實踐所必需的。
[0047] 可用于本文所述肽綴合物和方法的載體蛋白包括當(dāng)給予受試者時可引起抗體產(chǎn) 生的任何蛋白質(zhì)，優(yōu)選免疫原性蛋白質(zhì)。所述載體蛋白和使載體蛋白與目標(biāo)肽綴合的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的，并已被用于所謂"綴合物疫苗"的生產(chǎn)。載體蛋白、連接基團(tuán)和綴合方 法的一些實例描述于以申請?zhí)朠CT/US2011/060318提交的PCT國際公開號W02012/065034， 其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。載體蛋白的一些非限制性實例包括腦膜炎奈瑟氏菌 外膜蛋白復(fù)合物（OMPC)、破傷風(fēng)類毒素蛋白、白喉毒素的衍生物（CRM197)、牛血清白蛋白 (BSA)、陽離子化BSA、鮑魚血藍(lán)蛋白（CCH)、乙型肝炎病毒（HBV)蛋白質(zhì)（例如表面抗原蛋 白（HBsAg)和HBV核心抗原蛋白）、匙孔慽血藍(lán)蛋白（KLH)、輪狀病毒衣殼蛋白、牛乳頭瘤病 毒LI蛋白（BPV LI)、人乳頭瘤病毒LI蛋白（HPV LI;例如、HPV 6、11或16型）、卵清蛋白 和流感血凝素（HA)蛋白，例如來自血凝素 A亞型H1-H17的HA蛋白質(zhì)。流感HA蛋白質(zhì)的代 表性序列包括 Hl (SEQ ID NO: 13)、H2 (SEQ ID NO: H)、H3 (SEQ ID NO: 1δ)、Η5 (SEQ ID NO: 16)和H7 (SEQ ID NO: 17)。用于本文所述免疫原性肽綴合物的載體蛋白，偶聯(lián) (綴合）技術(shù)和連接基團(tuán)的選擇盡在蛋白質(zhì)疫苗合成領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。
[0048] 載體蛋白經(jīng)由載體蛋白和目標(biāo)肽的反應(yīng)部位通過連接基團(tuán)綴合?？捎糜诰Y合的親 核官能團(tuán)是本領(lǐng)域眾所周知的（參見例如美國專利號5, 606, 030,其通過引用以其整體結(jié) 合到本文中）。例如，存在于氨基酸殘基上的伯胺基例如賴氨酸的ε氨基和蛋白質(zhì)N端氨 基酸的α氨基可用作綴合的官能團(tuán)。通常需要將載體蛋白的一個或多個伯胺基轉(zhuǎn)化為含 硫醇基的基團(tuán)（例如來自半胱氨酸或高半胱氨酸殘基）、親電子不飽和基團(tuán)例如馬來酰亞 胺基或鹵化基團(tuán)例如溴乙酰基，用于與硫醇基反應(yīng)肽綴合。任選，在血凝素 FIR肽或與肽連 接的接頭部分上的伯胺基可轉(zhuǎn)化為含硫醇基基團(tuán)，用于例如通過二硫鍵與載體蛋白上的硫 醇基（疏基）部分偶聯(lián)。
[0049] 可使用本領(lǐng)域已知的任何連接基團(tuán)和綴合方法使血凝素 FIR肽和載體蛋白綴合。 在一些實施方案中，綴合可以通過如下實現(xiàn)：例如，使用4-[Ν-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己 烷-1-甲酸琥珀酰亞胺酯（SMCC)、4-(Ν_馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-甲酸磺基琥珀 酰亞胺酯（sSMCC)、ε _[ ε -馬來酰亞胺基己酰氧基]-磺基琥珀酰亞胺酯（sEMCS)、雙偶 氮聯(lián)苯胺（BDB)、N-馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯（MBS)、戊二醛、1-乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDCI)或N-乙?；甙腚装彼崃騼?nèi)酯（NAHT)。
