本發(fā)明屬于化合物組合庫的個(gè)體定量分析方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對固相合成化合物組合庫個(gè)體定量的拉曼光譜分析方法及其用途。

背景技術(shù)：

固相合成法，通常是指連接在固相載體(如樹脂等)上的活性官能團(tuán)與溶解在有機(jī)溶劑中的試劑之間的反應(yīng)。此方法通常使用過量的液相反應(yīng)物，反應(yīng)完畢后可通過快速抽濾、洗滌完成產(chǎn)物的純化，避免了液相合成中重結(jié)晶或色譜分離等步驟，可防止產(chǎn)物在分離純化時(shí)的大量損失。固相合成法通過如上步驟的反復(fù)多次運(yùn)用，廣泛用于化合物組合庫的合成，尤其是多肽的合成。

然而，隨著反應(yīng)步驟的增加，組合庫不斷增大，固相載體上化合物的產(chǎn)率(負(fù)載)不能被準(zhǔn)確了解。對個(gè)體載體上的產(chǎn)率進(jìn)行定量對于組合庫合成的質(zhì)量監(jiān)控有著重要的影響。

通常固相合成中對反應(yīng)的監(jiān)控，使用顏色反應(yīng)法，或洗脫后用薄層層析(tlc)板監(jiān)測。但是，顏色反應(yīng)或洗脫后tlc板監(jiān)測通常檢測的是反應(yīng)物的消失，不能檢測產(chǎn)物的出現(xiàn)。為了對產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，傳統(tǒng)的定量方法是收集足夠多的固相載體，然后進(jìn)行滴定檢測，通常方法為：以樹脂珠上的固相合成為例，從樹脂珠上裂解下來足夠的產(chǎn)物化合物以供準(zhǔn)確滴定使用。此方法需要消耗大量的樹脂珠，且無法檢測單個(gè)樹脂珠。

現(xiàn)有的單珠檢測技術(shù)有紅外光譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和熒光共聚焦光譜法。紅外光譜法是一種吸收光譜，通常觀察某個(gè)官能團(tuán)特征峰的出現(xiàn)或消失，用來定量具有一定難度。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用需要預(yù)先將反應(yīng)物洗脫，此方法可以檢測產(chǎn)物的分子量，但是不能準(zhǔn)確定量樹脂珠上產(chǎn)物的產(chǎn)率。熒光共聚焦光譜雖然比較靈敏，但是熒光的強(qiáng)度由于各種因素的影響穩(wěn)定性不強(qiáng)，無法提供精確的定量檢測結(jié)果。

拉曼光譜是一種成熟的非損傷性化學(xué)物質(zhì)檢測方法。此方法快速，準(zhǔn)確，樣品制備方法簡單。由于它研究的是化合物分子經(jīng)光照后產(chǎn)生的散射，此散射光反映的是化合物官能團(tuán)的振動(dòng)頻率和轉(zhuǎn)動(dòng)頻率。當(dāng)測量的條件(比如樣品制備、光學(xué)設(shè)置、聚焦位置等)不變時(shí)，拉曼信號非常穩(wěn)定，并且檢測的過程并不破環(huán)樣品；但由于拉曼信號通常較弱，檢測的靈敏度較低限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，盡管拉曼信號通常較弱，但是選擇具有炔基、氰基等官能團(tuán)的化合物作為信號分子，運(yùn)用其較強(qiáng)的振動(dòng)散射可獲得較強(qiáng)的拉曼信號；同時(shí)共聚焦光譜運(yùn)用高功率的激光聚焦于極小的體積，使得拉曼信號大幅度增強(qiáng)，因此微量的樣品即可完成檢測。

