一種篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種篩選具有高粘附腸道上 皮細胞能力乳桿菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB)是一類可以發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的 無芽孢革蘭氏陽性細菌，對人類的營養(yǎng)與健康具有重要的意義，如：緩解乳糖不耐受癥、改 善便秘和腹瀉、維持腸道微生態(tài)平衡、增強免疫功能、影響心血管疾病的發(fā)展和緩解過敏反 應等。粘附是益生乳酸菌實現(xiàn)生理功能的重要先決條件，只有成功的粘附在宿主腸道上皮 細胞才可以為益生乳酸菌在粘膜表面的增殖提供競爭優(yōu)勢。從而通過大量的生長繁殖而實 現(xiàn)長期調(diào)節(jié)宿主的生理代謝和影響腸道環(huán)境的目的，進而改善宿主的營養(yǎng)與健康水平。因 此，粘附能力也是益生菌篩選的重要指標之一。
[0003] 因此，乳酸菌粘附機制也成為了乳酸菌的研宄熱點之一。Camp等人（Infection and immunity，1985, 47 (1):332-334)在對雙歧桿菌粘附的研宄中發(fā)現(xiàn)細胞壁脂磷壁 酸（LTA)與其粘附能力具有密切的聯(lián)系。隨后一些學者（Applied and environmental microbiology, 1994, 60(12):4487-4494 ；Applied and environmental microbiolo gy，2013, 79(15) :4576-4585)先后發(fā)現(xiàn)胞壁表面蛋白、胞外分泌型蛋白也與乳桿菌粘附腸 道上皮細胞有關(guān)。但這些研宄均基于已經(jīng)得到了一株/幾株高粘附腸道上皮細胞能力的 乳酸菌。目前，對于高粘附腸道上皮細胞能力乳酸菌的篩選主要停留在對已經(jīng)篩選得到的 乳酸菌中，通過粘附模型測定候選菌株的粘附能力，進而篩選出粘附能力相對較高的乳酸 菌。這種方法不僅工作量大，而且只能從候選菌株中篩選出粘附能力相對較高的菌株，并不 能快速高效的篩選出一株/幾株與現(xiàn)在商業(yè)生產(chǎn)菌株粘附能力相當，甚至更好的乳酸菌菌 株。因此，目前還需要一種有效的方法篩選獲得高粘附腸道上皮細胞能力的乳酸菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施 方式。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本 部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0005] 鑒于上述和/或現(xiàn)有篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法中存在的問題， 提出了本發(fā)明。
[0006] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種篩選具有高粘附腸道上皮細胞能力乳酸菌的方 法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種 篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法，其包括，將含鹽濃度大于等于4%的自然發(fā)酵 食品置于帶玻璃珠的生理鹽水中，振蕩30min，然后使用生理鹽水按照體積比1:10進行連 續(xù)稀釋，取1〇_5、1〇_6、1〇_7、1〇_8四個稀釋梯度的菌液分別涂布在相應的選擇培養(yǎng)基上涂布、 分離乳桿菌，分離得到的乳桿菌純化菌株在30%滅菌甘油溶液中并在溫度-80°C的條件下 凍存。
[0008] 作為本發(fā)明所述的篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法的一種優(yōu)選方案， 其中：所述相應的選擇培養(yǎng)基為添加4% NaCl及溴甲酚紫的MRS瓊脂培養(yǎng)基。
[0009] 作為本發(fā)明所述的篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法的一種優(yōu)選方案， 其中：所述振蕩，是在80-100r/min的條件下振蕩30min。
[0010] 本發(fā)明通過選擇高鹽濃度的自然發(fā)酵食品作為樣品，從中分離得到了多個高耐 NaCl能力的乳桿菌，并通過大量多次試驗研宄證明，分離得到的乳桿菌具有高粘附腸道上 皮細胞的能力，并且這種能力與其耐受NaCl的能力正相關(guān)。這對篩選益生乳酸菌，對其益 生功能的進一步開發(fā)，及商品產(chǎn)業(yè)化都提供了基礎(chǔ)及有效途徑。
