被取代的序列在非人動物內源fcgr4基因的調控區(qū)內。在一些實施例中，被替換的序列是非人動物內源fcgr4基因的外顯子1-5的全部。在一些實施例中，被替換的序列還包含非人動物內源fcgr4基因的5'utr上游6764bp和3'utr下游872bp。

93、在一些實施例中，基因修飾的非人動物可以具有一個或多個表達人或嵌合fcgr3a(例如人源化fcgr3a)的細胞，所述人源化fcgr3a從n末端到c末端具有信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質區(qū)。在一些實施例中，信號肽包含與人fcgr3a的信號肽(例如，seq?id?no：2第1-16位的氨基酸)同一性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些實施例中，人源化fcgr3a的信號肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或16個氨基酸(例如，連續(xù)或非連續(xù))的序列與人fcgr3a蛋白的信號肽一致。在一些實施例中，胞外區(qū)包含與人fcgr3a的胞外區(qū)(例如seq?id?no：2第17-208位或seq?id?no：35第17-208位)同一性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些實施例中，人源化fcgr3a的胞外區(qū)具有至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、160、170、180、190、191或192個氨基酸(連續(xù)或非連續(xù))的序列與人fcgr3a胞外區(qū)一致。在一些實施例中，跨膜區(qū)包含與人fcgr3a的跨膜區(qū)(例如，seq?id?no：2第209-229位氨基酸)同一性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些實施例中，人源化fcgr3a的跨膜區(qū)具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個氨基酸(連續(xù)或非連續(xù))與人fcgr3a蛋白跨膜區(qū)一致。在一些實施例中，胞質區(qū)包含與非人動物內源fcgr4的胞質區(qū)(例如，seq?id?no：1第225-249位氨基酸)同一性至少為50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的序列。在一些實施例中，人源化fcgr3a的胞質區(qū)具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸(連續(xù)或非連續(xù))與非人動物內源fcgr4(例如小鼠fcgr4)的胞質區(qū)相同。

94、在一些實施例中，所述的人源化fcgr3a的整個信號肽，整個胞外區(qū)和整個跨膜區(qū)都來源于人fcgr3a序列。

95、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包括：人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和/或外顯子6的部分(優(yōu)選還包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3)；或編碼seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位氨基酸的核苷酸序列，優(yōu)選的，還包含人fcgr3a基因5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列。在一些實施例中，人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列包含至少50-10000bp，例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、4262、5000、6000、7000、8000、9000或10000bp連續(xù)核苷酸序列(優(yōu)選包含人fcgr3a基因的5’utr上游至少4000-5000bp連續(xù)核苷酸序列)。在一些實施例中，人fcgr3a基因的3’utr下游核苷酸序列包含至少50-10000bp例如50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、5724、6000、7000、8000、9000或10000bp連續(xù)核苷酸序列(優(yōu)選包含人fcgr3a基因的3’utr下游至少5000-6000bp連續(xù)核苷酸序列)。

96、在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組包括非人動物內源fcgr4基因(例如小鼠fcgr4)的外顯子5的部分。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分包括至少1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、75、78、80、90、100、150、200、300、400、500、600、620或625bp核苷酸。

97、在一些實施例中，在非人動物內源fcgr4基因座處具有編碼嵌合人/非人fcgr3a多肽的核苷酸序列，所述非人動物的細胞表面上表達功能性的fcgr3a。在一些實施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的人部分可以包含由人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和外顯子6的部分編碼的氨基酸序列。在一些實施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的人部分包含與seq?id?no：2或seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35或seqid?no：35第1-229位一致或同一性至少為80％、85％、90％、95％或99％的序列。在一些實施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的非人動物部分可以包含由非人動物內源fcgr4基因的外顯子5的部分編碼的氨基酸序列。在一些實施例中，嵌合人/非人fcgr3a多肽的非人動物部分包含與seq?id?no：1或seq?id?no：1第225-249位一致或同一性至少為80％、85％、90％、95％或99％的序列。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組中修飾的基因對于內源被替換的基因座為純合或雜合。在一些實施例中，基因修飾的非人動物的基因組中修飾的fcgr3a基因對于內源被替換的基因座為純合或雜合。

98、在一些實施例中，人源化fcgr3a基因包含人fcgr3a基因的5’utr。在一些實施例中，人源化fcgr3a基因包含非人動物(例如小鼠)內源fcgr4基因的5'utr。在一些實施例中，人源化fcgr3a基因包含非人動物(例如小鼠)內源fcgr4基因的3'utr。在一些實施例中，人源化fcgr3a基因座包含人fcgr3a基因的3'utr。在適當的情況下，可以合理地假設，基于非人動物和人基因序列的相似性，它們可能受到類似的調節(jié)。如本技術所示，在非人動物(例如小鼠)內源fcgr4基因座包含插入或替換的人源化fcgr3a，其保留非人動物內源或人調控元件，但包含編碼序列的人源化，不表現出病理現象。人源化fcgr3a雜合或純合的兩種基因修飾非人動物都是正常的。

99、在一些實施例中，本發(fā)明還提供了一種基因修飾的非人動物，其基因組包含非人動物內源fcgr4基因的破壞，非人動物內源fcgr4的基因的破壞包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5缺失，或其部分缺失。

100、在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的破壞還包括選自內含子1、內含子2、內含子3、內含子4中的一個或多個內含子的缺失。

101、在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因的破壞包括外顯子1、內含子1、外顯子2、內含子2、外顯子3、內含子3、外顯子4、內含子4和/或外顯子5的至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、650、700、800、900、1000、12001250、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、10836、1?1000、1?1708、12000、15000、17600、18000或18472bp核苷酸的缺失。