基于上述分析，本發(fā)明可以解決現(xiàn)有單珠檢測技術(shù)的不足，為化合物組合庫的固相合成提供了單個(gè)固相載體上化合物定量監(jiān)測的解決方案，采用的方法為一種對固相合成化合物組合庫的個(gè)體定量的拉曼光譜分析方法。所述拉曼光譜分析方法簡單可行，定量準(zhǔn)確，時(shí)間快速，價(jià)格適中，并且可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量檢測。其用途包括對固相合成產(chǎn)物官能團(tuán)的定量分析、對固相合成組合庫中化合物個(gè)體的產(chǎn)率分析，以及對固相合成化合物組合庫的產(chǎn)率分布分析與質(zhì)量監(jiān)測。

本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種對固相合成化合物組合庫個(gè)體定量的拉曼光譜分析方法，所述方法包括如下步驟：

1)合成與選擇拉曼信號分子；

2)將拉曼信號分子與待測化合物組合庫的固相個(gè)體載體進(jìn)行化學(xué)連接；

3)通過拉曼光譜儀，檢測步驟2)得到的化合物組合庫的固相個(gè)體載體上的拉曼信號。

根據(jù)本發(fā)明，所述的拉曼信號分子選自在2000-2500cm^-1波數(shù)內(nèi)具有強(qiáng)拉曼信號的分子；優(yōu)選為雙芳香環(huán)取代的二炔、單芳香環(huán)取代的二炔、單芳香環(huán)取代的單炔、氰基取代的芳香化合物、二炔的取代化合物中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明，所述的化合物組合庫選自多肽組合庫。優(yōu)選地，所述多肽為氨基酸多肽或類多肽。

根據(jù)本發(fā)明，所述的化合物的組合庫以樹脂珠為固相載體，以氨基酸為原料，用混合-裂分的組合方法，采用酰胺縮合反應(yīng)制備得到。

根據(jù)本發(fā)明，所述樹脂珠選自自身有強(qiáng)拉曼信號的聚合物樹脂，所述聚合物樹脂在500-2000cm^-1波數(shù)具有強(qiáng)拉曼信號。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的聚合物樹脂在800-1500cm^-1波數(shù)具有強(qiáng)拉曼信號。更優(yōu)選地，所述聚合物樹脂選自聚苯乙烯樹脂，還更優(yōu)選地，所述聚苯乙烯樹脂珠選自末端帶有氨基的tentalgel樹脂和末端帶有氨基的rinkamide樹脂。

本發(fā)明中，所述的tentagel樹脂和rinkamide樹脂在1002cm^-1波數(shù)具有強(qiáng)拉曼信號。

本發(fā)明中，所述多肽的拉曼信號在500-2000cm^-1范圍很復(fù)雜，但是在波數(shù)范圍介于2000-2500cm^-1之間時(shí)沒有干擾信號，只有上述的拉曼信號分子的官能團(tuán)有較強(qiáng)的拉曼散射峰，所以本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)確定以2000-2500cm^-1為被測拉曼信號區(qū)間，此時(shí)干擾少，測量精準(zhǔn)。

根據(jù)本發(fā)明，在步驟2)中，所述化學(xué)連接為拉曼信號分子與待測的多肽化合物進(jìn)行連接反應(yīng)；優(yōu)選地，所述連接反應(yīng)為耦合反應(yīng)；還優(yōu)選地，所述耦合反應(yīng)為酰胺縮合反應(yīng)，更優(yōu)選地，所述化學(xué)連接是拉曼信號分子中的羧基與所述化合物中的氨基發(fā)生化學(xué)鍵合反應(yīng)形成酰胺鍵連接。

根據(jù)本發(fā)明，所述聚苯乙烯樹脂上的末端氨基通過與氨基酸中羧基的酰胺縮合，制備得到所述多肽的組合物庫。

根據(jù)本發(fā)明，所述縮合反應(yīng)依次將氨基酸偶聯(lián)到所述聚合物樹脂珠上形成肽鏈。

根據(jù)本發(fā)明，所述氨基酸選自能與所述樹脂珠發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)的任一種氨基酸，例如丙氨酸(ala)、纈氨酸(val)、亮氨酸(leu)、異亮氨酸(ile)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)中的一種或多種。

