專利名稱：：一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種雷公藤不定根培養(yǎng)方法，特別是一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法，該方法生產(chǎn)的雷公藤不定根中所含的雷公藤甲素和總生物堿相對(duì)較高，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)，并且有利于雷公藤自然資源的保護(hù)。
背景技術(shù)：
：雷公藤(7>i'/^e/y^'i/y77w7/b/Y/h'Hook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，在我國(guó)很早以前就用于醫(yī)學(xué)和防治各種害蟲(chóng)，為著名的殺蟲(chóng)植物之一。民間多用于防治蔬菜害蟲(chóng)，故有"菜藥"之稱。其對(duì)多種害蟲(chóng)有效。傳統(tǒng)中醫(yī)上可用于治療腫脹、水腫、黃白疽、痢疾等，具有明顯的抗腫瘤、抗風(fēng)濕作用。雷公藤屬多年生木質(zhì)藤本、生長(zhǎng)緩慢、處于野生狀態(tài)，因用根入藥，大量應(yīng)用使資源遭到破壞。雷公藤根中的活性成分含量顯著高于其他部位，是主要藥用部位。現(xiàn)已從中分離出70多種化學(xué)成分，其中雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是中藥雷公藤的主要有效成分之一，作為免疫抑制藥物，可應(yīng)用于許多自身免疫性疾病的治療，同時(shí)它又是一種毒性成分。雷公藤生物堿具有明顯的體液和細(xì)胞免疫抑制作用，也是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分。在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治中，雷公藤甲素有較好的觸殺活性，雷公藤總生物堿有較好的胃毒毒殺活性和拒食活性。這些有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，在雷公藤植株內(nèi)含量很低，在其他植物內(nèi)的含量更低，雖然可通過(guò)化學(xué)分離提取獲得產(chǎn)品，但受氣候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季節(jié)等條件的限制，生產(chǎn)受到一定的限制，加上人類對(duì)自然的過(guò)度開(kāi)發(fā)，資源受到破壞，提取量很有限。雷公藤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分在國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了大量研究。在國(guó)內(nèi)，尹作鴻等人從雷公藤的莖、葉誘導(dǎo)出愈傷組織，并進(jìn)行了組織培養(yǎng)，從中分離得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜內(nèi)酯化合物。曹華興等(2002年)申請(qǐng)發(fā)明專利提出采用懸浮法培養(yǎng)雷公藤植物細(xì)胞而生產(chǎn)雷公藤總生物堿的方法，該方法得到的產(chǎn)物所含雷公藤總生物堿的含量為植物體的2.9倍。在國(guó)夕卜，早在1980年美國(guó)喬治頓大學(xué)生物學(xué)DujackLW等采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法，并報(bào)告了組織培養(yǎng)中前體的影響。與此同時(shí)，加拿大學(xué)者J.PKutney等也用雷公藤莖葉進(jìn)行組織培養(yǎng)成功，把雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯二醇的產(chǎn)最較f中含量分別提高了3倍和16倍，并探索以托品類(Terpenoids)作為前體物促進(jìn)雷公藤內(nèi)酯二醇的生物合成。MMjsawa等(1982年)報(bào)告了用含蔗糖和植物激素的瓊脂對(duì)雷公藤進(jìn)行組織培養(yǎng)結(jié)果，經(jīng)培養(yǎng)后的細(xì)胞所含雷公藤內(nèi)酯二醇比原植物含量高IO倍。日木KyowaHakkokogyo公司也為組織培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯二醇申請(qǐng)專利。這些對(duì)雷公藤細(xì)胞培養(yǎng)的研究從不同方面進(jìn)行了有益的探索，但遠(yuǎn)未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。而關(guān)于雷公藤不定根懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿的方法尚未見(jiàn)到報(bào)道。一般來(lái)說(shuō)，植物的次生代謝產(chǎn)物在已經(jīng)分化的組織中含量較高，且器官培養(yǎng)相對(duì)比較穩(wěn)定，因此采用苗或根培養(yǎng)的方法是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的另一條途徑。根培養(yǎng)對(duì)植物有著特殊的意義，因?yàn)樵S多植物次生代謝物均來(lái)自于根部。但工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)根類的實(shí)例并不多，韓國(guó)目前在高麗參根類培養(yǎng)方面已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，采用了510t的反應(yīng)器，并以培養(yǎng)的根為原料開(kāi)發(fā)了系列產(chǎn)品。用有一定的器官分化的不定根作為懸浮培養(yǎng)的材料，生產(chǎn)其代謝產(chǎn)物，要比細(xì)胞培養(yǎng)有效成分要高得多，但不定根的誘導(dǎo)需要克服更多技術(shù)上的困難，并非所有植物均可進(jìn)行不定根誘導(dǎo)。