102、基因修飾的非人動物可以是各種非人動物，例如，小鼠、大鼠、兔子、豬、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長類動物(例如，狨猴、恒河猴)。對于不容易獲得合適的可遺傳修飾胚胎干細胞(es)的非人動物，采用其他方法來構建包含遺傳修飾的非人動物。這樣的方法包括，例如，修飾非es細胞基因組(例如，成纖維細胞或誘導多能干細胞)并采用核移植將修飾的基因組轉移到合適的細胞，例如卵母細胞，以及在適當的條件下在非人動物中孕育修飾的細胞(例如，修飾的卵母細胞)以形成胚胎。上述所述構建方法在本領域中是已知的，并且在“a.nagy，et?al.，“manipulating?the?mouse?embryo：alaboratory?manual(third?edition)，”coldspring?harbor?laboratory?press，2006”有所描述，其全部內容通過引用并入本技術。

103、在一個方面，所述非人動物是哺乳動物。在一些實施例中，基因修飾的非人動物是嚙齒動物。嚙齒動物可以選自小鼠、大鼠和倉鼠。在一個實施方式中，所述嚙齒動物選自鼠家族。在一個實施方式中，所述基因修飾的非人動物來自選自麗倉鼠科(例如小鼠樣倉鼠)、倉鼠科(例如倉鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠總科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科(登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼴形鼠科(例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一個特定實施方式中，所述基因修飾的嚙齒動物選自真小鼠或大鼠(鼠總科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一個實施方式中，所述基因修飾的小鼠來自鼠科家族成員。在一個實施方式中，所述非人動物是嚙齒動物。在一個特定實施方式中，所述嚙齒動物選自小鼠和大鼠。在一個實施方式中，所述非人動物是小鼠。

104、在一些實施例中，所述的非人動物可以是免疫缺陷的非人哺乳動物。例如免疫缺陷的嚙齒動物、免疫缺陷的兔子、免疫缺陷的豬、免疫缺陷的猴子等。

105、在一些實施例中，所述非人動物是c57bl品系的小鼠，所述c57bl品系選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl6、c57bl/10、c57bl10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些實施例中，小鼠是選自129/j、129/rej、129/olahsd、129/sv、129/svj、129/re、129/rrj、129/sv-ter/+的129品系。這些小鼠描述于例如festing?et?al.，revisednomenclature?for?strain?129mice，mammalian?genome?10：836(1999)；auerbach?eta1.，establishment?and?chimera?analysis?of129/svev-and?c57bl/6-derived?mouseembryonic?stem?cell?lines(2000)，上述文獻相關內容通過引用整體并入本文。在一些實施例中，遺傳修飾的小鼠是129品系和c57bl/6品系的雜交。在一些實施例中，小鼠是129品系的雜交，或c57bl/6品系的雜交。在一些實施例中，小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些實施例中，小鼠是balb品系和另一品系的雜交。在一些實施例中，小鼠來自雜交系(例如，50％balb/c-50％12954/sv；或50％c57bl/6-50％129)。在一些實施例中，非人動物是嚙齒動物。在一些實施例中，非人動物是具有balb/c、balb/chean、balb/cj、balb/cr1、balb/cwt、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl(c57bl/10cr和c57bl/ola)、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st或cba/h品系的小鼠在一些實施例中，非人動物是大鼠。大鼠可以選自wistar大鼠、lea品系、sprague-dawley品系、fischer品系、f344、f6和dark?agouti。在一些實施例中，大鼠品系是選自wistar、lea、sprague-dawley、fischer、f344、f6和darkagouti的兩種或多種品系的雜交物種。

106、本發(fā)明進一步涉及人源化小鼠的fcgr3a基因組dna序列，通過mrna逆轉錄獲得的dna序列與該dna序列一致或互補；或表達其氨基酸序列的構建體；或包含其構建體的細胞；或包括其細胞的組織或器官。

107、本發(fā)明進一步涉及通過上述構建方法產生的非人哺乳動物。在一些實施例中，其基因組包含人或人源化fcgr3a基因。

108、在一些實施例中，非人哺乳動物是嚙齒動物。在一些實施例中，非人哺乳動物為小鼠。

109、在一些實施例中，非人哺乳動物表達由人源化fcgr3a基因編碼的蛋白。

110、此外，本發(fā)明還提供了一種攜帶腫瘤的非人哺乳動物模型，所述非人哺乳動物模型是通過本技術所述方法獲得的。在一些實施例中，非人哺乳動物是嚙齒動物(如，小鼠)。

111、本發(fā)明還提供了一種來源于非人哺乳動物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動物的細胞或細胞系，或原代細胞培養(yǎng)物，其來源于非人哺乳動物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動物、來源于非人哺乳動物或其后代的組織、器官或其培養(yǎng)物。當其攜帶腫瘤時來源于非人哺乳動物或其后代的腫瘤組織或攜帶腫瘤的非人哺乳動物。

112、本發(fā)明提供了一種通過上述任一構建方法產生的非人哺乳動物。在一些實施例中，提供了非人哺乳動物、基因修飾的非人動物，所述基因修飾的非人動物的基因組包含人或人源化fcgr3a的dna。

113、在一些實施例中，非人哺乳動物包括本技術所述基因構建體(例如，如圖2或圖7所示的基因構建體)。在一些實施例中，提供了一種表達人或人源化fcgr3a蛋白的非人哺乳動物。在一些實施例中，提供了一種特異性表達人或人源化fcgr3a蛋白的細胞、組織或器官。

114、在一些實施例中，基因修飾的非人動物中人或人源化fcgr3a蛋白的表達是可控的。如通過添加特異性誘導物或阻遏物。在一些實施例中，所述特異性誘導物選自四環(huán)素系統(tǒng)(tet-offsystem/tet-on?system)或他莫昔芬系統(tǒng)(tamoxifen?system)。

115、非人哺乳動物可以是本領域已知的任何非人動物，其可用于本技術所述方法中。在一些實施例中，非人哺乳動物嚙齒動物。在一些實施例中，非人哺乳動物是小鼠。

116、對上述描述的非人哺乳動物進行遺傳、分子和行為分析。本發(fā)明提供了一種與相同基因型或其他基因型非人哺乳動物交配產生的后代。

117、本發(fā)明提供了一種來源于非人哺乳動物或其后代的細胞系或原代細胞培養(yǎng)物。例如可以通過以下方法制備基于細胞培養(yǎng)的動物模型。細胞培養(yǎng)物可以通過從非人哺乳動物中分離獲得，或者可以使用相同構建體和用標準細胞轉染技術建立的細胞培養(yǎng)物中獲得細胞。包含編碼人或人源化fcgr3a蛋白的dna序列的遺傳結構的整合可以通過多種方法檢測。

