到的來自水的峰的拉曼強(qiáng) 度與來自透明質(zhì)酸的峰的拉曼強(qiáng)度的比率計(jì)算出與透明質(zhì)酸濃度相關(guān)的數(shù)值。第二階段 是如下階段：使用平衡溶脹倍率已知的樣品，制作平衡溶脹倍率和與透明質(zhì)酸濃度相關(guān)的 數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒內(nèi)特定的微小范圍中的與透明質(zhì)酸濃度相關(guān) 的數(shù)值，計(jì)算出平衡溶脹倍率。更具體而言，由光學(xué)顯微鏡圖像指定交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆 粒中的0. 5~5μπι范圍的測定部分，由得到的光譜圖求出來自透明質(zhì)酸的C-H鍵的波數(shù) (2940cm 3相對于來自水的O-H鍵的波數(shù)（3420cm 3的拉曼強(qiáng)度比，可以通過下述式（1)而 計(jì)算。
[0044] 平衡溶脹倍率的計(jì)算值=[(Hi3hZUh)-標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距]/標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率·（1)
[0045] (H。H:3420cm 1 的拉曼強(qiáng)度、H c H:2940cm 1 的拉曼強(qiáng)度）
[0046] 交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒整體的平衡溶脹倍率通過對水系溶劑中（緩沖液中）處于 平衡溶脹狀態(tài)的凝膠顆粒進(jìn)行過濾而取出時(shí)的凝膠顆粒的體積與對該凝膠顆粒進(jìn)一步干 燥時(shí)的體積的倍率來表示。
[0047] 上述平衡溶脹倍率可以使用通過過濾去除水系溶劑（緩沖液）時(shí)的交聯(lián)透明質(zhì)酸 凝膠的濕潤重量與進(jìn)一步使之干燥時(shí)的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的重量比（Qw)和密度，通過下 述式⑵而算出。
[0048] 平衡溶脹倍率=1+ ( P / P 0) X (Qw-I) · (2)
[0049] ( P :交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的密度、P 0 :水系溶劑（緩沖液）的密度）
[0050] 對于通過過濾去除水系溶劑（緩沖液）的方法沒有特別的限定，可以適宜使用例 如使用了離心式過濾單元的離心過濾法、使用了膜濾器的減壓過濾法等。
[0051] 平衡溶脹倍率受到溶劑的鹽濃度、pH、溫度、溶脹時(shí)間等影響，所以用NaCl濃度為 0. 9wt %的IOmM磷酸緩沖生理鹽水（pH6. 0)，5°C下使之溶脹1天，到達(dá)平衡溶脹狀態(tài)之后進(jìn) 行測定。
[0052] 需要說明的是，根據(jù)核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的組成和平衡溶脹倍率的測定 法，拐點(diǎn)處的平衡溶脹倍率可以為20~80的范圍（特別為40~60的范圍，50左右）。
[0053] 對于核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒，從表面起至深度SOOnm的探針壓入力為20nN 以下。此處，深度方向優(yōu)選為從表面到中心（重心）的方向。另外，探針壓入力是指作為使 用掃描型探針顯微鏡測定的彈性而測定的。即，將水系溶劑中（緩沖液中）處于平衡溶脹 狀態(tài)的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒置于試樣臺，由上方將前端安裝有IOym直徑的（球形）玻 璃顆粒的膠體探針從交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠表面壓入至深度800nm，作為施加到探針的力（探 針壓入力）而測定。
[0054] 壓入力優(yōu)選為IOnN以下。壓入力為20nN以下是指核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒 表面的彈性低，即便在向生物體內(nèi)給予的情況下，在生物體內(nèi)也不易被識別為異物，所以炎 癥作用被抑制，從而能夠確保與透明質(zhì)酸溶液同樣高的生物體親和性。
