，8.05(m，lH，ArH)，7.50(t，J = 7.56Hz，lH，ArH)， 7· 38 (d，J = 8. 24Hz，1H，ArH)，7· 32 (t，J = 7. 86Hz，1H，ArH)，5· 10 (s，2H，-CH2)，3· 47 (t， J = 7. 86Hz，2H，-CH2)，3. 38(t，J = 7. 78Hz，4H，2-CH2)，2. 79(t，J = 4. 18Hz，4H，-CH2CH2)， 2. 58(d,J = 4. 10Hz,4H,-CH2CH2). MS(ESI) ：411. 81 (C17H20ClN4O4S, [M+H]+). Anal. Calcd for C17H19ClN4O4S ：C,49. 69 ；H,4. 66 ；N, 13. 64% . Found ：C,49. 68 ；H,4. 65 ；N, 13. 65% .
[0086] 實施例二十三：2-((4-((3-氯丙基）磺?；┻哙?I-基）甲基）色烯并[4, 3-c] 吡唑-4 (2H)-酮（化合物23)的制備
[0087]
[0088] 制備方法同實施例一。產(chǎn)物為白色粉末狀固體。產(chǎn)率53%。Mp :189_192°C .1H NMR(400MHz，CDCl3) :8. 20(s，1H，ArH)，8· 04(m，1H，ArH)，7· 49(t，J = 7. 44Hz，1H，ArH)， 7· 38 (d，J = 8. 36Hz，1H，ArH)，7· 33 (t，J = 7. 74Hz，1H，ArH)，5· 09 (s，2H，-CH2)，3· 42 (t， J = 7. 70Hz，2H，-CH2)，3. 36 (t，J = 7. 46Hz，4H，2-CH2)，2. 78 (t，J = 4. 34Hz，4H，-CH2CH2)， 2. 55 (d，J = 4. 24Hz，4H，-CH2CH2)，2.11 (m，2H，-CH2) .MS (ESI) :425. 79 (C18H22ClN4O4S, [M+H] +). Anal. Calcd for C18H21ClN4O4S ：C, 50. 88 ；H, 4. 98 ；N, 13. 19 % . Found ：C, 50. 90 ；H, 4. 97 ；N, 13. 21% .
[0089] 實施例二十四：含磺?；哙旱南愣顾夭⑦吝蝾惢衔锟拱┗钚匝芯?br>[0090] 1.實驗材料和方法
[0091] 1.1藥品與試劑
[0092] 采用MTT[3-(4,5)_雙甲基-2-噻唑_(2,5)_苯基溴化四氮唑藍(lán)]法來測定咖 啡酸類衍生物對人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7)，人體肺癌細(xì)胞株（A549)和小鼠黑色素瘤細(xì)胞 (B16-F10)的半數(shù)抑制濃度（IC 50)。
[0093] (1)培養(yǎng)液（每升）的配制：①懸浮細(xì)胞：RPMI-1640培養(yǎng)粉一袋（10. 4g)，新生牛 血清100mL，青霉素溶液（20萬U/ml)0. 5ml，鏈霉素溶液（20萬U/ml)0. 5ml，加三蒸水溶解 后，用5. 6%的NaHCO3溶液調(diào)PH值至7. 2-7. 4,最后定容至1000ml。過濾滅菌。②貼壁細(xì) 胞：同上，再加入 NaHC032. 00g，HEPES 2. 38g。
[0094] (2)PBS 緩沖液（每升）的配制：NaCl 8. 00g，KCl 0· 40g，Na2HPO4 · 12Η200· 06g， KH2PO40.0 6g，NaHCO3O. 35g。高壓滅菌。
[0095] (3)胰蛋白酶液的配制：利用PBS緩沖液配成濃度為0. 5%胰蛋白酶液。過濾除 菌。
[0096] (4)實驗藥液的配制：將測試樣品用少量的三蒸水溶解配成儲備液，一般按實驗 最高濃度的10倍配制儲備液。根據(jù)化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量 DMSO助溶，再加三蒸水溶解。DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不宜過大，加藥后的每孔細(xì)胞懸液中 DMSO的終濃度一般不超過0. 05% -0. 1 %。儲備液保存于-20°C冰箱中備用。