本發(fā)明中，所述的混合-裂分組合方法是一種基于樹脂珠上化合物合成的方法，指的是：一定數(shù)量的載體被分成相等的若干部分，然后各部分獨(dú)自與不同的起始單體原料(如氨基酸)反應(yīng)；反應(yīng)后，樹脂的各部分又重新合并、混勻，再被分成若干部分，進(jìn)一步重復(fù)上述系列反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明，在步驟3)中，所述拉曼檢測儀為現(xiàn)有技術(shù)已知的任一種拉曼檢測儀，其中優(yōu)選地，所述拉曼檢測儀具有共聚焦功能。

本發(fā)明中，因?yàn)槔盘柕慕^對強(qiáng)度受每一次具體測量環(huán)境(參數(shù)如測量溫度，激光強(qiáng)度，聚焦位置，樹脂珠聚合物的溶脹度等)的影響，重復(fù)性不好。但是在同一次測量中，每一個(gè)樹脂珠載體上待測化合物的拉曼信號與樹脂珠聚合物載體本身的拉曼信號之比是確定的，因此所述聚合物樹脂珠載體本身的拉曼信號可作為內(nèi)標(biāo)，測量兩者的相對比值可避免測量環(huán)境波動(dòng)所造成的干擾。

根據(jù)本發(fā)明，所述拉曼光譜分析方法還包括如下步驟：

4)通過拉曼檢測儀，分析拉曼信號分子的信號強(qiáng)度與聚合物樹脂珠載體的拉曼信號強(qiáng)度的比值，定量分析所述待測化合物的基團(tuán)濃度。

本發(fā)明中，由于所述組合庫的每一個(gè)樹脂珠載體上待測化合物的拉曼信號相比于樹脂珠聚合物載體的拉曼信號是確定的。因此，在同一次測量的圖譜中，通過計(jì)算可以得出拉曼信號分子的信號強(qiáng)度與聚合物樹脂珠載體的拉曼信號強(qiáng)度的比值；此比值與樹脂珠載體上被測化合物的基團(tuán)含量成線性關(guān)系，從而可以利用這個(gè)比值定量分析所述固相合成化合物組合庫中個(gè)體載體上產(chǎn)物的濃度及產(chǎn)率。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種對固相合成化合物組合庫的檢測方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光譜分析方法。

本發(fā)明還提供上述對固相合成化合物組合庫中化合物的拉曼光譜分析方法的用途，其特征在于，所述用途包括對固相合成產(chǎn)物官能團(tuán)的定量分析檢測。

根據(jù)本發(fā)明，所述官能團(tuán)為氨基，還可以為羥基、羧基、巰基等其它官能團(tuán)。

本發(fā)明還提供一種對固相合成組合庫中化合物的產(chǎn)率分析方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光譜分析方法。

優(yōu)選地，分析單個(gè)樹脂珠和平面陣列、微陣列上某個(gè)化合物的定量產(chǎn)率。

本發(fā)明還提供一種對固相合成化合物組合庫的產(chǎn)率分布分析方法，其特征在于，所述方法包括使用前述的拉曼光譜分析方法。

該產(chǎn)率分布分析方法可以用于對固相合成化合物組合庫(樹脂、平面陣列和微陣列等)進(jìn)行自動(dòng)化高通量的質(zhì)量監(jiān)測，為后續(xù)高通量的藥物篩選提供合格的組合庫。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明提供了一種對固相合成化合物組合庫的個(gè)體定量的拉曼光譜分析方法及其用途，所述方法使用在2000-2500cm^-1波數(shù)內(nèi)具有強(qiáng)拉曼信號的分子作為拉曼信號源，同時(shí)此類分子的信號不受其他官能團(tuán)的影響，位于拉曼安靜區(qū)域，故而有效解決了其它拉曼信號帶來的影響。