[0055] 從拐點(diǎn)至表面的點(diǎn)即殼的平衡溶脹倍率優(yōu)選為40以上，更優(yōu)選為50以上，進(jìn)一步 優(yōu)選為65以上。通過使核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的殼的平衡溶脹倍率為上述范圍，能 夠確保該顆粒的表面為接近透明質(zhì)酸溶液的柔軟度，所以能夠得到在生物體內(nèi)不易被識別 為異物、異物反應(yīng)被降低至與透明質(zhì)酸溶液相同程度的、具有高的生物體親和性的顆粒。由 以上這樣的觀點(diǎn)可知，上述平衡溶脹倍率特別優(yōu)選為75以上。需要說明的是，殼的平衡溶 脹倍率顯示出高于上述拐點(diǎn)的平衡溶脹倍率的值。
[0056] 從拐點(diǎn)至前述表面的點(diǎn)的、核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的厚度方向的距離優(yōu)選 為5 μπι以上。該距離為針對核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的至少1處以上從中心到表面 依次測定特定微小范圍中的平衡溶脹倍率時(shí)的、從前述拐點(diǎn)至前述表面的點(diǎn)的移動距離即 可。通過殼的厚度為上述范圍，核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒在生物體內(nèi)不易被識別為異 物，能夠確保與透明質(zhì)酸溶液同樣高的生物體親和性。另外，給予該凝膠顆粒之后，在關(guān)節(jié) 內(nèi)等平衡溶脹倍率高的殼表面部分即便分解，也會從內(nèi)部新生成平衡溶脹倍率高的殼表面 部分，所以能夠長期地維持與透明質(zhì)酸溶液同樣高的生物體親和性。由以上的觀點(diǎn)可知，上 述殼的厚度優(yōu)選為10 μπι以上。
[0057] 對于核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的殼的厚度，也可以通過僅對核進(jìn)行了染色的 核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的顯微鏡觀察、作為外殼的透明部分的厚度方向的長度進(jìn)行 測定。具體而言，用數(shù)字顯微鏡對被染色的核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠的圖像進(jìn)行拍攝，對每 1個(gè)凝膠顆粒測定1點(diǎn)以上從該凝膠顆粒表面至核與殼的邊界的距離。對于凝膠顆粒100 個(gè)進(jìn)行該測定，可以由其平均值算出殼的厚度。
[0058] 染色也可以通過能夠?qū)ν该髻|(zhì)酸染色的公知的任意方法進(jìn)行，但優(yōu)選用亞甲基藍(lán) 或吖啶橙進(jìn)行染色。進(jìn)而，由于容易判斷透明的殼與水系溶劑的邊界，所以更優(yōu)選只將水系 溶劑用苯胺黑等進(jìn)行負(fù)染色。具體而言，對于水系溶劑中（緩沖液中）處于平衡溶脹狀態(tài) 的核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒添加亞甲基藍(lán)水溶液，充分?jǐn)嚢瓒M(jìn)行染色。接著，將樣品 搭載于試樣臺，在即將利用數(shù)字顯微鏡進(jìn)行觀察之前，添加苯胺黑水溶液，由此能夠進(jìn)行負(fù) 染色。
[0059] 接著，對于制造核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的方法進(jìn)行說明。
[0060] 本發(fā)明的實(shí)施方式中，對于透明質(zhì)酸，無論是從動物組織提取的還是用發(fā)酵法制 造的，可以不問其來源地使用。
[0061] 發(fā)酵法中使用的菌株優(yōu)選為從自然界中分離得到的鏈球菌屬等具有透明質(zhì)酸生 產(chǎn)能力的微生物、或者日本特開昭63-123392號公報(bào)中記載的馬鏈球菌（Streptococcus equi)FM-100(微工研菌寄第9027號）、日本特開平2-234689號公報(bào)中記載的馬鏈球菌 FM-300 (微工研菌寄第2319號）這樣的以高收率生產(chǎn)穩(wěn)定的透明質(zhì)酸的變異株。
[0062] 透明質(zhì)酸可以以例如鈉、鉀或鋰鹽這樣的本技術(shù)領(lǐng)域中允許的鹽的形態(tài)使用。
[0063] 交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆?？梢允褂猛该髻|(zhì)酸自交聯(lián)的具有酯結(jié)構(gòu)的自交聯(lián)透明質(zhì) 酸凝膠顆粒。
[0064] 自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒可以如下得到：使透明質(zhì)酸與透明質(zhì)酸濃度為5質(zhì)量％ 以上的水以及與透明質(zhì)酸的羧基等摩爾以上的酸成分共存，在低溫下保持該共存狀態(tài)。
