本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，特別是免疫藥物，具體涉及一種預(yù)防犬瘟熱病毒感染的融合蛋白和疫苗及其應(yīng)用等。

背景技術(shù)：

1、犬瘟熱病毒（canine?distemper?virus,?cdv）是一種屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬的單股負(fù)鏈rna病毒，是全球范圍內(nèi)威脅犬科動物健康的主要病原體之一。cdv不僅感染犬類，還可感染其他食肉目動物，如狐貍、狼、浣熊等，甚至對某些靈長類動物也具有感染性。犬瘟熱是由cdv引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以發(fā)熱、呼吸道癥狀、消化道癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主要特征。

2、犬瘟熱病毒感染不僅直接危害動物健康，還常與其他病原體如細(xì)菌、真菌等形成繼發(fā)感染，加重疾病程度。近年來，隨著寵物數(shù)量的增加和野生動物棲息地的破壞，cdv感染在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，已成為威脅動物福利和生態(tài)平衡的重要問題之一。

3、安全有效的疫苗被認(rèn)為是預(yù)防和控制cdv感染的最佳措施。cdv的主要抗原蛋白包括血凝素蛋白（hemagglutinin?protein，h蛋白）、融合蛋白（fusion?glycoprotein，f蛋白）、核蛋白（nucleoprotein，n蛋白）等。其中，h蛋白是病毒表面的主要糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞的吸附，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。cdv的h蛋白結(jié)構(gòu)較為特殊，n端位于病毒內(nèi)側(cè)，c端位于病毒外側(cè)，類似于真核細(xì)胞的ii類跨膜蛋白。

4、目前市場上主要的cdv疫苗類型為減毒活疫苗。雖然減毒活疫苗通過多次傳代使病毒毒力減弱，但仍有毒力返強的風(fēng)險，并且目前市售的減毒活疫苗保護效果不佳。為了克服現(xiàn)有疫苗的局限性，研究人員正在積極開發(fā)新型cdv疫苗。例如，現(xiàn)有技術(shù)專利cn109867713b（授權(quán)公告日2022-07-26）公開了一種犬瘟熱病毒h蛋白的亞單位疫苗，專利cn108704128b（授權(quán)公告日2022-06-21）介紹了一種犬瘟熱細(xì)小病毒二聯(lián)亞單位疫苗。這些亞單位疫苗均采用全長h蛋白，利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)進行體外表達、純化。這種方式存在交叉免疫保護差、成本高、產(chǎn)量低的問題，無法順利推廣。

5、因此，目前仍然迫切需要一種新的犬瘟熱疫苗，解決當(dāng)前疫苗開發(fā)中存在的問題。相較于傳統(tǒng)疫苗開發(fā)，核酸疫苗（nucleic?acid?vaccine）是更好的選擇。目前已有大量研究證明，核酸疫苗具有多項優(yōu)勢：（1）不攜帶毒力病毒顆粒，也不存在毒力返祖現(xiàn)象，安全性更高；（2）可以在細(xì)胞內(nèi)完成抗原蛋白表達，從而誘發(fā)機體對該蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，能夠增強免疫效果，延長有效保護的持續(xù)時間，無需多次重復(fù)加強免疫；（3）可以還原抗原的空間構(gòu)象，提供更多、更準(zhǔn)確的空間表位，增加免疫原性；（4）接種后，抗原蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達，能夠直接與組織相容性復(fù)合物mhci或ii類分子結(jié)合，不受母源抗原干擾。