118、有許多分析方法可用于檢測外源性dna，包括核酸水平的方法(包含使用逆轉錄-聚合酶鏈反應(rt-pcr)或southern?blot以及原位雜交)和蛋白水平的方法(包括組織化學分析，免疫印跡分析和體外結合研究))。此外，目的基因的表達水平可以通過本領域技術人員熟知的elsa方法進行量化。許多標準的分析方法可用于完成定量檢測。例如，可以使用rt-pcr和雜交方法檢測轉錄水平，包括rna酶保護分析法，southern?blot，rna斑點雜交分析(rnadot)。免疫組織化學染色、流式細胞術、westernblot也可用于檢測人或人源化fcgr3a蛋白的存在。

119、在一些實施例中，本技術所述的經遺傳修飾的動物(例如，fcgr3a基因人源化純合小鼠)可以在一個或多個細胞中表達人或人源化fcgr3a。

120、載體

121、本發(fā)明提供了一種靶向載體，包括：a)與待改變的轉換區(qū)5’端同源的dna片段(5’同源臂或5’臂)，其選自fcgr4基因的基因組dna，長度為100至10000個核苷酸；b)供體序列；和c)與待改變的轉換區(qū)3’端同源的dna片段(3’同源臂或3’臂)，其選自fcgr4基因的基因組dna，長度為100至10000個核苷酸。

122、在一些實施例中，a)與待改變的轉換區(qū)5’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號為nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸序列；c)與待改變的轉換區(qū)3’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號為nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸序列。

123、在一些實施例中，a)與待改變的轉換區(qū)5’端同源的dna片段選自于ncbi登錄號為nc_000067.7的第170835769至170839730位的核苷酸序列；c)與待改變的轉換區(qū)3’端同源的dna片段選自于ncbi登錄號為nc_000067.7的第170858203至170862315位的核苷酸序列。

124、在一些實施例中，a)與待改變的轉換區(qū)5’端同源的dna片段選自于ncbi登錄號為nc_000067.7的第170838843至170839730位的核苷酸序列；c)與待改變的轉換區(qū)3’端同源的dna片段選自于ncbi登錄號為nc_000067.7的第170858203至170860272位的核苷酸序列。

125、在一些實施例中，靶向載體所選的基因組核苷酸序列(基因組dna)長度可以超過約0.5kb、0.8kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、5.8kb、6kb、8kb、10kb、或15kb。

126、在一些實施例中，所述待改變的轉換區(qū)位于非人動物內源fcgr4基因的外顯子1至外顯子5上。在一些實施例中，所述待改變的轉換區(qū)位于非人動物內源fcgr4基因的5'utr上游核苷酸序列至3’utr下游核苷酸序列上。

127、在一些實施例中，所述靶向載體還包含一個或多個標記基因。例如，陽性克隆篩選的抗性基因或負篩選標記的編碼基因。在一些實施例中，陽性克隆篩選的抗性基因為新霉素磷酸轉移酶編碼序列neo。在一些實施例中，負篩選標記的編碼基因為白喉毒素a亞基的編碼基因(dta)。

128、在一些實施例中，所述5’臂為與ncbi登錄號為nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸，進一步優(yōu)選的，所述5’臂序列包含seq?id?no：3和27所示核苷酸序列。在一些實施例中，所述3’臂為與ncbi登錄號為nc_000067.7至少具有90％同一性的核苷酸，進一步優(yōu)選的，所述3’臂序列包含seq?id?no：4和28所示核苷酸序列。

129、在一些實施例中，所述靶向載體包含供體序列，在一些實施例中，所述供體序列包括人或人源化fcgr3a的核苷酸序列。例如，靶向載體中的供體序列包括：人fcgr3a基因的部分或全部核苷酸序列，優(yōu)選人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5和/或外顯子6，進一步優(yōu)選的，還包含非人動物內源fcgr4基因的部分或全部核苷酸序列，優(yōu)選非人動物內源fcgr4基因的外顯子5。更優(yōu)選的，還包含人fcgr3a基因的5'utr上游核苷酸序列和/或3'utr下游核苷酸序列。在一些實施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列編碼人fcgr3a蛋白的全部或部分，例如ncbi的蛋白編號為np_001121067.1(seq?id?no：2)或其第1-229位或seq?id?no：35或seq?id?no：35第1-229位。在一些實施例中，人或人源化fcgr3a的核苷酸序列編碼非人動物內源fcgr4蛋白的全部或部分，例如ncbi的蛋白編號為np_653142.2(seq?id?no：1)或其第225-249位。

130、在一些實施例中，所述的靶向載體從5’端到3’端依次包含5’臂、人fcgr3a基因5’utr上游核苷酸序列至外顯子6的5’端、非人動物內源fcgr4基因外顯子5的部分、外顯子6的3’端至人fcgr3a基因3’utr下游核苷酸序列。

131、本發(fā)明還提供了用于構建人源化動物模型或敲除模型的載體。在一些實施例中，載體包含sgrna序列，其中sgrna序列靶向非人動物內源fcgr4基因，并且sgrna在待改變的轉換區(qū)的靶序列(靶位點)上是唯一的，并且滿足5'-nnn(20)-ngg3′或5'-ccn-n(20)-3′的序列排列規(guī)則。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因中sgrna的靶位點位于非人動物內源fcgr4基因外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5上。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因中sgrna的靶位點位于非人動物內源fcgr4基因5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列上。

132、在一些實施例中，靶向序列(靶位點)顯示為seq?id?no：16和17。因此，本發(fā)明提供了用于構建基因修飾的動物模型的sgrna序列。在一些實施例中，寡核苷酸sgrna序列在seqid?no：18和20中列出。在一些實施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：22和24中列出。在一些實施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：19和21中列出。在一些實施例中，寡核苷酸sgrna序列在seq?id?no：23和25中列出。

