專利名稱：長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種動物細胞工程領域，特別市一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專
用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞是從動物早期胚胎的內(nèi)細胞團或原始生殖細胞分離出來的一種具有發(fā)育全能性的高度未分化細胞，可分化形成動物機體的絕大多數(shù)終端細胞以及具有生殖系傳遞能力，因此在組織器官工程、細胞治療以及動物遺傳修飾與操作等方面具有廣闊的應用前景。胚胎干細胞具有自發(fā)分化的趨勢，培養(yǎng)胚胎干細胞的關(guān)鍵技術(shù)是需要篩選合適的培養(yǎng)體系使細胞既能快速無限增殖又能保持未分化狀態(tài)。常用方法包括(1)采用飼養(yǎng)層， 飼養(yǎng)層細胞通過某種尚不完全清楚的機理抑制胚胎干細胞的分化；(2)條件培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基中含有抑制細胞分子的因子；(3)采用抑制細胞分化或促進細胞增殖的細胞因子， 包括白血病抑制因子，干細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子等等。自1981年Evans 等從延遲著床的小鼠早期胚胎成功建立胚胎干細胞系以來，基于上述一種或多種方法的聯(lián)合運用，目前已在人、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、馬以及兔等物種實現(xiàn)了胚胎干細胞的長期傳代培養(yǎng)并成功建立胚胎干細胞系或類胚胎干細胞系。但迄今為止，盡管有培養(yǎng)雞胚胎干細胞的報道，但均只能在很短的時間內(nèi)維持其未分化狀態(tài)，尚未能實現(xiàn)雞胚胎干細胞在體外的長期傳代培養(yǎng)及建立細胞系。雞胚胎干細胞不能在體外長期傳代培養(yǎng)的一個重要原因是，目前的胚胎干細胞培養(yǎng)體系，包括培養(yǎng)基配方，均是基于鼠或人等哺乳動物而設計，而禽類細胞與哺乳動物細胞存在較大差異，一些適用于哺乳動物胚胎干細胞的培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基配方，可能并不能完全滿足雞胚胎干細胞離體培養(yǎng)的需要。因此，這些培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基配方，盡管能夠在一段時間內(nèi)使雞胚胎干細胞維持未分化狀態(tài)，但長期傳代培養(yǎng)時將不能維持這種狀態(tài)而導致細胞迅速分化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種適用于雞胚胎干細胞的培養(yǎng)體系，以實現(xiàn)雞胚胎干細胞在體外的長期傳代培養(yǎng)的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法是這樣實現(xiàn)的，分離
X期胚盤明區(qū)的細胞，經(jīng)機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養(yǎng)層，用上
述雞胚胎干細胞在專用培養(yǎng)基及37 38°C環(huán)境下培養(yǎng)，3飛天傳代一次，專用培養(yǎng)基包括差件培養(yǎng)液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；雞血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5 — 25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巰基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；堿性成纖維細胞生長因子10 — 50 μ g ；干細胞生長因子5 — 20 μ g，將上述成分用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL，調(diào)pH值為7. 2—7. 5，條件培養(yǎng)液是這樣獲得的，培養(yǎng)BRL-3A細胞至細胞匯合后(通常為3天)，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心分離后再經(jīng)濾膜過濾所得即為條件培養(yǎng)液。這里，濾膜是0. 22um微孔得濾膜，離心分離的轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，離心分離時間不少于5min。本發(fā)明的專用培養(yǎng)基包括條件培養(yǎng)液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；雞血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5—25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巰基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；堿性成纖維細胞生長因子 10—50 μ g ；干細胞生長因子5 — 20 μ g，將上述成分用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL, 調(diào)PH值為7. 2—7. 5,條件培養(yǎng)液是這樣獲得的，培養(yǎng)BRL-3A細胞至細胞匯合后(通常為3 天)，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心分離后再經(jīng)濾膜過濾所得即為條件培養(yǎng)液。這里，濾膜是 0. 22um微孔得濾膜，離心分離的轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，離心分離時間不少于5min。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有可以實現(xiàn)雞胚胎干細胞的長期傳代培養(yǎng)，并具有細胞增殖快、克隆獲得率高的優(yōu)點。


圖1 (A)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第2代的雞胚胎干細胞； 圖1 (B)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第5代的雞胚胎干細胞；
圖1 (C)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第10代的雞胚胎干細胞；
圖1 (D)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第15代的雞胚胎干細胞；
圖1 (E)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第19代的雞胚胎干細胞；
圖1 (F)為在本發(fā)明所述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的傳至第25代的雞胚胎干細胞
圖2(A)為堿性磷酸酶染色呈藍紫色的雞胚胎干細胞的鑒定；
圖2(B)為免疫細胞熒光鑒定SSEA-I呈陽性的雞胚胎干細胞的鑒定；
