專利名稱：人源抑肽酶基因、該基因編碼的蛋白質及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人源抑肽酶基因、該基因編碼的蛋白質及其應用。
抑肽酶的制備目前國內外普遍采用生物臟器提取法，價格昂貴，使它的應用受到一定的限制。盡管如此，國內心胸外科、胰腺手術中仍廣泛使用抑肽酶，僅阜外醫(yī)院每年的進口抑肽酶用量價值約400萬人民幣。
抑肽酶是一個58肽的小分子物質，從理論上可以用基因工程方法制備，國外也有文獻和專利報道[4]用基因重組制備抑肽酶。1995年Green報道[5]重組的牛抑肽酶用于臨床，可減少手術出血和對輸血的需求。
但由于動物蛋白進入人體將產生免疫原性，二次使用時，過敏反應發(fā)生的機率大大增加。當前已有多篇文獻報道[6，7，8]病人使用牛抑肽酶后產生過敏現(xiàn)象，輕者休克，重者甚至死亡。且近年來瘋牛病蔓延全世界，引起極大的恐慌，故牛已不宜作為提取抑肽酶的供體動物。另外，我們查閱分析了大量GenBank登錄序列，發(fā)現(xiàn)抑肽酶有多種基因型，分別可衍繹出不同結構的蛋白質，已有文獻報道[9]人為造成抑肽酶氨基酸的定點突變影響其蛋白的活性，據此推測每種基因型抑肽酶的生物活性各有不同。而以往采用的傳統(tǒng)提取法不但成本高，產量少，更無法保證所產蛋白質基因型的單一性，從而必然會影響產物的純度和其生物活性?；蚬こ躺a藥物能克服傳統(tǒng)方法的缺點，然而人抑肽酶基因未見報道，其序列在GenBank中未見登錄。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種本發(fā)明的基因編碼的蛋白質。
本發(fā)明的在一個目的是提供一種本發(fā)明的蛋白質的應用。
我們從人cDNA文庫獲得兩個DNA片段，其同源性與牛抑肽酶(Bovine pancreatic trypsin inhibitor，aprotinin)基因高度同源，屬人源抑肽酶基因。這三個DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO1，3和5所示，它們所編碼氨基酸序列如SEQ ID NO2，4和6所示。其中，(1)SEQ ID NO1與已知牛的抑肽酶基因98％同源，共有3個堿基變化，帶來2處氨基酸變化。(2)SEQ ID NO3與已知牛的抑肽酶基因97％同源，共有5個堿基變化，帶來3處氨基酸變化。(3)SEQ ID NO5與已知牛的抑肽酶基因93％同源，共有12個堿基變化，帶來8處氨基酸變化。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的SEQ ID NO2，4或6的抑肽酶在制備用于止血、抑制炎性反應的藥物中的應用。
本發(fā)明將上述DNA片段與pET系列表達載體進行基因重組，重組子轉化入大腸桿菌，經IPTG誘導獲得重組人抑肽酶蛋白。菌體裂解液經處理后采用CM-Sephadex柱層析提純，獲得人抑肽酶粗制品。采用滴定法進行效價測定，該蛋白粗制品能夠抑制胰蛋白酶活性，具有抑肽酶活力。
PCR循環(huán)條件如下94℃ 5分鐘55℃ 2分鐘 1個循環(huán)72 ℃ 2分鐘94 ℃ 30秒55℃ 30秒 35個循環(huán)72℃ 45秒72℃ 7分鐘4℃保溫10μl PCR產物經1.0％Agarose電泳分離、鑒定，在約200bp位置存在單一條帶，初步認為PCR獲得成功。大量PCR擴增，取200μl PCR產物，1.0％Agarose電泳分離，切下約200bp位置單一條帶后，玻璃奶方法回收。將回收片段與擴增載體pBluescript SK(+)按3∶1的比例，16℃連接16小時，轉化入DH5a菌中擴增，氨芐青霉素和X-gal藍百斑篩選，AccI酶切和以上述擴增引物1、2為引物PCR鑒定陽性克隆。選擇酶切和PCR兩種鑒定均呈陽性的克隆進行DNA序列測定(在六合通及基康公司測定)。測定結果顯示存在上述3種新的人源抑肽酶基因。2.人源抑肽酶基因重組蛋白質我們選擇上述DNA片段3、5，分別以pET28c和pET32b(+)為載體，片段3、5與載體均在NcoI、BamHI位點酶切處理后，16℃連接16小時進行基因重組，經酶切和PCR雙重鑒定，獲得天然型(2-pET28c、3-pET28c)和融合型(2-pET32b+)表達質粒。將其均轉化入BL21(2-pET28c、3-pET28c和2-pET32b+)，用IPTG誘導獲得重組表達的抑肽酶蛋白。收集150ml BL21(2-pET28c)菌液，3500rpm離心5min，菌體經超聲裂解處理后，25ml菌體裂解液經CM-Sephadex柱層析純化，以含4M尿素的0.01～0.5M NaCl梯度洗脫，獲得人抑肽酶粗制品。透析后冰干濃縮，干粉溶于200μl雙蒸水中。采用FIP滴定法對該粗制品的酶活性進行初步測定，胰蛋白酶對照液(1.2mg/ml)與底物BAEE(Na-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽)(16mg/ml)反應后，每分鐘消耗0.01N NaOH 1.0ml；而加入100μl人抑肽酶粗制品后，等量的胰蛋白酶與底物BAEE反應，每分鐘消耗0.01N NaOH 0.9ml。說明該蛋白質粗制品能夠抑制胰蛋白酶活性，具有抑肽酶活力。
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序列表<110>中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院<120>人源抑肽酶基因、該基因編碼的蛋白質及其應用<130>I2001263<160>8<170>PATENTIN VERSION3.1<210>1<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>1CGG CCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCA TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AAA ATG ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG GCT GGG CTC TGC CAG ACC 96LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY LEU CYS GLN THR20 25 30TTT GTA TAT GGC GGC TGC AGA GCT AAA AGA AAC AAT TTC