133、在一些實施例中，本公開涉及包括sgrna序列的質粒構建體(sgrna載體，例如pt7-sgrna)和/或包括該sgrna載體的細胞。

134、本發(fā)明還涉及包含所述的靶向載體或sgrna載體的細胞。

135、此外，本發(fā)明還提供了一種非人哺乳動物細胞，其具有上述靶向載體中的任何一種，以及本技術所述構建體(例如基因構建體或sgrna載體)的一種或多種體外轉錄物。在一些實施例中，細胞包含cas9?mrna或其體外轉錄物。

136、在一些實施例中，所述細胞中基因是雜合的。在一些實施例中，所述細胞中的基因是純合的。

137、在一些實施例中，所述非人哺乳動物細胞是小鼠細胞。在一些實施例中，所述細胞是受精卵細胞。在一些實施例中，所述細胞是胚胎干細胞。在一些實施例中，所述細胞可以是任一表達fcgr3a蛋白的細胞。

138、基因修飾的非人動物的構建方法

139、基因修飾的非人動物可以通過本領域已知的幾種基因編輯技術制備獲得，包括利用胚胎干細胞的同源重組技術、基因打靶技術、crispr/cas9技術、鋅指核酸酶技術、轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術、歸巢核酸內切酶或其他分子生物學技術。在一些實施例中，優(yōu)選使用同源重組技術。在一些實施例中，crispr/cas9基因編輯技術可以構建基因修飾的非人動物。在一些實施例中，crispr-cas9基因組編輯用于產生基因修飾的非人動物。這些基因組編輯技術中的許多技術是本領域已知的，并且在yin等人的“delivery?technologiesfor?genome?editing,”nature?reviews?drug?discovery?16.6(2017)：387-399,中進行了描述，該內容經引用并入本技術。本發(fā)明還提供了許多其他方法用于基因組編輯，例如，將轉基因細胞顯微注射到去核卵母細胞中，并將去核卵母細胞與另一個轉基因細胞融合。

140、在一些實施例中，非人動物的至少一個細胞的內源基因組中編碼內源fcgr4區(qū)域的核苷酸序列被編碼人fcgr3a相應區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實施例中，編碼fcgr4的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和/或信號肽的核苷酸序列被編碼人fcgr3a相應區(qū)域(即人胞外區(qū)、跨膜區(qū)和/或信號肽)的核苷酸序列替換。在一些實施例中，編碼seq?id?no：1的第1-224位的核苷酸序列被編碼人fcgr3a相應區(qū)域(優(yōu)選seq?id?no：2的第1-229位或seq?id?no：35第1-229位)的核苷酸序列替換。在一些實施例中，編碼seq?id?no：1的核苷酸序列被編碼seq?idno：2的核苷酸序列替換。在一些實施例中，所述非人動物內源fcgr4蛋白表達量與野生型動物相比降低或缺失。在一些實施例中，替換發(fā)生在生殖細胞、體細胞、囊胚或成纖維細胞等細胞中。體細胞或成纖維細胞的細胞核可以插入去核卵母細胞中。

141、圖2或圖7顯示了小鼠fcgr4基因座的人源化打靶策略。靶向載體包含5’同源臂、人或人源化fcgr3a基因(dna和/或cdna)片段和3’同源臂組成的載體。該過程涉及利用同源重組將人或人源化fcgr3a序列替換非人動物內源fcgr4序列。在一些實施例中，靶位點上游和下游的切割(例如，通過鋅指核酸酶、talen或crispr)可導致dna雙鏈斷裂，利用同源重組將人或人源化fcgr3a序列替換非人動物內源fcgr4序列。

142、在一些實施例中，所述的非人動物通過將下列任一種或兩種以上核苷酸序列導入非人動物內源fcgr4基因座構建獲得：

143、a)人fcgr3a基因的部分，優(yōu)選包含人fcgr3a基因的外顯子1至6的全部或部分，進一步優(yōu)選包含人fcgr3a基因的外顯子1至6中的一種、兩種或三種以上的外顯子，更進一步優(yōu)選包含人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和外顯子6的部分(優(yōu)選還包含人fcgr3a基因的內含子1、內含子2和/或內含子3)，優(yōu)選還包含人fcgr3a基因的5’utr上游核苷酸序列和/或3’utr下游核苷酸序列；

144、b)編碼人fcgr3a蛋白的全部或部分核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼人fcgr3a蛋白的信號肽、胞外區(qū)、胞質區(qū)和/或跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列，進一步優(yōu)選包含編碼人fcgr3a蛋白的信號肽、胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列，更優(yōu)選的，包含編碼人fcgr3a蛋白信號肽、胞外區(qū)和/或跨膜區(qū)至少100個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，更進一步優(yōu)選包含編碼seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位所示氨基酸序列同一性至少為60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seq?id?no：2第1-229位或seq?idno：35第1-229位所示氨基酸序列差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過1個氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seq?id?no：2第1-229位或seq?id?no：35第1-229位所示的，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸殘基的核苷酸序列；

145、c)非人動物內源fcgr4基因的部分，優(yōu)選包含非人動物內源fcgr4基因的外顯子1至5的全部或部分，進一步優(yōu)選包含非人動物內源fcgr4基因的外顯子1至5中的一種、兩種或三種以上的外顯子，更進一步優(yōu)選包含非人動物內源fcgr4基因的外顯子5的部分；

146、d)編碼非人動物內源fcgr4蛋白的全部或部分核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼非人動物內源fcgr4蛋白的信號肽、胞外區(qū)、胞質區(qū)和/或跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列，進一步優(yōu)選包含編碼非人動物內源fcgr4蛋白的胞質區(qū)的全部或部分核苷酸序列，更優(yōu)選的，包含編碼非人動物內源fcgr4蛋白胞質區(qū)至少20個連續(xù)氨基酸的核苷酸序列，更進一步優(yōu)選包含編碼seq?id?no：1第225-249位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seq?id?no：1第225-249位所示氨基酸序列同一性至少為60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seqid?no：1第225-249位所示氨基酸序列差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過1個氨基酸的核苷酸序列；或者，包含編碼與seq?id?no：1第225-249位所示的，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸殘基的核苷酸序列；