植物細(xì)胞全能性的設(shè)想于1902年提出，1948年得到了證實(shí)，這為進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作奠定了理論基礎(chǔ)，自從1956年Routine和Nickel首次申請(qǐng)用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的專利以來(lái)，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生物質(zhì)的研究取得了很大的進(jìn)展。大量研究成果證明，通過(guò)植物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生有用的次生代謝產(chǎn)物越來(lái)越顯示出巨大的應(yīng)用潛力。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物不受地理、季節(jié)變換和各種環(huán)境因素的影響；可節(jié)省土地，降低成本，縮短生產(chǎn)周期；可以提供一種標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)過(guò)程，該過(guò)程可以連續(xù)生產(chǎn)，產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量穩(wěn)定，便于實(shí)行工業(yè)化生產(chǎn)，已是解決各種有效成分含量低的植物資源利用的主要途徑。這是本申請(qǐng)的試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容為了保護(hù)雷公藤的自然資源，本發(fā)明的目的在于提供由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法，其特征在于，具體包括下列步驟步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體；用洗潔精洗滌并用自來(lái)水反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含70%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒20s，然后以無(wú)菌水沖洗4次，再用lg/LHgCl2消毒4min，無(wú)菌水沖洗4次；步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基組成為MS+(0.51.0)mg/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT，pH值為5.8，并在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25土1。C，保持每天12小時(shí)的光照，光照強(qiáng)度為10001500lx，2030天后形成愈傷組織；步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，4045天繼代一次，連續(xù)繼代5代，培養(yǎng)基組成為6，7-V+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT;步驟四，挑選生長(zhǎng)快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5%10%(w/v)，接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細(xì)胞系，培養(yǎng)基的組成為NT+1.0mg/L2,4-D十O.5mg/LKT，選擇250mL三角瓶，裝培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C，自然光照，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，每2530天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲得雷公藤懸浮細(xì)胞系；步驟五，用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的雷公藤懸浮細(xì)胞系，選取直徑在lmm以下、分散性好、顆粒狀雷公藤懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)接在NT培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，接種量為鮮重5g/L10g/L，NT培養(yǎng)基的組成為NT+(0.51.0)mg/L2，4-D+(26)mg/LNAA+(0.10.5)mg/LKT，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生不定根，繼續(xù)培養(yǎng)至45天，有85%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生長(zhǎng)度為0.5cm3cm的不定根；步驟六，不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選步驟五誘導(dǎo)的不定根中，根長(zhǎng)度為lcm2cm、細(xì)胞團(tuán)直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在步驟五相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系；同時(shí)將篩選的生長(zhǎng)旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，繼代保存在MS培養(yǎng)基中，35天繼代一次，MS培養(yǎng)基組成為O.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖3040g/L，pH值為5.8;步驟七，對(duì)不定根進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，在NT培養(yǎng)基中加入0.51.0mg/L2,4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時(shí)加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的AgNO:、(510)mg/L，培養(yǎng)至第50天收獲。