[0097] (5)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的培養(yǎng)：為貼壁生長細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培 養(yǎng)液內(nèi)（含10%小牛血清、?οου/ml鏈霉素），置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天傳 代一次。傳代時先棄去原培養(yǎng)液，再用PBS緩沖液洗滌；然后用0. 5 %胰蛋白酶消化30秒 左右，加入少量新鮮培養(yǎng)液終止消化；吹打，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來；移取適量 至新鮮培養(yǎng)瓶中，再補充新鮮培養(yǎng)液至原體積（培養(yǎng)液體積約為培養(yǎng)瓶容量的1/10)。
[0098] (6)人肺癌細(xì)胞A549的培養(yǎng)：為貼壁生長細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi) (含10 %小牛血清、lOOU/ml鏈霉素），置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。 傳代時先棄去原培養(yǎng)液，再用PBS緩沖液洗滌；然后用0. 5%胰蛋白酶消化30秒左右，加入 少量新鮮培養(yǎng)液終止消化；吹打，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來；移取適量至新鮮培 養(yǎng)瓶中，再補充新鮮培養(yǎng)液至原體積（培養(yǎng)液體積約為培養(yǎng)瓶容量的1/10)。
[0099] (7)肝癌細(xì)胞Huh7的培養(yǎng)：為貼壁生長細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)（含 10%小牛血清、100U/ml鏈霉素），置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。傳 代時先棄去原培養(yǎng)液，再用PBS緩沖液洗滌；然后用0. 5%胰蛋白酶消化30秒左右，加入少 量新鮮培養(yǎng)液終止消化；吹打，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來；移取適量至新鮮培養(yǎng) 瓶中，再補充新鮮培養(yǎng)液至原體積（培養(yǎng)液體積約為培養(yǎng)瓶容量的1/10)。
[0100] (8)人脊髓白血病M3細(xì)胞株（HL60)的培養(yǎng)：為懸浮生長細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于 RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)（含10%小牛血清、100U/ml鏈霉素），置37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每隔3-4天傳代一次。傳代時先棄去原培養(yǎng)液，再用PBS緩沖液洗滌；然后用0. 5%胰蛋白 酶消化30秒左右，加入少量新鮮培養(yǎng)液終止消化；吹打，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下 來；移取適量至新鮮培養(yǎng)瓶中，再補充新鮮培養(yǎng)液至原體積（培養(yǎng)液體積約為培養(yǎng)瓶容量 的 1/10)。
[0101] (9)細(xì)胞孵育：取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液濃度為1-1. 5X IO5個ml、 在96孔培養(yǎng)板中每孔加細(xì)胞懸液100 μ 1，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后， 分別按設(shè)計加入藥液。
[0102] (10)加藥：將測試藥液按照最終濃度的濃度梯度分別加入到各個孔中，每個濃度 設(shè)6個平行孔。實驗分為藥物試驗組（分別加入不同濃度的測試藥）、對照組（只加培養(yǎng)液 和細(xì)胞，不加測試藥）和空白組（只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞和測試藥）。將加藥后的96孔板置 于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。陽性對照藥物的活性按照測試樣品的方法測定。
[0103] (11)存活細(xì)胞的測定：在培養(yǎng)了 48h后的96孔板中，每孔加MTT 40 μ 1(用PBS 緩沖液配成4mg/ml)。在37°C放置4h后，移去上清液。每孔加150 μ I DMS0,振蕩5min，使 formazan結(jié)晶溶解。最后，利用自動酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔的光密度（0D值）。