147、e)編碼上述人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列；或，

148、f)上述的人源化fcgr3a基因。

149、優(yōu)選的，所述的非人動物通過將seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠或編碼seq?id?no.7或編碼seq?id?no：33的核苷酸序列導入非人動物內源fcgr4基因座構建獲得；或者，將包含與seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列或編碼seq?id?no.7或編碼seq?id?no：33的核苷酸序列同一性至少為90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列導入非人動物內源fcgr4基因座構建獲得；或者，將包含與seq?id?no：：5或seq?id?no：：5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列或編碼seq?id?no：7或編碼seq?id?no：33的核苷酸序列差異不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過1個核苷酸的核苷酸序列導入非人動物內源fcgr4基因座構建獲得；或者，將包含具有seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠所示核苷酸序列或編碼seq?idno：7或編碼seq?id?no：33的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一個或多個核苷酸的核苷酸序列導入非人動物內源fcgr4基因座構建獲得。

150、優(yōu)選的，所述的非人動物使用上述的靶向載體和/或sgrna載體構建。

151、優(yōu)選的，所述的非人動物進一步包含其他基因修飾，更優(yōu)選的，所述其他基因包括nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

152、優(yōu)選的，所述的人或人源化fcgr3a基因和/或其他基因對于內源被修飾(優(yōu)選替換或插入)基因座為純合。

153、優(yōu)選的，所述的人或人源化fcgr3a基因和/或其他基因對于內源被修飾(優(yōu)選替換或插入)基因座為雜合。

154、優(yōu)選的，所述的非人動物可以選自嚙齒動物、豬、兔子、猴子等任何可以進行基因編輯制備基因人源化的非人動物。

155、優(yōu)選的，所述的非人動物為非人哺乳動物。進一步優(yōu)選的，所述的非人哺乳動物為嚙齒動物。更進一步優(yōu)選的，所述的嚙齒動物為大鼠或小鼠。

156、因此，本發(fā)明提供了一種fcgr3a基因人源化的非人動物的構建方法，所述的非人動物體內表達人或人源化fcgr3a蛋白，和/或，所述的非人動物的基因組中包含人fcgr3a基因的部分或人源化fcgr3a基因。

157、在一些實施例中，所述構建方法包括在非人動物內源fcgr4基因座(或位點)用編碼人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替換編碼內源fcgr4區(qū)域的核酸序列。其中，所述人或人源化fcgr3a包含或不包含突變，優(yōu)選的，該突變?yōu)閒176v突變。在一些實施例中，所述構建方法可以包括在非人動物內源fcgr4基因座(或位點)插入編碼人fcgr3a的核苷酸序列和編碼非人動物內源fcgr4的核苷酸序列。插入的序列可以包括人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5和/或外顯子6的區(qū)域(例如，部分或全部區(qū)域)。在一些實施例中，插入的序列包括人fcgr3a基因的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5的全部和外顯子6的部分(例如，nm_001127595.2的第1-822位，或其第661位包含突變，優(yōu)選第661位為t或g，和901-2153位的核苷酸序列)。在一些實施例中，插入的序列包括非人動物內源fcgr4基因的外顯子5的部分(例如nm_144559.2的第727-804位的核苷酸序列)。在一些實施例中，插入的序列包含編碼人fcgr3a的信號肽(例如seq?id?no：2第1-16位氨基酸)、人fcgr3a的胞外區(qū)(例如seq?id?no.2第17-208位氨基酸或seq?id?no.35第17-208位)，人fcgr3a的跨膜區(qū)(例如seq?id?no：2的第209-229位氨基酸)和非人動物內源fcgr4胞質區(qū)(例如seq?id?no：1的第225-249位氨基酸)的核苷酸序列。在一些實施例中，非人動物內源fcgr4基因座(或位點)中小鼠內源fcgr4的外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5被替換。在一些實施例中，被替換的序列包含小鼠內源fcgr4基因的5’utr上游6764bp至3'utr下游872bp的全部序列。

158、在一些實施例中，修飾非人動物的fcgr4基因座以表達嵌合人/非人動物fcgr3a多肽的方法可以包括用編碼人或人源化fcgr3a的核苷酸序列替換非人動物內源fcgr4基因座處編碼非人動物內源fcgr4的核苷酸序列，從而產生編碼嵌合人/非人動物fcgr3a序列。在一些實施例中，所述方法可以包括在非人動物內源fcgr4基因座處插入編碼嵌合人/非人動物fcgr3a的核苷酸序列，從而產生編碼嵌合人/非人動物fcgr3a序列。

159、在一些實施例中，編碼嵌合人/非人動物fcgr3a的核苷酸序列可以包括編碼人fcgr3a信號肽、胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分的第一核苷酸序列；和編碼非人動物fcgr4的胞質區(qū)的全部或部分的第二核苷酸序列。

160、本發(fā)明還提供了一種建立fcgr3a基因人源化動物模型的方法，包括以下步驟：

161、(a)基于本技術所述的方法提供細胞(例如受精卵細胞)；

162、(b)培養(yǎng)所述細胞(優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞)；

163、(c)將培養(yǎng)的細胞移植到受體雌性非人哺乳動物的輸卵管或子宮，允許細胞在雌性非人哺乳類動物的子宮中發(fā)育；

164、(d)在步驟(c)中鑒定懷孕雌性的經基因修飾的人源化非人哺乳動物的后代中的種系傳播。

165、在一些實施例中，上述方法中的非人哺乳動物是小鼠(例如c57bl/6小鼠)。

166、在一些實施例中，步驟(c)中的非人哺乳動物是具有假妊娠(或妊娠)的雌性。

167、在一些實施例中，用于上述方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本技術所述方法的其他受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。