[0050] 在SMCC方法中，SMCC使半胱氨酸殘基的SH-基團(tuán)與載體蛋白上的賴氨酸殘基的氨 基交聯(lián)。在SMCC方法中，通過使SMCC與伯胺（例如載體蛋白的賴氨酸殘基上的伯胺）反 應(yīng)，首先激活載體蛋白。然后將所得的活化載體從任何過量的SMCC和其副產(chǎn)物中分離，并 加入含半胱氨酸的肽。半胱氨酸的硫醇基跨SMCC衍生化載體蛋白的馬來酰亞胺部分的雙 鍵加入，因此形成使載體與肽偶聯(lián)的共價硫鍵。如果血凝素 FIR肽不包括半胱氨酸殘基，則 應(yīng)將半胱氨酸殘基加入該肽中，優(yōu)選在N端或C端加入。如果血凝素 FIR肽的表位部分含 有半胱氨酸或如果在肽中有多于一個半胱氨酸基團(tuán)，則應(yīng)采用不改性半胱氨酸殘基的另一 種綴合技術(shù)。因為載體蛋白和肽之間的鍵不應(yīng)干擾肽的表位部分，所加入的半胱氨酸殘基 任選可通過包括一個或多個氨基酸殘基作為間隔區(qū)與血凝素 FIR肽分隔開。半胱氨酸、間 隔區(qū)殘基和與載體連接的修飾的SMCC -起構(gòu)成血凝素 FIR肽綴合物的連接基團(tuán)。
[0051] 肽與載體蛋白的另一種簡單偶聯(lián)可用碳二亞胺交聯(lián)劑例如1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)U-環(huán)己基-2-(2-嗎啉代乙基）碳二亞胺甲基對甲苯磺 酸酯（CMC)等使羧基與伯胺基共價連接來實現(xiàn)。該方法簡單，并提供允許針對許多可能表 位的抗體生成的相對隨機(jī)的定向。一個缺點是EDC偶聯(lián)可能導(dǎo)致一定量的聚合。這可降低 綴合物的溶解度，這可使材料處理復(fù)雜化。
[0052] 可使用其它偶聯(lián)劑以使FIR肽直接或通過連接基團(tuán)與載體蛋白綴合。例如，可以 使用異氰酸酯偶聯(lián)劑例如2-嗎啉代乙基胩；N-乙酰基高半胱氨酸硫內(nèi)酯，其可用于將硫醇 基加到載體蛋白（例如與馬來酰亞胺或溴乙?；倌芑碾呐悸?lián)的0MPC)上；或用于使半 抗原（潛在免疫原）與多肽和蛋白質(zhì)偶聯(lián)的任何其它劑，來實現(xiàn)綴合，其中許多在蛋白質(zhì)和 疫苗領(lǐng)域中是眾所周知的。
[0053] 非特異性交聯(lián)劑及其用途是本領(lǐng)域眾所周知的。所述試劑及其用途的實例包括與 戊二醛反應(yīng)；在有或沒有琥珀?；妮d體的混合物的情況下，與N-乙基-N'_(3-二甲基氨 基丙基）碳二亞胺反應(yīng)；糖基化取代基的高碘酸鹽氧化，接著在硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉 存在下與蛋白質(zhì)載體的游離氨基偶聯(lián)；非?；┒私z氨酸和蘇氨酸殘基的高碘酸鹽氧化形 成末端醛，所述醛然后可與胺或酰肼反應(yīng)產(chǎn)生席夫堿或腙，其可用氰基硼氫化物還原成仲 胺；芳族氨基的重氮化，接著偶聯(lián)在蛋白質(zhì)酪氨酸側(cè)鏈殘基上；與異氰酸酯反應(yīng)；或混合酐 的反應(yīng)。可以補(bǔ)充接頭，并用間隔區(qū)基團(tuán)（例如其它的氨基酸殘基、己二酸二酰肼等）使其 延長。
[0054] 用于使FIR肽與載體蛋白綴合的典型的間隔肽基團(tuán)包括與FIR肽連接的單一氨基 酸（例如，Cys)和短肽序列（即，短的非血凝素 FIR肽序列），例如，含賴氨酸的肽例如flag 標(biāo)簽序列DYKDDDDK (SEQ ID NO: 18)、含半胱氨酸的肽等。一些優(yōu)選的連接基團(tuán)包含硫鍵 (例如SMCC和相關(guān)偶聯(lián)方法中）。一些優(yōu)選的連接基團(tuán)包括下式I的4-(N-琥珀酰亞胺基 甲基環(huán)己烷-1-羰基：
其中式I中的Cys殘基通過其巰基側(cè)鏈與琥珀酰亞胺基部分結(jié)合和通過肽鍵結(jié)合FIR 肽的N端。任選，在Cys和FIR肽之間可包括1-5個氨基酸殘基的另外的間隔肽。式I的 環(huán)己基部分上的1-羰基通過酰胺鍵與載體蛋白上的伯胺結(jié)合。