2.本發(fā)明方法中的拉曼信號分子與目標(biāo)化合物(組合物庫中的個(gè)體化合物)的連接反應(yīng)效率高，可達(dá)95％以上；所述分析方法中，得到的目標(biāo)化合物的固相合成產(chǎn)率與相對拉曼信號強(qiáng)度成正比；此外，通過對組合庫中大量單個(gè)固相載體的表征，可以得到組合庫的化合物產(chǎn)率分布圖，其定量數(shù)據(jù)包括產(chǎn)率的最大峰值和均一性(分布寬度)等指標(biāo)。

3.本發(fā)明的拉曼光譜分析方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)由于拉曼散射的信號和熒光信號相比非常微弱(約為熒光信號的10^-6)，而且峰比較雜亂，但本發(fā)明通過選用在2000-2500cm^-1波數(shù)內(nèi)具有強(qiáng)拉曼信號官能團(tuán)的分子；此類分子的信號強(qiáng)并且信號位于拉曼安靜區(qū)域，有效解決了其它拉曼散射帶來的影響。據(jù)此挑選出具有特征峰的拉曼信號分子，信號峰能夠避免其他基團(tuán)雜峰的干擾，得到準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。

2)拉曼光譜用于定量與許多其它的光譜技術(shù)不同，它是單光束零背景測量，因此受測量環(huán)境的影響，聚焦位置不同，照射激光強(qiáng)度不同，樹脂珠的大小不同等外部測量環(huán)境會(huì)導(dǎo)致拉曼信號的絕對強(qiáng)度不能重復(fù)。而本發(fā)明鑒于大多數(shù)樹脂材料中都含有聚苯乙烯，聚苯乙烯在1002cm^-1波數(shù)處有一個(gè)非常強(qiáng)的特征峰；在圖譜中，選擇樹脂中的聚苯乙烯作為內(nèi)標(biāo)，只要測量拉曼信號分子的信號與聚苯乙烯信號的比值，就可以避免外部測量環(huán)境的干擾。

3)由于鍵合反應(yīng)的效率需要很高，必須驗(yàn)證固相反應(yīng)的拉曼信號分子上羧基與不同氨基酸上氨基固相縮合反應(yīng)的效率達(dá)到測量要求。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的拉曼光譜分析方法優(yōu)選適用范圍為測量脂肪伯胺和環(huán)狀二級脂肪胺，例如脂肪伯胺上的氨基即使有很大的空間位阻(如2-氨基異丁酸)，對測量的影響也很小。

4)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的方法中拉曼分子的信號強(qiáng)度與樹脂珠上的氨基濃度具有良好的線性關(guān)系。例如在tentagel樹脂上，即使化合物負(fù)載只有樹脂起始負(fù)載的2％，拉曼分子的信號仍然可被準(zhǔn)確檢測到。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1所述化合物的拉曼光譜。

圖2為實(shí)施例2中將帶有羧基的拉曼信號分子，通過酰胺縮合反應(yīng)，鍵合到帶有氨基的tentagel樹脂珠上后，聚焦在樹脂珠中心得到的拉曼光譜。

圖3為實(shí)施例3中聚焦樹脂珠的不同z軸位置、不同x、y位置的顯微鏡明場成像。

圖4為實(shí)施例5中帶有氨基的tentagel樹脂珠上鍵合丙氨酸后再鍵合拉曼信號分子的信號與基團(tuán)濃度線性關(guān)系圖。

圖5為實(shí)施例5中帶有氨基的rinkamide樹脂珠上鍵合丙氨酸后再鍵合拉曼信號分子的信號與基團(tuán)濃度線性關(guān)系圖。

圖6為實(shí)施例6中基于100個(gè)隨機(jī)樹脂珠計(jì)算所得的多個(gè)合成多肽(有確定氨基酸序列)的百分比負(fù)載(產(chǎn)率)的柱狀分布圖及其比較。

圖7為實(shí)施例7中基于100個(gè)隨機(jī)樹脂珠計(jì)算所得的合成多肽組合庫的百分比負(fù)載(產(chǎn)率)的柱狀分布圖。

圖8為實(shí)施例8中多肽化合物庫的產(chǎn)率分布及肽鏈解碼。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1.拉曼信號分子的選取

