本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種高磷脂細胞培養(yǎng)魚油及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、魚油，從魚類及其加工副產(chǎn)品中提取，富含epa、dha、亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸，但磷脂含量較少。魚油對多種疾病有特殊的預(yù)防和治療作用，如代謝綜合征、心腦血管疾病、炎癥等。但魚油在加工過程中容易氧化，不僅會影響風味、色澤和口感，還會降低營養(yǎng)價值。隨著海洋污染的日益嚴重，直接從海洋魚類中提取的魚油也往往含有多種污染物，嚴重影響了魚油的加工和安全。因此，尋找新的高磷脂魚油生產(chǎn)方法迫在眉睫。

2、細胞培養(yǎng)肉是近年來興起的一種顛覆性食品制造技術(shù)，旨在利用干細胞和組織工程學在體外大規(guī)模培養(yǎng)細胞，用于生產(chǎn)農(nóng)產(chǎn)品。目前，細胞培養(yǎng)脂肪主要用于哺乳動物細胞，如雞、豬和牛，而關(guān)于使用魚類細胞的研究報道很少。目前用于培養(yǎng)脂肪的細胞類型有去分化脂肪細胞、脂肪來源干細胞、前脂肪細胞、多能干細胞等。然而，它們的成脂效率和增殖能力會隨著傳代次數(shù)的增加而降低，這大大限制了它們在細胞培養(yǎng)脂肪和大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，選擇穩(wěn)定的養(yǎng)殖肉類種子細胞系（如肌肉干細胞）就成了生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)細胞魚油的關(guān)鍵。魚細胞系容易自發(fā)永生化，這是其作為種子細胞的最大優(yōu)勢。研究表明，體細胞和肌肉衛(wèi)星細胞有可能在特定條件下轉(zhuǎn)分化為脂肪細胞或類脂肪細胞。通過轉(zhuǎn)分化策略，可以實現(xiàn)高效穩(wěn)定的細胞增殖和對細胞脂質(zhì)組成精準的分化控制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是目前缺乏合適的魚細胞成脂轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基及大規(guī)模制備高磷脂含量的細胞培養(yǎng)魚油的方法，嚴重阻礙了細胞魚肉及其衍生制品的發(fā)展。

2、為解決上述問題，本發(fā)明通過調(diào)整成脂轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，實現(xiàn)了大黃魚肌肉衛(wèi)星細胞快速成脂轉(zhuǎn)分化，并大規(guī)模制備了高磷脂含量的細胞培養(yǎng)大黃魚魚油，為進一步的得到細胞培養(yǎng)魚肉奠定了基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明通過添加油酸、葡萄糖和維生素c以及物理調(diào)控（培養(yǎng)體系優(yōu)化）共同實現(xiàn)了制備高磷脂含量的細胞培養(yǎng)魚油，進一步改良了魚油的營養(yǎng)品質(zhì)。

3、為實現(xiàn)上述目的，本使用發(fā)明的技術(shù)方案是：一種高磷脂細胞培養(yǎng)魚油的制備方法，包括以下步驟：使用完全培養(yǎng)基擴增肌肉細胞，再使用成脂轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基行成脂轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)，得到高磷脂細胞培養(yǎng)魚油；

4、其中，成脂轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基由85-94%（ v/v）dmem/f12、3-12%（ v/v）馬血清、1%（ v/v）青霉素-鏈霉素（100x）、1%（ v/v）非必需氨基酸、1%（ v/v）glutamax?、0.25-1.5?μm地塞米松、5-25?μm羅格列酮、2.5-15?μg/ml胰島素、25-125?μm吲哚美辛、125-750?μm?ibmx、50-500?μm油酸、1-5?mm?l-谷氨酰胺、50-250?μm?維生素c、20-100?μm葡萄糖組成；分化時間為4-6天。

5、其中，dmem/f12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為細胞提供基本營養(yǎng)；馬血清中含有血清蛋白、生長因子、氨基酸、糖類、無機鹽等物，可為細胞提供基本營養(yǎng)和能量，馬血清不如胎牛血清營養(yǎng)豐富，且馬血清中含有一些激素、因子可以引導(dǎo)細胞向特定的細胞類型分化；青霉素-鏈霉素（100x）可防止微生物污染；非必需氨基酸為細胞增殖及分化提供營養(yǎng)；glutamax?、l-谷氨酰胺可為細胞提供能量和氮源，改善細胞健康；地塞米松是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，促進c/ebps表達；羅格列酮為胰島素增敏劑，可激活pparγ；胰島素可以激活creb及下游一系列轉(zhuǎn)錄激活因子，促進游離脂肪酸合成甘油三酯；吲哚美辛可阻斷細胞向破骨及成骨細胞方向分化，pparγ激活劑；ibmx可激活camp依賴性蛋白激酶途徑來增強c/ebps和pparγ的表達；油酸可以作為pparγ的天然激活配體；維生素c可以上調(diào)脂肪形成相關(guān)基因pparγ、維甲酸x受體α、脂蛋白酯酶等轉(zhuǎn)錄水平，還可以促進膠原蛋白合成、上調(diào)lpl和gpdh的表達，下調(diào)脂聯(lián)素的表達，促進甘油三酯積累，加速細胞分化進程；葡萄糖通過糖酵解為細胞提供能量和碳源。