AAG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS ARG ALA LYS ARG ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>2<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>2ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY LEU CYS GLN THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS ARG ALA LYS ARG ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>3<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>3CGG CCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCA TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AGA ATT ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG TCT GGG CTC TGC CAG ACC 96ARG ILE ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS SER GLY LEU CYS GLN THR20 25 30TTT GTA TAT GGC GGC TGC AAA GCT AAG AGC AAC AAT TTC AAG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>4<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>4ARG PRO ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15ARG ILE ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS SER GLY LEU CYS GLN THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE LYS SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>5<211>174<212>DNA<213>HOMO SAPIENS<220><221>CDS<222>(1)..(174)<223><400>5CGG TCT GAC TTC TGC CTA GAG CCT CCT TAT ACG GGT CCC TGC AAG GCC 48ARG SER ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15AAA ATG ATC AGA TAC TTC TAC AAC GCC AAG GCT GGG TTC TGC AAG ACC 96LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY PHE CYS LYS THR20 25 30TTT GTA TAT GGT GGC TGC AAA GCT AAG AGC AAC AAT TTC AGG AGC GCA 144PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE ARG SER ALA35 40 45GAG GAC TGC ATG AGG ACC TGT GGT GGT GCG 174GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>6<211>58<212>PRT<213>HOMO SAPIENS<400>6ARG SER ASP PHE CYS LEU GLU PRO PRO TYR THR GLY PRO CYS LYS ALA1 5 10 15LYS MET ILE ARG TYR PHE TYR ASN ALA LYS ALA GLY PHE CYS LYS THR20 25 30PHE VAL TYR GLY GLY CYS LYS ALA LYS SER ASN ASN PHE ARG SER ALA35 40 45GLU ASP CYS MET ARG THR CYS GLY GLY ALA50 55<210>7<211>30<212>DNA<213>ARTIFICIAL SEQUENCE<220><223>PRIMER<400>7CCCATGGCAC GGCCTGACTT CTGCCTAGAG 30<210>8<211>30<212>DNA<213>ARTIFICIAL SEQUENCE<220><223>PRIMER<400>8ACGCGTCTAC GCACCACCAC AGGTCCTCAT 30
權利要求
1.一種人源抑肽酶，它具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或者SEQID NO6所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述的人源抑肽酶的基因。
3.按照權利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或者SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述的人源抑肽酶在制備用于止血、抑制炎性反應的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源抑肽酶，它具有SEQ IDNO2，SEQ ID NO4或者SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼權利要求1所述的人源抑肽酶的基因。本發(fā)明的人源抑肽酶可用于制備用于止血、抑制炎性反應等的藥物。
文檔編號C12N15/52GK1410536SQ0113609
公開日2003年4月16日 申請日期2001年10月8日 優(yōu)先權日2001年10月8日
發(fā)明者陳曦, 梁艷民, 叢祥鳳 申請人:中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院