6、因此，本領(lǐng)域亟需一種提供更優(yōu)的構(gòu)象表位、具備交叉免疫保護效果、降低生產(chǎn)成本的cdv疫苗，以使得疫苗更容易在全球范圍內(nèi)推廣使用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種新的犬瘟熱病毒疫苗分子架構(gòu)設(shè)計和應(yīng)用，具體提供一種可預(yù)防犬瘟熱病毒感染的截選肽段、融合蛋白、免疫原性組合物、疫苗、編碼其的重組核酸、基因表達盒、載體、宿主細(xì)胞、制備方法以及制藥用途等。本發(fā)明從開發(fā)cdv核酸疫苗的角度出發(fā)，對cdv?h蛋白做出適當(dāng)截選，并且篩選出合適的四聚體功能元件連接在h蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的n端，用以促使其在表達過程中自組裝為四聚體形式，還原天然四聚體構(gòu)象。本發(fā)明截選的cdv?h蛋白肽段，能夠和不同的元件組合，設(shè)計而成的核酸疫苗均能在真核細(xì)胞中順利表達，且具有免疫原性。此外，本發(fā)明優(yōu)選的四聚體元件和截選的cdv?h蛋白序列組成的融合蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)高水平體液免疫反應(yīng)，同時還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并提供針對不同cdv毒株的交叉免疫保護。

2、本發(fā)明的一方面提供一種犬瘟熱病毒（canine?distemper?virus,?cdv）血凝素蛋白（hemagglutinin?glycoprotein，h蛋白）的截選肽段。

3、進一步地，所述的截選肽段的氨基酸序列如seq?id?no.5或seq?id?no.9所示。

4、本發(fā)明的另一方面提供一種融合蛋白，其特征在于，包含所述的截選肽段。

5、進一步地，所述融合蛋白從從n端到c端，包含如下元件：

6、（a）四聚體結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述四聚體結(jié)構(gòu)域是來源于泉古菌屬（staphylothermus）的四聚體結(jié)構(gòu)域；更優(yōu)選地，所述泉古菌屬（staphylothermus）的四聚體結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；和

7、（b）所述的截選肽段。

8、進一步地，其特征在于，所述融合蛋白的n端含有信號肽；優(yōu)選地，所述信號肽的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

9、進一步地，其特征在于，所述融合蛋白的n端含有fc?domain；優(yōu)選地，所述fcdomain的氨基酸序列如seq?idno.10所示。

10、進一步地，其特征在于，所述元件之間可選地通過linker序列連接，優(yōu)選地，linker序列為gs?linker或ggs?linker；優(yōu)選地，所述gs?linker的氨基酸序列如seq?idno.6所示，所述ggs?linker的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

11、本發(fā)明的另一方面提供一種重組核酸分子，其特征在于，編碼本發(fā)明所述截選肽段和/或融合蛋白。

12、本發(fā)明的另一方面提供一種重組基因表達盒，其特征在于，包含所述重組核酸分子。

13、本發(fā)明的另一方面提供一種重組載體，其特征在于，包含所述重組核酸分子、或所述重組基因表達盒。

14、本發(fā)明的另一方面提供一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，包含所述重組核酸分子、或所述重組基因表達盒、或所述重組載體。

15、本發(fā)明的另一方面提供一種免疫原性組合物或藥物組合物，其特征在于，包含一種或多種任一項所述截選肽段和/或融合蛋白，和/或一種或多種所述重組核酸分子，和/或一種或多種所述重組基因表達盒，和/或一種或多種所述重組載體，和/或一種或多種所述重組宿主細(xì)胞；優(yōu)選地，所述免疫原性組合物或藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。

16、本發(fā)明的另一方面提供一種重組疫苗，其特征在于，包含一種或多種任一項所述截選肽段和/或融合蛋白，和/或一種或多種所述重組核酸分子，和/或一種或多種所述重組基因表達盒，和/或一種或多種所述重組載體，和/或一種或多種所述重組宿主細(xì)胞，和/或一種或多種所述免疫原性組合物或藥物組合物；優(yōu)選地，所述疫苗為核酸疫苗。

17、本發(fā)明的另一方面提供一種或多種所述截選肽段和/或融合蛋白的制備方法，其特征在于，采用所述的重組宿主細(xì)胞表達所述截選肽段和/或融合蛋白，并分離所述截選肽段和/或融合蛋白。

18、本發(fā)明的另一方面提供一種或多種所述截選肽段和/或融合蛋白，和/或一種或多種所述重組核酸分子，和/或一種或多種所述重組基因表達盒，和/或一種或多種所述重組載體，和/或一種或多種所述重組宿主細(xì)胞，和/或一種或多種所述免疫原性組合物或藥物組合物，和/或一種或多種所述重組疫苗在制備預(yù)防犬瘟熱病毒引起的疾病的藥物中的用途；優(yōu)選地，所述疾病為犬瘟熱疾病。