將4種具有代表性的拉曼信號分子4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯，4-(乙炔基)苯甲酸，4-氰基苯甲酸和2-丁炔酸，溶解在n,n’-二甲基甲酰胺(dmf)中形成0.1mol/l的溶液，取10微升溶液放到玻璃底的培養(yǎng)皿中。本測試中由于4-(苯二炔基)苯甲酸不溶于dmf，用可溶于dmf的4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯代替4-(苯二炔基)苯甲酸說明其拉曼信號的強(qiáng)度。將拉曼光譜儀的激光聚焦在距離玻璃底面上方10微米的地方。每一個(gè)樣品平行測量5次，每次測量時(shí)間2秒。

圖1給出了實(shí)施例1所述化合物的拉曼光譜圖?？梢钥闯?，4個(gè)化合物對應(yīng)的拉曼信號強(qiáng)度為：4-(苯二炔基)苯甲酸甲酯(～2232cm^-1)>4-(乙炔基)苯甲酸(～2115cm^-1)>4-氰基苯甲酸(～2244cm^-1)>2-丁炔酸(峰值很小，可忽略)。其分別對應(yīng)的拉曼信號官能團(tuán)為二芳香取代二炔基(ar-c≡c-c≡c-ar)、乙炔基芳香化合物(ar-c≡c-h)、芳香腈類化合物(ar-c≡n)和脂肪族取代的單炔類化合物(ar-c≡c-cooh)。由此說明，在2000-2500cm^-1波數(shù)內(nèi)，二芳香取代二炔化合物的信號峰(～2232cm^-1)最強(qiáng)，其強(qiáng)度順序是二芳香取代二炔>芳香取代單炔化合物>芳香氰基>脂肪族取代的單炔。

從上述分析結(jié)果可知，4-(苯二炔基)苯甲酸作為拉曼信號分子是理想的選擇。同時(shí)4-(苯二炔基)苯甲酸合成的步驟也較簡單，原料價(jià)格較經(jīng)濟(jì)。

實(shí)施例2.拉曼信號分子與待測樹脂珠的鍵合及測量

將100毫克市售的末端為氨基的tentagel樹脂(130微米，0.29mmol/g)，浸泡在dmf中4個(gè)小時(shí)，將3倍當(dāng)量的4-(苯二炔基)苯甲酸，3倍當(dāng)量的1-羥基苯并三唑(hobt)，3.3倍當(dāng)量的n,n’-二異丙基碳二亞胺(dic)溶解于dmf中，形成0.2mol/l的羧酸活化物溶液，搖蕩5分鐘后加入到樹脂中進(jìn)行反應(yīng)，再搖蕩2個(gè)小時(shí)。用茚三酮測試檢驗(yàn)，當(dāng)成陰性時(shí)，表示反應(yīng)已經(jīng)完全，將反應(yīng)液過濾除去，樹脂分別用dmf洗3次，甲醇洗3次，dmf洗3次。將得到的樹脂懸浮在dmf中，取10微升的樹脂懸浮液于玻璃底的培養(yǎng)皿中。將拉曼光譜儀的激光聚焦在樹脂珠的中心。每一個(gè)樣品平行測量5次，每次測量時(shí)間2秒。

將其它的拉曼信號分子4-(乙炔基)苯甲酸、4-氰基苯甲酸和2-丁炔酸用同樣的步驟鍵合到樹脂上即得到含有相對應(yīng)的拉曼信號分子的樹脂。用上述的同樣方法進(jìn)行拉曼光譜測定。

圖2給出了實(shí)施例2制備所得帶有拉曼信號分子的樹脂珠的拉曼光譜。從中可知，在樹脂上，4-(苯二炔基)苯甲酰胺的信號比4-(乙炔基)苯甲酰胺、4-氰基苯甲酰胺和2-丁炔酰胺明顯更強(qiáng)。拉曼信號分子的拉曼信號越強(qiáng)，在被測氨基濃度較低的時(shí)候會(huì)使定量更加精確，因此4-(苯二炔基)苯甲酸作為拉曼信號分子是較理想的選擇。