[0065] 對于與透明質(zhì)酸共存的酸，沒有特別的限定，可以使用公知的任意種酸，優(yōu)選為比 透明質(zhì)酸強(qiáng)的酸，更優(yōu)選為無機(jī)酸。進(jìn)一步優(yōu)選鹽酸、硝酸或硫酸，其中，特別優(yōu)選處理性等 優(yōu)異的硝酸。對于共存的酸的量，沒有特別的限定，可以為與透明質(zhì)酸的羧基等摩爾以上的 酸成分的量。對于與透明質(zhì)酸共存的酸，優(yōu)選以含有透明質(zhì)酸為整體的15質(zhì)量％以上、優(yōu) 選20質(zhì)量％以上且40質(zhì)量％以下的量保持。該保持可以為-30°C以上且25°C以下的溫度 下1小時(shí)~20天的任意期間。特別優(yōu)選在-25°C以上且_5°C以下的溫度下保持1天~15 天。透明質(zhì)酸和與透明質(zhì)酸共存的酸的混合優(yōu)選如下進(jìn)行：向共存的酸中以成為整體的15 質(zhì)量％以上、優(yōu)選20質(zhì)量％以上的方式加入透明質(zhì)酸，使共存的酸為均勻的狀態(tài)。除此以 外，也可以以成為整體的15質(zhì)量％以上、優(yōu)選20質(zhì)量％以上的方式浸漬與透明質(zhì)酸共存的 酸，進(jìn)而也可以對以低濃度調(diào)節(jié)的透明質(zhì)酸的酸性水溶液進(jìn)行濃縮以使透明質(zhì)酸成為整體 的15質(zhì)量％以上、優(yōu)選20質(zhì)量％以上。
[0066] 得到的自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒在懸浮液中的濃度例如可以如下進(jìn)行定量。首 先，用蒸餾水對自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠懸浮液進(jìn)行稀釋，添加氫氧化鈉水溶液，在室溫下進(jìn)行 靜置，由此將自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的酯鍵水解，從而溶解。接著，向該溶液中添加鹽酸 進(jìn)行中和之后，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的咔唑硫酸法對葡萄糖醛酸濃度進(jìn)行定量。由該 葡萄糖醛酸濃度并將已知濃度的透明質(zhì)酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而能夠計(jì)算出自交聯(lián)透明質(zhì)酸 凝膠顆粒在懸浮液中的濃度。
[0067] 作為核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的制造方法，可列舉出：將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠 顆粒的表面部分的交聯(lián)結(jié)構(gòu)部分溶解并軟化從而殼化的表面處理法；或者，在該顆粒的表 面形成軟的殼的殼合成法。通過這樣的制造方法得到的核殼型交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒由于 在生物體內(nèi)不易被識別為異物，所以能夠抑制炎癥作用，并且能夠確保與透明質(zhì)酸溶液同 樣高的生物體親和性。
[0068] 上述表面處理法是使之軟化而殼化的方法，即，通過能夠特異地分解透明質(zhì)酸的 交聯(lián)結(jié)構(gòu)的化學(xué)處理，將交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的表面部分的交聯(lián)部分地切斷，降低透明 質(zhì)酸的交聯(lián)密度，由此增加平衡溶脹倍率。由此，能夠使交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒形成核殼結(jié) 構(gòu)。透明質(zhì)酸的交聯(lián)結(jié)構(gòu)與能夠特異地分解的化學(xué)處理的組合是任意的，可列舉出例如：透 明質(zhì)酸的自交聯(lián)的酯結(jié)構(gòu)與利用堿性物質(zhì)的處理的組合。利用該組合的核殼型交聯(lián)透明質(zhì) 酸凝膠顆粒的制造方法是如下方法：以自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒作為原料，用酸性溶液使 之溶脹之后，在水與水溶性有機(jī)溶劑的混合液中，使該凝膠顆粒的表面與堿性物質(zhì)接觸。堿 性物質(zhì)由自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒的表面向內(nèi)部滲透，同時(shí)將酯鍵分解，從而增加經(jīng)滲透 部分的平衡溶脹倍率。
[0069] 對于使自交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠顆粒溶脹的酸性溶液，沒有特別的限定，可以使用公 知的任一種酸，優(yōu)選