6、進一步的，所述肌肉細胞為大黃魚肌肉衛(wèi)星細胞。相比去分化脂肪細胞、脂肪來源干細胞、前脂肪細胞、多能干細胞等其他用于成脂的細胞，肌肉衛(wèi)星細胞更容易獲得，且其成脂效率和增殖能力不會因隨著傳代次數(shù)的增加而降低。

7、進一步的，完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素（100x）的dmem/f12培養(yǎng)基。dmem/f12由dmem和f-12按1:1比例混合而成，結(jié)合了兩種培養(yǎng)基的優(yōu)點，使培養(yǎng)基的營養(yǎng)更加全面，可為細胞生長和增殖提供基本能量和營養(yǎng)。胎牛血清為細胞生長提供所需的各種生長因子、激素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等，可促進細胞的增殖、分化和維持正常生理功能。細胞在10%胎牛血清中可維持正常的細胞形態(tài)及增殖效率，胎牛血清濃度過低，細胞增殖速率下降，形態(tài)變差，容易空泡，濃度過高則增加成本，且容易促使細胞分化。

8、進一步的，2d成脂轉(zhuǎn)分化包括以下步驟：將肌肉細胞接種到6孔板中，加入完全培養(yǎng)基，待細胞長滿后更換為成脂轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，進行分化。

9、進一步的，3d成脂轉(zhuǎn)分化包括以下步驟：

10、（1）將微載體加入到內(nèi)置葉輪培養(yǎng)瓶中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，攪拌溶脹；

11、（2）靜置后棄掉上層基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基再次攪拌，靜置后棄掉上層基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

12、（3）加入完全培養(yǎng)基，按一定密度接種細胞，梯度攪拌過夜；第二天補加培養(yǎng)基至500?ml，調(diào)整為恒速攪拌，隔天半換液；

13、（4）待細胞長滿微載體后，靜置棄掉完全培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，隔天半換液；

14、（5）靜置棄掉轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，收集樣品，用pbs洗滌兩次，加入細胞裂解液，離心，收集上清。

15、進一步的，步驟（1）中微載體的加入比例為按總培養(yǎng)體系的體積計2-5?mg/ml；溶脹時間為12?h。提前將微載體溶脹后有利于細胞貼附增殖。

16、進一步的，步驟（1）和步驟（2）中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，添加量為50-100?ml；攪拌速度為40?rpm。盡可能洗去微載體中可能殘留的對細胞有影響的物質(zhì)。與完全培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基保持一致，防止引入外源雜質(zhì)。

17、進一步的，步驟（3）加入200?ml完全培養(yǎng)基，接種肌肉細胞的密度為5-20萬/ml。細胞接種密度過低，細胞增殖緩慢，狀態(tài)差，培養(yǎng)時間長；接種密度過高，細胞生長受限，細胞之間競爭加劇，影響細胞的生長和增殖，且會降低微載體的利用效率。

18、進一步的，步驟（3）中梯度攪拌程序為0?rpm，2?h，40?rpm，5?min，循環(huán)過夜；恒速攪拌速度為40?rpm。肌肉衛(wèi)星細胞的貼壁時間在2?h左右，靜置2?h可促使細胞貼附在微載體上；40?rpm攪拌對對細胞基本沒有剪切應(yīng)力損傷，通過攪拌，可使細胞貼附更加均勻。

19、進一步的，步驟（5）中細胞裂解時間為2-3?min，室溫操作；離心時間為5?min，轉(zhuǎn)速5000?rpm。微載體在裂解液中處理2-3?min可使細胞脫離微載體，通過離心，可將微載體沉于底部，而細胞留在在上清中，便于收集。

20、一種上述方法制備的高磷脂細胞培養(yǎng)魚油。所得細胞培養(yǎng)魚油中脂質(zhì)總量為768.8?mg/g，其中甘油三酯占比46.35%，磷脂占比52.38%，而實際提取魚油中脂質(zhì)總量為680.37?mg/g，磷脂占比29.17%，甘油三酯占比66.75%，兩者相比，細胞培養(yǎng)魚油中磷脂含量增加1.80倍。

21、本發(fā)明的有益效果為：

22、（1）通過優(yōu)化轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基可以實現(xiàn)大黃魚肌肉衛(wèi)星細胞快速成脂轉(zhuǎn)分化，利用微載體實現(xiàn)大規(guī)模細胞培養(yǎng)魚油的制備，為后續(xù)細胞培養(yǎng)脂肪及細胞培養(yǎng)肉的制備奠定基礎(chǔ)。

23、（2）本發(fā)明通過添加油酸、葡萄糖和維生素c以及物理調(diào)控（培養(yǎng)體系優(yōu)化）共同實現(xiàn)了制備高磷脂含量的細胞培養(yǎng)魚油，進一步改良了魚油的營養(yǎng)品質(zhì)。