[0055] 在一些實施方案中，肽綴合物包括與載體蛋白連接的單個血凝素 FIR肽，而在其 它實施方案中，兩個或更多個血凝素 FIR肽可與載體蛋白連接。
[0056] 另一方面，本發(fā)明提供對本文所述免疫原性肽綴合物的血凝素 FIR肽部分有特異 性（即能夠與之特異性和選擇性與之結(jié)合結(jié)合）和與流感病毒的HA2的FIR結(jié)合的治療性 單克隆抗體。所述治療性單克隆抗體包含來源于與本文所述免疫原性肽綴合物的FIR部分 特異性結(jié)合的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。治療性抗體可以是人抗體（例如自暴露于肽綴合 物的受試者的血清分離）、非人類抗體（例如自暴露于肽綴合物的非人類受試生物例如小 鼠、大鼠、兔、山羊或其它合適的生物分離）以及這類非人抗體的嵌合和人源化形式。
[0057] 當(dāng)給予（例如以治療有效劑量）暴露于流感病毒的受試者時，治療性單克隆抗體 抑制流感病毒-宿主細(xì)胞膜融合，并因此防止宿主細(xì)胞被流感病毒感染。這種抑制通過抗 體與流感病毒的HA蛋白的FIR區(qū)結(jié)合來實現(xiàn)。因此，本文所述治療性單克隆抗體具有與免 疫原性肽綴合物的血凝素 FIR肽部分相同或非常類似的治療機(jī)制（有關(guān)FIR肽治療性機(jī)制 的論述參見美國8, 222, 204)。
[0058] 本文所用術(shù)語"治療有效劑量"和其語法變化是指使得當(dāng)給予受試者時引起針對 流感病毒的特異性治療性抗體應(yīng)答的免疫原性肽綴合物的量，或足以防止或提供流感感染 的臨床降低的治療性抗體的量。給予受試者的劑量和劑量次數(shù)（例如單劑或多劑）會根據(jù) 包括以下的多個因素變化：給藥途徑、患者病況和特征（性別、年齡、體重、健康狀況、身材 大?。?、癥狀的程度、同期治療、治療頻率和所需效果、其所給予形式中綴合物或抗體的濃度 等。劑量范圍的調(diào)節(jié)和操控，以及確定個體中組合物的療效的體內(nèi)和體外方法，盡在醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。舉例來說，可使用在藥學(xué)上可接受的載體中包含肽綴 合物或治療性抗體的溶液的約1-100 mL溶液范圍的劑量。肽綴合物或治療性抗體會以約 0. 01 μ g/mL-約10 mg/mL范圍內(nèi)的濃度存在于溶液中?？梢阅c胃外（例如通過靜脈內(nèi)，腹 膜內(nèi)，皮下或肌內(nèi)注射或輸注）或跨粘膜（例如通過吸入霧化液體或粉狀組合物）給予肽 或抗體。
[0059] 本文所述治療性抗體籍以起作用的結(jié)合特異性和機(jī)制在響應(yīng)用傳統(tǒng)流感疫苗接 種時形成的抗體截然不同，所述傳統(tǒng)流感疫苗接種時形成的抗體通常干擾病毒與宿主細(xì)胞 的物理相互作用，并且通常是毒株特異性的，如通過每年重新配制季節(jié)性疫苗以與流通的 流感毒株相適應(yīng)的必要性所強(qiáng)調(diào)。相比之下，本文所述治療性抗體出乎意料地干擾病毒融 合過程，并且對不同的流感毒株（包括甲型流感和乙型流感兩者）有廣泛反應(yīng)性。
[0060] 優(yōu)選治療性單克隆抗體是人單克隆抗體、人源化單克隆抗體或嵌合單克隆抗體。 用于制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，如按常規(guī)從分離的天然抗體產(chǎn)生單克隆 抗體的商業(yè)公司。嵌合和人源化單克隆抗體和制備所述抗體的方法也是抗體領(lǐng)域眾所周 知的（參見例如，美國專利號 5, 824, 307、6, 800, 738、7, 070, 775、7, 087, 409、7, 456, 260 和 7, 807, 161，其每一個通過引用以其整體結(jié)合到本文中）。
[0061] 嵌合化過程包括將非人抗體的部分用來自人抗體的相應(yīng)部分（例如恒定區(qū)）置 換。完成該過程以防止人免疫系統(tǒng)攻擊作為外源蛋白質(zhì)的非人抗體。嵌合抗體一般保留非 人抗體的