[0104] 抑制率的計算：細(xì)胞生長的抑制率按照下列公式計算：
[0105] 生長抑制率=(1-存活率）X100%= [1-(0D實驗-OD空白V(0D對照-OD空白）]X100% (0D$M表示測試藥物組的平均光密度，OD 5ffii表示對照組的平均光密度，ODife表示對照組的 平均光密度）。
[0106] 半數(shù)抑制濃度（ICJ定義為當(dāng)50%的腫瘤細(xì)胞存活時的藥物濃度。根據(jù)測定的 光密度（0D值），制作細(xì)胞生長抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其對應(yīng)的藥物濃度。
[0107] 測得的IC50見表1所示。
[0108] 2.實驗結(jié)果
[0109] 表1本發(fā)明所列含磺酰基哌嗪的香豆素并吡唑類化合物對癌細(xì)胞的抑制IC5。值。

[0112] 結(jié)果表明：含磺酰基哌嗪的香豆素并吡唑類化合物對人結(jié)腸癌細(xì)胞株 (HCT-116)，人體肺癌細(xì)胞株（A549)，肝癌細(xì)胞（Huh7)和人脊髓白血病M3細(xì)胞株（HL60)都 有不同程度的抑制作用。
【主權(quán)項】
1. 一類含磺?；哙旱南愣顾夭⑦吝蝾惢衔?，其特征是它具有以下通式：2. -種權(quán)利要求1中所述的含磺酰基哌嗪的香豆素并吡唑類化合物的制法，其特征是 它由以下步驟組成： 將4-羥基香豆素0. 06mmol溶解在46. 2ml的無水N, N-二甲基甲酰胺中，將此反應(yīng)液 冷卻至(TC以下。在(TC以下條件下，邊攪拌邊緩慢滴加 POCl3 0.1 Smmol，待POCl3加畢，將 反應(yīng)液緩慢升溫至室溫條件下攪拌〇. 5h后，然后升溫至65-70°C攪拌反應(yīng)6h。用TLC跟蹤 監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入200g的冰水混合物中并劇烈攪拌，有大量淺黃色 固體1析出。將固體抽濾，并用5 %的Na2CO3水溶液洗滌，將所得固體干燥，即得到中間體。 將步驟一中所得固體Immol溶解在IOml乙醇中，加完攪拌使其溶解充分，然后冷卻至 15-20°C，將配置好的溶液（85%的水合肼2mmol+三乙胺4mmol+60%乙醇IOml)在攪拌條 件下，保持溫度在15_20°C，緩慢滴加至反應(yīng)液中。滴加畢，保持溫度不超過25°C，攪拌反應(yīng) 12h。用TLC跟蹤監(jiān)測反應(yīng)。將所得固體減壓濃縮，所得固體用乙醇重結(jié)晶，即得到中間體 2〇 取無水哌嗪3mmol溶解在30ml無水二氯甲燒中冷卻至0°C以下，然后加入三乙胺 4ml，攪拌一段時間后，加入磺酰氯3mmol，在0°C以下攪拌反應(yīng)2-4h，反應(yīng)畢，有機層用水洗 (30ml X 3)后，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑，所得固體3減壓干燥后，直接用于下一步 反應(yīng)。 取上述所得固體3mmol，化合物2 Immol加熱溶解在20-25ml的無水乙醇中，待溶解充 分后，冷卻至室溫下，向反應(yīng)液中緩慢加入40%的甲醛溶液300 μ 1，室溫下攪拌反應(yīng)4-6h， 有大量固體析出。過濾，所得固體用冷的乙醇洗滌，然后將固體干燥，用乙醇重結(jié)晶，即得到 含磺酰胺氮雜環(huán)的香豆素并吡唑衍生物。3.權(quán)利要求1所述的含磺酰基哌嗪的香豆素并吡唑類化合物及其制備與在抑制腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】含磺酰基哌嗪的香豆素并吡唑類化合物，它具有如下通式。實驗證明，含磺?；哙旱南愣顾夭⑦吝蝾惢衔飳θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT-116)，人體肺癌細(xì)胞株(A549)，肝癌細(xì)胞(Huh7)和人脊髓白血病M3細(xì)胞株(HL60)都有不同程度的抑制作用。因此它們可能用于制備抗癌藥物。本發(fā)明公開了含磺?；哙旱南愣顾夭⑦吝蝾惢衔锏闹品?。其中R為：
【IPC分類】A61P35/02, C07D491/052, A61P35/00
【公開號】CN105061442
【申請?zhí)枴緾N201510416346
【發(fā)明人】朱海亮, 吳遜, 殷勇, 王雪, 沙少
【申請人】南京大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月10日