本發(fā)明的方法得到的不定根，其中雷公藤甲素和總生物堿的含量分別為根皮粉的13倍和1.8倍，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占5560%，總生物堿產(chǎn)量占6065%。利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)，并且有利于雷公藤自然資源的保護(hù)。圖1為本發(fā)明的試驗(yàn)流程圖；以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。具體實(shí)施方式參見(jiàn)圖l，依照本發(fā)明的技術(shù)方案，由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法，具體包括下列步驟1.愈傷組織誘導(dǎo)以雷公藤(7WpZ^T^7'鵬rz7/b/Y/j7Hook,f.)—年生枝條扦插形成的不定根為外植體，用洗潔精洗滌并用自來(lái)水反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含70。/。質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒20s，無(wú)菌水沖洗4次，再用lg/LHgCl2消毒4min，無(wú)菌水沖洗4次；將不定根的幼根切成O.7cm左右小段，接種在MS+0.51.0mg/L2，4-D+0.10.5mg/LKT培養(yǎng)基上，pH值為5.8，蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度25。Cil。C，每天保持12小時(shí)光照，光照強(qiáng)度為10001500lx，2030d后形成愈傷組織。愈傷組織在6,7-V+0.51.0mg/L2，4-D+0.10.5mg/LKT培養(yǎng)基上，40d45d繼代一次，連續(xù)繼代5代。2.懸浮系的建立挑選生長(zhǎng)快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5%10%(w/v)，接種在NT+(0.51.0)rag/L2，4-D+(0.10.5)mg/LKT培養(yǎng)基上，250mL三角瓶，裝液體培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C+1°C，自然光照，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，每25d30d繼代一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，獲得雷公藤懸浮細(xì)胞系；3.不定根的誘導(dǎo)用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞，選取直徑在lmm以下、分散性好、顆粒狀懸浮細(xì)胞系，轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基的組成為NT+(0.5(26)mg/LNAA+(0.10.5)mg/LKT，接種量為鮮重(510)g/L，培養(yǎng)30d開(kāi)始有不定根產(chǎn)生，繼續(xù)培養(yǎng)至40d，85%的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生長(zhǎng)度為0.53cm的不定根。4.不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選上述誘導(dǎo)的不定根中長(zhǎng)度在lcm2cm、細(xì)胞團(tuán)直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系。5.不定根的液體繼代保存將步驟4篩選的生長(zhǎng)旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，繼代保存在附加0.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.10.5mg/L，蔗糖3040g/L，pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，35d繼代一次。6.促進(jìn)雷公藤甲素和總生物堿合成的培養(yǎng)條件優(yōu)化對(duì)不定根進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，在NT培養(yǎng)基中加入0.51.0mg/L2，4-D、NAA26mg/L，KT0.l0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時(shí)加入510mg/LAgNO:,(過(guò)濾滅菌)，培養(yǎng)至第50天收獲。7.不定根、培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿的提取將培養(yǎng)45d的不定根過(guò)濾，在6(TC烘干，培養(yǎng)液自然風(fēng)干至1/3時(shí)，按雷公藤甲素的提取方法，如《中草藥》，2005，36(7)，1065-1068記載的方法提取雷公藤甲素，按雷公藤總生物堿的提取方法，如《中國(guó)中藥雜志》1995，20(3):145-147記載的方法提取總生物堿。根據(jù)申請(qǐng)人的試驗(yàn)結(jié)果表明，按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的不定根中雷公藤甲素含量為44.76Pg/g，雷公藤總生物堿為3.59mg/g，在過(guò)濾細(xì)胞后的培養(yǎng)液中雷公藤甲素含量為1.24Pg/mL、總生物堿含量為147.69Jitg/mL。每100mL培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞后，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占55~60%，總生物堿產(chǎn)量占60-65%。雷公藤不定根與根皮粉質(zhì)量比較僅培養(yǎng)1g不定根得到的雷公藤甲素就為1、根皮粉的13倍，總生物堿的1.8倍。對(duì)本發(fā)明所得不定根提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性測(cè)定表明，其致死中濃(LD5。)是根皮粉的1/2。