實(shí)施例3.驗(yàn)證本發(fā)明方法的穩(wěn)定性和可靠性

為了驗(yàn)證本發(fā)明所述檢測方法的可靠性和可重復(fù)性，從上述實(shí)施例2得到的樹脂珠中隨機(jī)挑選5個(gè)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

a.將激光聚焦在每一個(gè)樹脂珠的水平平面中心，在z軸上從低到高選取5個(gè)不同位置(如圖3a)。

圖3a為在每一個(gè)樹脂珠的水平平面中心，在z軸上從低到高選取5個(gè)不同位置的明場圖像。

表1給出拉曼分子的信號強(qiáng)度2232cm^-1和樹脂苯乙烯的信號強(qiáng)度1002cm^-1的比值。

表1.在z方向上5個(gè)不同聚焦位置上測得的相對拉曼強(qiáng)度

由上表可知，聚焦在樹脂珠x、y平面上的不同區(qū)域測得的拉曼信號強(qiáng)度是一致的。

b.將激光聚焦在每一個(gè)樹脂珠的z軸中心，在水平平面上選取9個(gè)不同位置(如圖3b)。

圖3b為在每一個(gè)樹脂珠的z軸中心，在水平平面上從低到高選取9個(gè)不同位置的明場圖像。

表2為拉曼分子的信號強(qiáng)度2232cm^-1和樹脂苯乙烯的信號強(qiáng)度1002cm^-1的比值。

表2.在x、y平面上9個(gè)不同聚焦位置上測得的相對拉曼強(qiáng)度

由上表可知，聚焦在樹脂珠x、y平面上的不同位置測得的拉曼信號強(qiáng)度是一致的。結(jié)合表1的結(jié)果可知，測量位置對信號的影響很小，可以忽略不計(jì)。

從上述結(jié)果可以看出，在采用了內(nèi)標(biāo)-樹脂珠本身的聚苯乙烯特征拉曼峰(1002cm^-1)后，測量得到的相對拉曼強(qiáng)度比值在不同的測量位置重現(xiàn)性較好，這表明樹脂珠的鍵合非常均勻，拉曼信號分子均勻分布在樹脂珠的不同部位，測量時(shí)聚焦在樹脂珠的不同部位，得到的測量結(jié)果穩(wěn)定性和可靠性都很好。

實(shí)施例4.不同氨基酸和拉曼信號分子鍵合的產(chǎn)率比較

由于鍵合反應(yīng)的效率需要很高，必須驗(yàn)證拉曼信號分子上的羧基與不同氨基酸的氨基固相縮合反應(yīng)的效率是否達(dá)到測量要求。為驗(yàn)證此發(fā)明對不同種類氨基酸氨基的適用范圍，選取11種被9-芴甲氧羰基(fmoc)保護(hù)的氨基酸，連接到tentagel樹脂上，將氨基酸脫保護(hù)后，用本發(fā)明方法進(jìn)行測量。

表3給出了拉曼信號分子與不同氨基酸鍵合反應(yīng)的效率。

表3.連接在tentagel樹脂珠上的不同氨基酸被拉曼信號分子標(biāo)記后測得的相對拉曼信號強(qiáng)度(與樹脂珠氨基直接被標(biāo)記后對比)

其中，3-abz:3-氨基苯甲酸；aib:α-氨基異丁酸；ala:丙氨酸；cys(mbzl):s-(4-甲基芐基)-半胱胺酸；gln:谷氨酰胺；leu:亮氨酸；lys(ac):nε-乙?；?賴氨酸；ac-lys:nα-乙?；?賴氨酸；pro:脯氨酸；tyr(t-bu):o-t-丁基-酪氨酸；val:纈氨酸。