168、受精卵可以來自任何非人動物，例如本技術所述的任何非人動物。在一些實施例中，受精卵細胞來源于嚙齒動物?；驑嫿w可以通過顯微注射將dna導入受精卵。例如，通過在顯微注射后培養(yǎng)受精卵，可以將培養(yǎng)的受精卵轉移到假孕的非人動物身上，然后假孕的非人動物生下非人哺乳動物，從而產生上述方法中提到的非人哺乳動物。

169、在一些實施例中，制備經遺傳修飾的非人動物的方法包括修飾非人動物的fcgr4基因的編碼框架，例如，通過在人的fcgr3a基因調控元件控制下，用編碼人或人源化fcgr3a相應區(qū)域的核苷酸序列替換編碼內源fcgr4區(qū)域的核苷酸序列(例如，基因組dna、cds序列或cdna序列)。例如，非人動物的fcgr4基因的一個或多個功能區(qū)序列可以被敲除或插入序列，使得非人動物內源fcgr4蛋白不能表達或表達水平降低。在一些實施例中，修飾的非人動物的fcgr4基因的編碼框可以是非人動物的fcgr4基因外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4和/或外顯子5的核苷酸序列的全部或部分。

170、在一些實施例中，用于制備遺傳修飾的非人動物的方法包括：

171、(1)提供包含人或人源化fcgr3a基因片段的質粒，所述質粒側翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向非人動物內源fcgr4；

172、(2)提供一種或多種靶向內源fcgr4基因的指導rna(sgrna)；

173、(3)通過使用步驟(1)的質粒、步驟(2)的sgrna和cas9來修飾受精卵或胚胎干細胞的基因組；

174、(4)將步驟(3)中獲得的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中，或者將步驟(3)中獲得地胚胎干細胞移植到囊胚中，然后將囊胚移植到假孕雌性小鼠的輸卵管中以產生功能性表達人源化fcgr3a蛋白的子代小鼠。

175、在一些實施例中，所述的方法還包括(5)將步驟(4)中獲得的子代小鼠交配以獲得純合小鼠。

176、在一些實施例中，受精卵被crispr用靶向5’-末端靶位點和3’-末端靶位點的sgrna修飾。

177、在一些實施例中，編碼人源化fcgr3a蛋白的序列與非人動物內源fcgr4基因座處的內源調控元件可操作地連接。

178、在一些實施例中，編碼人源化fcgr3a蛋白的序列與人fcgr3a基因的調控元件可操作地連接。

179、在一些實施例中，經遺傳修飾的非人動物不表達內源fcgr4蛋白。

180、在一些實施例中，用于制備遺傳修飾的非人動物的方法包括：

181、(1)提供包含人或人源化fcgr3a基因片段的質粒，所述質粒側翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同種臂靶向內源fcgr4；

182、(2)提供一種或多種靶向非人動物內源fcgr4基因的指導rna(sgrna)；

183、(3)通過將所述人或人源化fcgr3a基因片段插入到非人動物內源fcgr4基因座中來修飾受精卵或胚胎干細胞的基因組。

184、在一些實施例中，所述的構建方法包括用人fcgr3a和非人動物內源fcgr4的嵌合序列替換非人動物內源fcgr4基因的5'utr上游核苷酸序列至3'utr下游核苷酸序列。

185、在一些實施例中，所述的構建方法包括用人源化fcgr3a基因或編碼人源化fcgr3a蛋白的核苷酸序列替換非人動物基因組中編碼非人動物內源fcgr4蛋白的核苷酸序列。

186、在一些實施例中，所述的構建方法包括用編碼seq?id?no：7或seq?id?no：：33的核苷酸序列替換非人動物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。

187、在一些實施例中，所述的構建方法包括用seq?id?no：5或seq?id?no：5第6786位由g突變?yōu)閠替換非人動物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。

188、基因修飾的非人動物的應用

189、在非人動物內源基因座并在人或內源調控元件(例如啟動子、5'utr和/或3'utr)的控制下，用同源或直系源人類基因或人類序列替換非人動物基因或將同源或直系同源人類基因或人序列插入非人動物中，可以產生具有可能與典型的敲除加轉基因動物顯著不同的品質和特征的非人動物。在典型的敲除加轉基因動物中，內源基因座被移除或破壞，全人轉基因被插入動物的基因組中，并可能隨機整合到基因組中。通常，整合轉基因的位置是未知的；通過人基因和/或蛋白質測定和/或功能測定的轉錄來測量人類蛋白質的表達。在人轉基因中，人序列的上游和/或下游為轉基因的表達和/或調節(jié)提供合適的支持。

190、本發(fā)明證明在人源調控元件控制下，在內源基因座用人或人源化的序列替換或插入產生人源化動物，提供了生理上合適的表達模式和水平，其關于被替換基因的生理學在人源化非人動物的生理學的背景下是有意義的和合適的。

191、表達人或人源化fcgr3a蛋白的基因修飾非人動物或動物模型，例如，以生理學上合適的方式，提供了多種用途，包括但不限于開發(fā)人類疾病和病癥的治療方法，以及評估這些人類治療方法在非人動物或動物模型中的毒性和/或功效。

192、本發(fā)明還提供了一種上述包含人源化fcgr3a基因修飾的非人動物、上述任一構建方法獲得的非人動物的應用。

193、在一些實施例中，所述應用包含：

194、a)涉及人類細胞的與fcgr3a相關的免疫過程的產品開發(fā)中的應用；

195、b)作為藥理學、免疫學、微生物學和醫(yī)學研究的與fcgr3a相關的模型系統(tǒng)中的應用；

196、c)涉及生產和利用動物實驗疾病模型用于與fcgr3a相關的病原學研究和/或用于開發(fā)診斷策略和/或用于開發(fā)治療策略中的應用；

197、d)在體內研究人fcgr3a信號通路調節(jié)劑的篩選、藥效檢測、評估療效、驗證或評價中的應用；或者，

198、e)研究fcgr3a基因功能，研究針對人fcgr3a靶位點的藥物、藥效，研究與fcgr3a相關疾病治療(例如腫瘤、炎癥、免疫疾病)藥物方面的應用。

199、本發(fā)明提供了一種表達人或人源化fcgr3a蛋白非人動物，該非人動物可用于人fcgr3a特異性調節(jié)劑的篩選。在一些實施例中，所述非人動物是人疾病動物模型。如，疾病是遺傳誘導的(敲入或敲除)。在不同的實施例中，基因修飾的非人動物還包含受損的免疫系統(tǒng)，如，經過基因修飾的人源性組織異種移植，包括人實體瘤(例如，乳腺癌)或血細胞腫瘤(例如，淋巴細胞腫瘤、b或t細胞腫瘤)。