以下是申請(qǐng)人給出的相關(guān)試驗(yàn)實(shí)施例l不定根及培養(yǎng)液中雷公藤甲素、總生物堿含量的測(cè)定精密稱取冷凍干燥后的雷公藤根皮粉、不定根1.000g，置磨口三角瓶中，加入乙酸乙酯20mL浸泡過(guò)夜，超聲提取40min，過(guò)中性氧化鋁柱(含3g中性氧化鋁，玻璃柱d^.Ocm)，然后用20mL乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，減壓回收乙酸乙酯至干，用45Q/。甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，待用。培養(yǎng)液提取取培養(yǎng)液100mL，自然風(fēng)干至1/3時(shí)，用乙酸乙酯以1:1的比例在分液漏斗中混合，經(jīng)三次萃取，合并乙酸乙酯相，過(guò)中性氧化鋁柱，適量乙酸乙酯洗脫，減壓回收乙酸乙酯至干，用45%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，用于測(cè)定雷公藤甲素和總生物堿。雷公藤甲素的含量測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜條件為色譜柱C18色譜柱(4.6mmx250mm,5|iim);流動(dòng)相甲醇水(45:55);流速1mL/min;檢觀!l波長(zhǎng)218nm。雷公藤總生物堿含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，將提取液用45%甲醇稀釋1030倍，用分光光度計(jì)在268nm處測(cè)定吸光度值。檢測(cè)結(jié)果(1)根皮粉中雷公藤甲素含量為9.89iig/g，總生物堿為5.01mg/g;(2)雷公藤不定根中雷公藤甲素含量為44.76pg/g，總生物堿為3.59mg/g。每100mL培養(yǎng)基可培養(yǎng)不定根1.31.5g，貝U100mL培養(yǎng)基培養(yǎng)的不定根中雷公藤甲素和總生物堿產(chǎn)量分別為58.188|ig和4.667mg(按1.3g計(jì)算)；(3)在過(guò)濾不定根后的培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿含量分別為1.24pg/mL和147.69pg/mL。每100mL培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞后，培養(yǎng)液至少60mL(按60mL計(jì)算)，則培養(yǎng)液中含雷公藤甲素和總生物堿至少分別為74.4貼禾口8.8814mg。據(jù)上述數(shù)據(jù)計(jì)算可得，培養(yǎng)液中雷公藤甲素和總生物堿產(chǎn)量分別各占總產(chǎn)量的56%和65%;培養(yǎng)1g不定根，培養(yǎng)產(chǎn)物中的雷公藤甲素為1g根皮粉的10倍、總生物堿的2倍。實(shí)施例2:不定根及培養(yǎng)液提取物對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的抑制活性測(cè)定將雷公藤根皮粉、不定根培養(yǎng)物及培養(yǎng)液分別提取，提取物均分別用丙酮定容至(干樣)10mg/mL，待用。取干凈的甘藍(lán)葉片分別在前述樣品液中浸漬處理，晾干后分別飼喂試蟲(chóng)(小菜蛾3齡幼蟲(chóng))，以丙酮處理為對(duì)照，連續(xù)飼喂72h。每樣品處理重復(fù)3次，每重復(fù)10頭試蟲(chóng)。分別于處理后24，48，72h稱量幼蟲(chóng)體重，計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率。相對(duì)生長(zhǎng)率(mg.mg".d"^體重增加量(mg)/[平均體重(mg)x取食時(shí)間(d)]。試驗(yàn)結(jié)果表明不同提取物的甘藍(lán)葉片飼喂小菜蛾3齡幼蟲(chóng)后，對(duì)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用(表1)，各處理組幼蟲(chóng)的體重、體重增加量和相對(duì)生長(zhǎng)率均明顯低于對(duì)照。其中不定根提取物處理后小菜蛾體重增加量均為負(fù)值，24h后部分試蟲(chóng)死亡，48h后己不再取食，72h后70。/。左右已經(jīng)死亡，存活的已經(jīng)幾乎不動(dòng)，幼蟲(chóng)長(zhǎng)度僅為對(duì)照的1/5左右，體重比試驗(yàn)前下降了18.33%。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例3:不定根及培養(yǎng)液提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的胃毒毒殺活性測(cè)定將雷公藤根皮粉及不定根培養(yǎng)物，冷凍干燥后，取lg，加入乙酸乙酯20mL超聲提取40min，過(guò)濾后，揮干乙酸乙酯，提取物用丙酮稀釋成1，5，10，25，50，100mg/mL的溶液，培養(yǎng)液提取物稀釋成培養(yǎng)液和丙酮的體積比為l，5，10，20，40，80，100ml/mL，采用葉碟法測(cè)定其毒殺活性。采用VisualBasic6.0程序求出毒殺曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明不同提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)均具有明顯的毒殺作用(表2)，其中不定根毒殺作用最強(qiáng)，LD5。(致死中濃)為6.72mg/mL，而根皮粉提取物對(duì)小菜蛾3齡幼蟲(chóng)的胃毒毒殺LD5o為13.13mg/mL，僅為根培養(yǎng)物活性的1/2左右。