以實(shí)施例3中的帶氨基的tentagel樹脂為基準(zhǔn)對照(鍵合效率100％)，拉曼信號分子的鍵合效率對gln、leu、val最好(99％)，ala、pro、lys(nα-氨基和nε-氨基)比較好(>95％)，aib由于位阻的原因略微偏低(～94％)，而對3-abz的效率不高(原因?yàn)榉枷惆返幕钚暂^低)。cys(mbzl)和tyr(t-bu)的鍵和效率略微超過100％，額外的信號可能源于起始原料的不純或反應(yīng)過程中少量的巰基與羥基的脫保護(hù)作用，羧基與其發(fā)生了副反應(yīng)。

這些結(jié)果表明，本發(fā)明所述的拉曼光譜分析方法適用的測量范圍為脂肪伯胺和環(huán)狀脂肪仲胺，脂肪族的伯胺和環(huán)狀脂肪仲胺可以得到高產(chǎn)率的拉曼信號分子鍵合。但是，由于芳香胺的反應(yīng)活性問題，與酰胺縮合不能完全進(jìn)行，故而此方法對芳香胺的檢測效果較差。由此推廣，針對其它固相合成產(chǎn)物的官能團(tuán)特點(diǎn)(如羥基、羧基、巰基等)，可以相應(yīng)設(shè)計(jì)拉曼信號分子上的對應(yīng)基團(tuán)，與這些官能團(tuán)發(fā)生高效率的鍵和反應(yīng)，以滿足本發(fā)明中測試方法的需要。

實(shí)施例5.拉曼信號與氨基負(fù)載的線性關(guān)系

為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可對不同負(fù)載的氨基定量，不同比例(摩爾比0:100，2:98，5:95，10:90，20:80，50:50，75:25，100:0)的9-芴甲氧羰基丙氨酸(fmoc-ala)和叔丁氧羰基丙氨酸(boc-ala)混合后與tentagel樹脂的氨基鍵合，以此來控制氨基的負(fù)載濃度。脫去9-芴甲氧羰基保護(hù)后，用前述方法進(jìn)行測量，得到8個(gè)樣品的圖譜。

圖4為樹脂珠上丙氨酸鍵合拉曼信號分子后的定量檢測。圖4a給出了不同丙氨酸負(fù)載下的拉曼光譜，樹脂珠_tentagel是帶氨基的tentagel樹脂直接鍵合拉曼信號分子的譜圖，為100％氨基負(fù)載的基準(zhǔn)參比。圖4b為相對拉曼強(qiáng)度與氨基負(fù)載的線性曲線。圖4c為原始拉曼強(qiáng)度與氨基負(fù)載的線性曲線。以相對拉曼強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，氨基的百分比負(fù)載為橫坐標(biāo)，數(shù)據(jù)點(diǎn)為5次平行測量的平均值(含標(biāo)準(zhǔn)偏差)。說明相對拉曼強(qiáng)度比原始拉曼強(qiáng)隊(duì)對氨基的百分比負(fù)載具有更好的線性關(guān)系。

本方法也適用于其他含有聚苯乙烯的樹脂珠，比如在rinkamide上重復(fù)上述的實(shí)驗(yàn)，也可得到良好的線性關(guān)系(圖5)。

實(shí)施例6.樹脂珠多肽合成的產(chǎn)率及產(chǎn)率分布

在tentagel樹脂上合成5肽(tag-qpfsp-tentagel)、8肽(tag-rpwqpfsp-tentagel)、11肽(tag-wpyrpwqpfsp-tentagel)、15肽(tag-paptwpyrpwqpfsp-tentagel)與20肽(tag-qpfsppaptwpyrpwqpfsp-tentagel)。分別隨機(jī)抽取100個(gè)樹脂珠，用本發(fā)明方法進(jìn)行測量。