200、在一些實施例中，抗fcgr3a抗體阻斷或抑制fcgr3a介導的信號通路。在一些實施例中，本技術所描述的抗fcgr3a抗體可以阻斷fcgr3a復合物之間的相互作用，從而抑制fcgr3a信號通路。

201、在一些實施例中，基因修飾的非人動物可用于確定治療劑(如，抗fcgr3a抗體)對治療腫瘤的有效性。在一些實施例中，向非人動物施用治療劑(如，抗fcgr3a抗體)，其中所述非人動物具有腫瘤，檢測治療劑對腫瘤的抑制作用。在一些實施例中，所述檢測包括測定腫瘤細胞的大小和/或增殖速率。在一些實施例中，所述檢測方法包括游標卡尺測量、流式細胞檢測和/或動物活體成像檢測。在一些實施例中，所述檢測包括評估個體體重、脂肪量、活化途徑、神經保護活性或代謝變化，所述代謝變化包括食物消耗或水消耗的變化。

202、在一些實施例中，所述腫瘤細胞包括一個或多個被注射到動物體內的癌細胞(如，癌細胞來源于人或非人動物)。在一些實施例中，治療劑抑制fcgr3a信號通路。在一些實施例中，治療劑不抑制fcgr3a信號通路。

203、在一些實施例中，基因修飾的非人動物可用于檢測抗fcgr3a抗體為激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，本技術描述的方法可以用來檢測治療劑(如，抗fcgr3a抗體)的功能，例如，所述治療劑是否可以上調免疫應答或下調免疫應答，和/或該治療劑是否能夠誘導補體介導的細胞毒性(cmc)或抗體依賴性細胞毒性(adcc)。在一些實施例中，基因修飾的非人動物可用于確定治療受試者疾病(例如腫瘤、炎癥或免疫疾病)的治療劑的有效劑量。對腫瘤的抑制作用也可以通過本領域已知的方法來確定，例如，測量非人動物中的腫瘤體積，和/或確定腫瘤(體積)抑制率(tgitv)。腫瘤生長抑制率可以使用公式tgitv(％)＝(1-tvt/tvc)x100計算，其中tvt和tvc是治療組和對照組的平均腫瘤體積(或重量)。

204、在一些實施例中，治療劑(如，抗fcgr3a抗體)可以被用于治療各種腫瘤。本發(fā)明所述“腫瘤”是指具有自主生長能力的細胞，即以細胞生長迅速增殖為特征的異常狀態(tài)或病癥。該術語旨在包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲性階段如何。本發(fā)明所述“腫瘤”包括但不限于皮膚癌、淋巴瘤、非小細胞肺癌、宮頸癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌、腦膠質瘤、肺癌、支氣管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和膽管癌、食管癌、腎癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、睪丸癌、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常綜合征、以及肉瘤。其中，所述白血病選自急性淋巴細胞性(成淋巴細胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞白血病、以及慢性骨髓性白血?。凰隽馨土鲞x自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b細胞淋巴瘤、彌漫性大b細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤、t細胞淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；所述肉瘤選自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、以及軟骨肉瘤。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、內分泌癌、頭頸癌、胃腸癌、結直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌、神經內分泌瘤、間皮組織腫瘤、口咽腫瘤、女性生殖系統(tǒng)癌癥或腦膜瘤。

205、在一些實施例中，治療劑(例如，靶向fcgr3a的抗體；或靶向fcgr3a信號通路的藥物)被設計用于治療各種免疫疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、或硬皮病。因此，本技術所述的方法可用于確定治療劑(例如，靶向fcgr3a的抗體；或靶向fcgr3a信號通路的藥物)在抑制免疫應答中的有效性。在一些實施例中，本技術所述的免疫疾病包括艾滋病、骨質疏松、重癥肌無力、移植物抗宿主病(gvhd)、銀屑病、過敏、哮喘、心肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫肝病、疼痛或神經系統(tǒng)疾病中的一種或兩種以上。

206、在一些實施例中，治療劑(例如，靶向fcgr3a的抗體；或靶向fcgr3a信號通路的藥物)被設計用于治療各種炎癥，例如病毒性炎癥。在一些實施例中，本技術所述的炎癥包括急性炎癥和慢性炎癥。具體而言，炎癥包括但不限于退行性炎癥、滲出性炎癥(例如漿液性炎癥、纖維蛋白炎癥、化膿性炎癥、出血性炎癥、壞死性炎癥、卡他性炎癥)、增殖性炎癥、特異性炎癥(如肺結核、梅毒、麻風病或淋巴肉芽腫)或炎性腸病中的一種或兩種以上。在一些實施例中，本技術所述的炎癥包括感染，并且感染是指由侵入人體的細菌、病毒、真菌、寄生蟲和/或其他病原體引起的局部組織和全身炎癥反應。

207、本發(fā)明還提供了一種確定治療劑(如，抗fcgr3a抗體)毒性的檢測方法。所述方法包括向上述所述非人動物施用治療劑，評估非人動物的體重變化或血液檢查，優(yōu)選的，所述的血液檢查包括紅細胞計數、血細胞比容或血紅蛋白中的一種或兩種以上。在一些實施例中，抗體可使紅細胞(rbc)、血細胞比容或血紅蛋白降低20％、30％、40％或50％以上。在一些實施例中，非人動物的體重與對照組(如，未用抗體處理的非人動物的平均體重)相比至少小5％、10％、20％、30％或40％。