表2不同類型雷公藤樣品對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒殺作用(48h)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法，其特征在于，具體包括下列步驟步驟一，以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為外植體，用洗潔精洗滌并用自來(lái)水反復(fù)清洗后，流水沖洗2小時(shí)，用含70％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酒精消毒20s，然后以無(wú)菌水沖洗4次，再用1g/LHgCl2消毒4min，無(wú)菌水沖洗4次；步驟二，將不定根的幼根切成小段；接種在培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)室進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基組成為MS+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(0.1～0.5)mg/LKT，pH值為5.8，并在培養(yǎng)基中加入蔗糖30g/L，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，保持每天12小時(shí)的光照，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，20～30天后形成愈傷組織；步驟三，將形成的愈傷組織置入培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，40～45天繼代一次，連續(xù)繼代5代，培養(yǎng)基組成為6，7-V+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT；步驟四，挑選生長(zhǎng)快、有光澤、質(zhì)地疏松，顆粒狀愈傷組織，接種量為5％～10％(w/v)，接種在培養(yǎng)基上建立雷公藤懸浮細(xì)胞系，培養(yǎng)基的組成為NT+1.0mg/L2，4-D+0.5mg/LKT，選擇250mL三角瓶，裝培養(yǎng)基100mL，放入培養(yǎng)室中的搖床上震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25+1℃，自然光照，搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，每25～30天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3次以上，即獲得雷公藤懸浮細(xì)胞系；步驟五，用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的雷公藤懸浮細(xì)胞系，選取直徑在1mm以下、分散性好、顆粒狀雷公藤懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)接在NT培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，接種量為鮮重5g/L～10g/L，NT培養(yǎng)基的組成為NT+(0.5～1.0)mg/L2，4-D+(2～6)mg/LNAA+(0.1～0.5)mg/LKT，培養(yǎng)30天可產(chǎn)生不定根，繼續(xù)培養(yǎng)至45天，有85％的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生長(zhǎng)度為0.5cm～3cm的不定根；步驟六，不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)繼代時(shí)在超凈工作臺(tái)上，挑選步驟五誘導(dǎo)的不定根中，根長(zhǎng)度為1cm～2cm、細(xì)胞團(tuán)直徑在2mm以下、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在步驟五相同培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代以上，即可形成穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系；同時(shí)將篩選的生長(zhǎng)旺盛、分散性好，富有光澤、乳白色帶細(xì)胞團(tuán)的不定根，繼代保存在MS培養(yǎng)基中，35天繼代一次，MS培養(yǎng)基組成為0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA2～6mg/L，KT0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值為5.8；步驟七，對(duì)不定根進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)時(shí)，在NT培養(yǎng)基中加入0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA2～6mg/L，KT0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值為6.4，培養(yǎng)至第35天時(shí)加入經(jīng)過(guò)濾滅菌的AgNO3(5～10)mg/L，培養(yǎng)至第50天收獲。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種由雷公藤懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)不定根的方法，該方法以雷公藤一年生枝條扦插形成的不定根為原始材料，對(duì)外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)，建立懸浮細(xì)胞系，通過(guò)懸浮細(xì)胞系誘導(dǎo)不定根，通過(guò)不定根的穩(wěn)定性培養(yǎng)、繼代保存、培養(yǎng)條件優(yōu)化，即可用于擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)雷公藤甲素和生物堿。該方法得到的不定根中雷公藤甲素和總生物堿的含量分別為根皮粉的13倍和1.8倍，培養(yǎng)液中雷公藤甲素產(chǎn)量占55～60％，總生物堿產(chǎn)量占60～65％。利用該方法生產(chǎn)雷公藤甲素和總生物堿，具有生產(chǎn)周期短、效率高、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)，并且有利于雷公藤自然資源的保護(hù)。文檔編號(hào)A01H4/00GK101248757SQ20081001769公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者馮俊濤,興張,琰李,王智輝,王永宏申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心