圖6給出了基于100個(gè)樹脂珠測試所得的合成多肽百分比負(fù)載柱狀分布圖。如圖所示，從產(chǎn)率分布圖中可以看出，隨著肽鏈的增長，產(chǎn)率逐步下降，分別為85％(5肽)、82％(8肽)、27％(11肽)、19％(15肽)、17％(20肽)。但是，產(chǎn)率的降低幅度與肽鏈的增長程度并不成正比。在加上第9至第11個(gè)氨基酸時(shí)，產(chǎn)率明顯下降最大。這說明，這3個(gè)氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)在樹脂珠上的鍵合效率并不理想，肽鏈生成的產(chǎn)率遠(yuǎn)小于90％。

根據(jù)此項(xiàng)結(jié)果，本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確了解化合物庫中每一個(gè)樹脂珠的產(chǎn)率差異，并且分析分步反應(yīng)中某一步或某幾步的反應(yīng)效率，用以監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程和最終的產(chǎn)率分布。

實(shí)施例7.樹脂珠多肽組合庫的合成產(chǎn)率及產(chǎn)率分布

對于多肽化合物組合庫，由于每一個(gè)樹脂珠上氨基酸的起始原料不同，其多肽化合物的產(chǎn)率可能存在差異。為了評價(jià)多肽組合庫的合成質(zhì)量，本發(fā)明方法可用于測定多肽化合物庫在不同樹脂珠上的產(chǎn)率分布。

圖7給出了基于100個(gè)隨機(jī)樹脂珠計(jì)算所得的合成肽鏈化合物庫百分比負(fù)載的柱狀分布圖。此化合物庫為一個(gè)10肽的組合庫(tag-x10x9x8x7x6x5x4x3x2x1-tentagel)，合成方法為裂分-組合的樹脂珠合成技術(shù)，用作合成的氨基酸為19個(gè)天然氨基酸(不包括半胱氨酸)。

由圖可知，將產(chǎn)率分布的最高值(最大負(fù)載)和分布寬度作為兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，最大負(fù)載越接近100％說明此多肽組合庫的合成效率較高，分布寬度越小說明不同樹脂珠上產(chǎn)率的差異越小，產(chǎn)物的均一性越好。此發(fā)明方法用于多肽或其他固相合成化合物組合庫，能有效了解化合物組合庫的合成質(zhì)量，協(xié)助排除藥物篩選中由于組合庫中某個(gè)化合物產(chǎn)率過高而造成的假陽性結(jié)果，或者協(xié)助保留由于組合庫中某個(gè)化合物產(chǎn)率過低而造成的假陰性個(gè)體。

實(shí)施例8.多肽組合庫的產(chǎn)率分布及肽鏈解碼

對于化合物的組合庫，在了解其固相合成產(chǎn)率分布后，可以對高產(chǎn)率多肽和低產(chǎn)率多肽的氨基酸序列進(jìn)行解碼。具體實(shí)施方法為：在組合庫每一個(gè)樹脂珠末端氨基上連接nα-boc-nε-fmoc賴氨酸；fmoc脫保護(hù)后，可將拉曼信號分子連接到賴氨酸的ε-氨基上，用本發(fā)明方法進(jìn)行拉曼光譜測定；而賴氨酸的α-氨基脫保護(hù)后，可用edman降解法進(jìn)行解碼。

圖8給出了基于100個(gè)隨機(jī)樹脂珠計(jì)算所得的合成肽鏈組合庫百分比負(fù)載的柱狀分布圖，以及經(jīng)拉曼光譜測定后挑選出高產(chǎn)率和低產(chǎn)率的樹脂珠用edman降解法解碼所得的氨基酸序列。此化合物庫為一個(gè)8肽的組合庫h2n-k(-tag)-x7x6x5x4x3x2x1-tentagel。合成方法為裂分-組合的樹脂珠合成技術(shù)，用作合成的氨基酸為19個(gè)天然氨基酸(不包括半胱氨酸)。

對高產(chǎn)率和低產(chǎn)率的多肽進(jìn)行氨基酸解碼，可以有效了解多肽固相合成中特定氨基酸序列的產(chǎn)率規(guī)律。此方法也適用于其它固相合成化合物組合庫的解碼與分析。

以上，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實(shí)施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。