【具體實施方式】
[0011] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面通過本發(fā)明的具體 實施方式做詳細的說明。
[0012] 在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0013] 實施例1 :篩選乳桿菌
[0014] 1、樣品米集
[0015] 原始樣品采自邯鄲涉縣太行山脈附近和裕村、上馬村等地農(nóng)民自制的自然發(fā)酵泡 菜、醬菜及冬菜。用無菌三角瓶采集樣品，采集得到的樣品保存在溫度〇°C的條件下，采樣 48h內(nèi)進行樣品分析和乳酸菌的分離。
[0016] 2、從樣品中分離乳酸菌
[0017] IOg樣品置于帶玻璃珠的90mL生理鹽水中，振蕩30min，然后使用生理鹽水按照 體積比1:10進行連續(xù)稀釋。使用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的涂布平板法，將10-5、10-6、 10'KT8四個稀釋梯度的菌液0.1 mL分別涂布在以下三種培養(yǎng)基平板上：含有NaCl濃度為 4%及添加溴甲酚紫指示劑的MRS培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)乳桿菌的培養(yǎng)基），37°C培養(yǎng)48h。從 長有30-300個菌落的平板上分離單個菌落，用接種環(huán)隨機挑取其中的5-10個菌落在4% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，并在在相應的溫度下培養(yǎng)24h，然后在4% NaCl的MRS固體平板 上劃線。分離物連續(xù)劃線三次得到純的單菌落，然后進行本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的革 蘭氏染色與接觸酶試驗。將革蘭氏染色陽性、接觸酶實驗為陰性的菌株接入MRS液體培養(yǎng) 基中，37°C靜置培養(yǎng)24h，然后按照以培養(yǎng)基重量計2-4%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng) 基中，37°C靜置培養(yǎng)18-24h進行活化，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，得到活性良好的乳酸菌。其純化菌株 于30%滅菌甘油溶液中在溫度-80°C的條件下凍存。
[0018] 利用添加4% NaCl及溴甲酚紫的MRS瓊脂培養(yǎng)基上共分離出146個分離株。經(jīng) 過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、接觸酶試驗排除了 5個革蘭氏陰性，3個接觸酶陽性和6個酵母。 這樣，分離純化后得到了 132株乳桿菌。
[0019] 實施例2 :篩選得到的乳酸菌耐鹽實驗
[0020] 將_80°C甘油管保存的乳酸菌分別在MRS固體平板上劃線，37°C倒置培養(yǎng)至長出 單菌落；挑單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)12h后連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后即為預培養(yǎng) 液。
[0021] 上述制備的預培養(yǎng)液以2%接種量分別接種于鹽濃度分別為4%、6%、8%、10% NaCl及不含有NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)，每2h測一次吸光值，根據(jù)吸光值 繪制生長曲線。根據(jù)監(jiān)測在不同NaCl濃度下乳桿菌的生長曲線發(fā)現(xiàn)，分離純化得到的132 乳桿菌的NaCl耐受能力均大于等于4%，其中有21株乳桿菌耐受NaCl的能力高達10%。
[0022] 表1部分乳酸菌的耐鹽能力
[0023] Table I Ability of partly LAB to salt tolerance
[0024]
[0025] I)同一列不同的小寫字母分別代表差異顯著（p < 0. 05)。
[0026] 實施例3 :篩選得到的乳酸菌粘附腸道上皮細胞HT-29的能力
[0027] 1、細胞的復蘇、培養(yǎng)與凍存