19、本發(fā)明的另一方面提供一種疾病的預(yù)防方法，其特征在于，給予受試者預(yù)防有效量的一種或多種所述截選肽段和/或融合蛋白，和/或一種或多種所述重組核酸分子，和/或一種或多種所述重組基因表達盒，和/或一種或多種所述重組載體，和/或一種或多種所述重組宿主細(xì)胞，和/或一種或多種所述免疫原性組合物或藥物組合物，和/或一種或多種所述重組疫苗；優(yōu)選地，所述疾病為犬瘟熱病毒引起的疾病。

20、本發(fā)明的融合蛋白、免疫原性組合物、重組疫苗等具有如下有益技術(shù)效果：

21、1.?本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的融合分子具有良好的免疫原性，并且能夠提供免疫保護效果，可同時作為核酸疫苗或亞單位疫苗的通用抗原架構(gòu)。本發(fā)明的免疫原性組合物，具有良好的免疫原性，可針對犬瘟熱病毒感染提供有效的免疫保護，相較于傳統(tǒng)活疫苗，安全性高，制備成本低，有利于市場推廣。

22、2.?本發(fā)明發(fā)現(xiàn)基于cdv全長h蛋白設(shè)計的核酸疫苗無法在真核細(xì)胞中表達，難以激活動物的體液免疫；而基于本發(fā)明的cdv截短肽段能夠與不同的元件組合形成新的融合分子，在真核細(xì)胞中順利表達并分泌，并能夠有效激活動物的體液免疫。且截短cdv?h蛋白截選肽段1為最優(yōu)選擇。

23、3.?本發(fā)明從開發(fā)cdv核酸疫苗的角度出發(fā)，篩選多種功能性元件連接在cdv?h蛋白截選肽段的n端，最終選取出還原h(huán)蛋白天然四聚體構(gòu)象的四聚體功能元件，在組成融合蛋白后不僅能夠順利表達，并且具有強免疫原性。本發(fā)明從多種不同的四聚體結(jié)構(gòu)域中進行篩選，選出分泌效率最高的泉古菌屬四聚體結(jié)構(gòu)域，其與cdv?h蛋白截選肽段融合后更有利于抗原呈遞和體液免疫的激活。

24、4.?本發(fā)明實施例4表明，基于本發(fā)明的融合分子能夠有效促進cdv的h蛋白在真核細(xì)胞中順利表達、分泌，且表達的蛋白結(jié)構(gòu)正確、穩(wěn)定，有利于免疫表位呈遞，從而進一步提高免疫保護效果，為麻疹類病毒的通用疫苗設(shè)計領(lǐng)域提供新技術(shù)。

25、5.?本發(fā)明實施例5表明，在豚鼠模型中，基于本發(fā)明的疫苗d免疫后能夠誘導(dǎo)4/5個體產(chǎn)生中和抗體，且3/5個體產(chǎn)生的中和抗體具有針對cdv1和cdv3的交叉免疫保護效果，即針對不同cdv毒株可提供交叉免疫保護。本發(fā)明的重組核酸疫苗b、c能夠在豚鼠模型中誘導(dǎo)針對cdv1毒株的有效免疫保護。

26、6.?本發(fā)明實施例6表明，在黑貉（犬科）模型中，本發(fā)明的融合蛋白具有良好的免疫原性，基于本發(fā)明的核酸疫苗能夠為靶動物黑貉提供有效的免疫保護，針對犬瘟熱病毒感染有良好的預(yù)防效果。雖然基于本發(fā)明的核酸疫苗d在實施例5中兩次免疫后，只在4/5只黑貉中檢測到高水平的中和抗體，但是在實施例6攻毒實驗顯示5只黑貉均成功存活。推測疫苗d不僅誘導(dǎo)體液免疫，同時還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，在cdv強毒攻擊時能獲得完全保護。