208、本發(fā)明還提供了一種通過本技術所述構建方法獲得的非人動物或動物模型在開發(fā)與人類細胞免疫過程相關的產品、制造人抗體、或用于藥理學、免疫學、微生物學和醫(yī)學研究的模型系統(tǒng)。

209、在一些實施例中，提供了一種通過本技術所述的構建方法獲得的非人動物或動物模型在生產和利用人體細胞的免疫過程的動物實驗疾病模型、研究病原體、或制定新的診斷策略和/或治療策略。

210、本發(fā)明還提供了通過本技術所述構建方法獲得的非人動物或動物模型來篩選、驗證、評估或研究fcgr3a基因功能、人fcgr3a抗體、靶向人fcgr3a的藥物或有效性、例如治療免疫疾病、腫瘤或炎癥的藥物。

211、在一些實施例中，本公開提供了一種驗證tcr-t、car-t和/或其他免疫療法(例如，t細胞過繼轉移療法)的體內療效的方法。例如，所述方法包括將人腫瘤細胞移植到本技術所述的非人動物中，并將人car-t應用于具有人腫瘤細胞的溝通動物。car-t治療的有效性可以確定和評估。在一些實施例中，所述溝通動物選自通過本技術所述構建方法制備的fcgr3a基因人源化非人動物，通過本技術所描述的方法產生的雙基因或多基因人源化非人動物(或其后代)，表達人或人源化fcgr3a蛋白的非人動物，或本技術所述的攜帶腫瘤或炎性動物模型。在一些實施例中，tcr-t、car-t和/或其他免疫療法可以治療fcgr3a相關疾病。在一些實施例中，tca-t、car-t和/或其他免疫療法提供了用于治療fcgr3a相關疾病的評估方法。

212、兩個或多個人或人源化基因的非人動物模型

213、本發(fā)明還提供了一種具有兩個或多個人或人源化基因的轉基因動物模型或非人動物。該非人動物或動物模型可以包含人或人源化fcgr3a基因和編碼額外的人或人源化蛋白的序列。

214、在一些實施例中，所述額外的人或人源化基因包含nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。在一些實施例中，所述非人動物或動物模型還表達人或人源化的nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4蛋白中的至少一種。

215、本發(fā)明還提供了一種兩個或多個人或人源化基因的非人動物或動物模型的構建方法，所述構建方法包括：

216、(一)提供上述的構建方法獲得非人動物或動物模型；

217、(二)將步驟(一)提供的非人動物或動物模型與其他基因修飾的非人動物交配、體外受精或直接進行基因編輯，并進行篩選，得到多基因修飾的非人動物。

218、在一些實施例中，所述其他基因修飾的非人動物包括基因nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的一種或兩種以上的組合人源化的非人動物。

219、在一些實施例中，fcgr3a人源化直接在具有人或人源化nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中至少一種基因修飾的非人動物上進行。

220、由于這些蛋白可能涉及不同的機制，因此靶向其中兩種或多種蛋白的聯(lián)合療法可能是一種更有效的治療方法。事實上，許多相關的臨床試驗正在進行中，并顯示出良好的效果。多基因修飾的非人動物模型可用于確定靶向兩種或多種蛋白的聯(lián)合治療方法的有效性，例如，抗fcgr3a抗體，以及用于治療腫瘤、炎癥或免疫疾病(例如，哮喘或特異性皮炎)的附加治療劑。所述聯(lián)合治療方法包括向非人動物施用抗fcgr3a抗體和附加治療劑，其中非人動物患有疾病，并確定聯(lián)合治療方法對免疫腫瘤、炎癥或免疫疾病的影響。在一些實施例中，所述附加治療劑是特異性結合nkp46、cd3e、egfr、ccr8、nkg2d、cd32、cd64、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中至少一種的抗體。在一些實施例中，所述附加治療劑是抗ctla4抗體(例如，ipilimumab)、抗pd-1抗體(例如，nivolumab)或抗pd-l1抗體。在一些實施例中，上述所述非人動物還包括編碼人或人源化pd-1的序列、編碼人或人源化pd-l1的序列、或編碼人或人源化ctla-4的序列。在一些實施例中，附加治療劑是抗pd-1抗體(例如，納武利尤單抗、帕博利珠單抗)、抗pd-l1抗體或抗ctla-4抗體。在一些實施例中，上述所述腫瘤包括一個或多個表達pd-l1和/或pd-l2的腫瘤細胞。

221、在一些實施例中，該聯(lián)合治療方法用于治療本技術所述的各種腫瘤，例如，實體瘤、消化道癌、黑色素瘤、胃癌、子宮內膜癌、腸癌、淋巴瘤、乳腺癌、內分泌癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或卵巢癌中的一種或兩種以上。在一些實施例中，聯(lián)合治療方法被設計用于治療本技術所述的免疫紊亂，例如銀屑病。

222、在一些實施例中，本技術所述的方法可用于評估與一些其他方法的聯(lián)合治療方法?？蓡为毷褂没蚺c本技術所述方法結合使用的治療癌癥的聯(lián)合治療方法包括，例如，用化學療法治療受試者，例如，樟腦堿、多柔比星、順鉑、卡鉑、丙卡巴嗪、甲氯雷他明、環(huán)磷酰胺、阿霉素、異環(huán)酰胺、馬法蘭、氯丁嘧啶、比硫芬、亞硝基脲、達克寧、柔紅霉素、博萊霉素、普利霉素、絲裂霉素，依托泊苷、維拉帕米、鬼臼毒素、三苯氧胺、紫杉醇、轉鉑、5-氟脲酸、長春新堿、長春花素和/或甲氨蝶呤。或者，除此之外，所述聯(lián)合治療方法可以包括對受試者進行手術，以移除腫瘤的至少一部分，例如，從患者身上移除腫瘤的一部分或全部。