[0028] 將HT-29細胞凍存管快速放入37°C水浴鍋中，溶化后800rpm離心5min，去上清 后用新鮮的培養(yǎng)液重懸細胞，使其均勻分散于培養(yǎng)瓶中，在5% 0)2和95%空氣的氣體條 件下37°C進行培養(yǎng)，復蘇時每48h更換培養(yǎng)液1次。待細胞生長良好時（70%融合），用胰 酶-EDTA溶液對HT-29細胞在溫度為37°C的條件下進行消化，1:3分瓶培養(yǎng)。凍存時在完 全培養(yǎng)液中加入10%亞甲基二楓（DMSO)，液氮保存。粘附實驗時將細胞消化后調(diào)整細胞濃 度為2 X IO5個/mL，接種于含有蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)至細胞長至融合度達80 %。
[0029] 2、粘附實驗
[0030] 5000rpm離心5min收集在相應培養(yǎng)基中生長的菌體；用生理鹽水洗滌菌體3次后 重懸菌體，并調(diào)節(jié)菌體濃度為IO8CFUAiL ;將上述菌懸液2mL加入含有長至單層的HT-29細 胞蓋玻片的6孔板中，于5% 0)2培養(yǎng)箱中37°C孵育2h ;孵育后用無菌PBS洗滌3次；0. 4% 多聚甲醛固定0. 5h后革蘭氏染色。
[0031] 3、粘附觀察及計數(shù)
[0032] 染色后，在油鏡下觀察細菌粘附的情況，并拍照。顯微鏡觀察時每個鹽濃度下隨機 取20個視野內(nèi)大約100個細胞，計算細胞所粘附的細菌數(shù)，每個細胞上平均被粘附的細菌 數(shù)即為粘附指數(shù)，每個鹽濃度做三個重復，實驗重復3次后進行數(shù)據(jù)分析。
[0033] 由表1可以看出，根據(jù)本說明書所述方法分離純化得到的乳酸菌的粘附能力與其 耐受NaCl的能力正相關(guān)，且根據(jù)本說明書所述方法分離純化得到的乳酸菌的粘附能力均 與本實驗所用商業(yè)對照菌株相當甚至高于對照菌株（相同耐受NaCl的菌株之間比較）。
[0034] 采用本發(fā)明方法分離得到的乳桿菌，其具有下述性質(zhì)：
[0035] (1)具有耐鹽性，耐受NaCl能力均超過6% ;
[0036] (2)具有尚粘附能力，且粘附腸道上皮細胞的能力與耐受NaCl能力正相關(guān)。
[0037] 應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳 實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù) 方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā) 明的權(quán)利要求范圍當中。
【主權(quán)項】
1. 一種篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法，其特征在于：包括， 將含鹽濃度大于等于4%的自然發(fā)酵食品置于帶玻璃珠的生理鹽水中，振蕩，然后使用 生理鹽水按照體積比1:10進行連續(xù)稀釋，取1〇_5、1〇_6、1〇_7、1〇_ 8四個稀釋梯度的菌液分別 涂布在相應的選擇培養(yǎng)基上涂布、分離乳桿菌，分離得到的乳桿菌純化菌株在30%滅菌甘 油溶液中并在溫度_80°C的條件下凍存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法，其特征在于： 所述相應的選擇培養(yǎng)基為添加4%NaCl及溴甲酚紫的MRS瓊脂培養(yǎng)基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法，其特征在于： 所述振蕩，是在80-100r/min的條件下振蕩30min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種篩選高粘附腸道上皮細胞能力乳桿菌的方法，其包括，將含鹽濃度大于等于4％的自然發(fā)酵食品置于帶玻璃珠的生理鹽水中，振蕩，然后使用生理鹽水按照體積比1:10進行連續(xù)稀釋，取各個稀釋梯度的菌液分別涂布在相應的選擇培養(yǎng)基上涂布、分離乳桿菌，分離得到的乳桿菌純化菌株在30％滅菌甘油溶液中并在溫度-80℃的條件下凍存。本發(fā)明對篩選益生乳酸菌，對其益生功能的進一步開發(fā)，及商品產(chǎn)業(yè)化都提供了基礎(chǔ)及有效途徑。
【IPC分類】C12Q1/04, C12N1/20, C12R1/225
【公開號】CN104928218
【申請?zhí)枴緾N201510385193
【發(fā)明人】趙山山, 郝光飛, 江利華, 林冬梅, 王斌, 張振國
【申請人】河北工程大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月30日