圖2(C)為分化培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)形成擬胚體并高度表達中胚層的雞胚胎干細胞的鑒
定；
圖2(D)為內(nèi)胚層以及外胚層的標志基因CH-T的雞胚胎干細胞的鑒定； 圖2(E)為內(nèi)胚層以及外胚層的標志基因TTR的雞胚胎干細胞的鑒定； 圖2(F)為內(nèi)胚層以及外胚層的標志基因β-activin的雞胚胎干細胞的鑒定； 圖3為RT-PCR檢測擬胚體中三個胚層特異性基因的引物序列。
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細描述 (一)試驗動物及細胞系
受精種雞蛋購自廣東省食品企業(yè)集團佛山市南海種禽有限公司；清潔級懷孕12. 5 d 昆明小白鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心；STO細胞系購自武漢大學保藏中心(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)；大鼠肝細胞系(buffalo rat liver cell，BRL-3A細胞)購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。(二)溶液或試劑配制
1. PBS 的配制稱取 NaCl 8. Og^Na2HPO4 3. 63g、KCl 0. 2g KH2PO4 0. 24g 溶于適量超純水，調(diào)PH值至7. 4，定容至IOOOmL ； IOOrnl/瓶分裝，15磅高壓滅菌30min，4°C保存?zhèn)溆谩?. DMEM的配制取DMEM —包(葡萄糖含量13. 5克，Gibco公司)用適量超純水溶解，稱取NaHCO3 3. 7g，溶于超純水中混勻，加青鏈霉素I mL (10萬IU/mL)，用超純水定溶至1000 mL，調(diào)pH 7. 2左右，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，100 mL分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?. Hanks液的配制取Hanks —包(Gibco公司)用適量超純水溶解，稱取NaHCO3 0. 35g，溶于超純水中混勻，加青鏈霉素1 mL (10萬IU/mL)，用超純水定溶至1000 mL，調(diào)pH 7. 2左右，0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，100 mL分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?.胰蛋白酶的配制稱取胰蛋白酶0. 25g溶于100 mL PBS，0. 22μπι微孔濾膜過濾除菌，1 mL分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?.干細胞生長因子的分裝取一個包裝的干細胞生長因子(Invitrogen公司)溶于100 μ L超純水，加入含10% (體積百分比)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液9. 9 mL,充分混勻， 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后100 PL分裝，-20°c密封保存，使用時胚胎干細胞培養(yǎng)液稀釋為所需濃度。6.堿性成纖維細胞生長因子的分裝取一個包裝的堿性成纖維細胞生長因子 (Invitrogen公司)溶于100 μ L Tris (ΡΗ7. 6)，加入含10% (體積百分比)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液4. 9 mL,充分混勻，0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌后100 μ L/管分裝，_20°C密封保存。使用時用胚胎干細胞培養(yǎng)液稀釋為所需濃度。7.白血病抑制因子的分裝取一個包裝的白血病抑制因子(Millipore公司)， 加入含10% (體積百分比)胎牛血清的PBS 9.5 mL，充分溶解后0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，200 1117管分裝，2、1密封保存。使用時胚胎干細胞培養(yǎng)液稀釋為所需濃度。8.絲裂霉素一 C的配制2 mg絲裂霉素一 C溶于20 mL PBS使其完全溶解，配成濃度為100 yg/mL的貯存液，0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌后1 mL/管分裝，-20°C保存， 使用時DMEM稀釋為10 μ g/mL。9. 0. 1%明膠的配制稱取0. Ig明膠充分溶解于100 mL三蒸水中，15磅高壓滅菌 30min，4°C保存?zhèn)溆谩?0. EDTA 的配制稱取 EDTA 0. 2g、NaCl 0. 8g、KCl 0. 02g, Na2HPO4 · 12H20 0. 289 g、KH2PO4 0. 02g溶于100 mL超純水，15磅高壓滅菌30 min, 4°C保存?zhèn)溆谩?1. 0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化液的配制0. 25%胰蛋白酶與EDTA以1 1配制。12. BRL-3A細胞培養(yǎng)液高糖DMEM培養(yǎng)基中加入如下物質(zhì)5% (體積百分比)胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1% (體積百分比)雙抗。實施例1雞胚胎干細胞的培養(yǎng) 1.飼養(yǎng)層的制備
(1)小鼠胚胎成纖維細胞、雞胚成纖維細胞以及STO細胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)于含 10% (體積百分比)胎牛血清、1% (體積百分比)雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液；
(2)80%-90%細胞匯合時，棄培養(yǎng)液，PBS洗2—3次；
(3)加入終濃度為10μ g/mL的絲裂霉素-C，37°C孵育2 — 2. 5 h ；
(4)棄絲裂霉素-C，PBS充分洗滌細胞6—7次，確保完全去除絲裂霉素-C；
(5)加適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化30s左右，加DMEM液終止消化，充分吹打，制備單細胞懸液；
(6)1000rpm離心5— 8 min，用含10% (體積百分比)胎牛血清、1% (體積百分比)雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5 X IO5個/mL，接種于經(jīng)0. 1%明膠包被的培養(yǎng)板，置37°C，5%C02，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(7) 24 h后觀察細胞生長情況，若細胞未能鋪滿單層則補加絲裂霉素C處理過的細胞，以確保細胞能連成一片而沒有間隙；制備好的飼養(yǎng)層在5 d內(nèi)使用。2.條件培養(yǎng)液的制備
(1)BRL-3A細胞接種于培養(yǎng)瓶，用BRL-3A細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；
(2)待細胞80%-90%匯合時，棄培養(yǎng)液，每55cm2生長面積的細胞加入10mL新鮮BRL-3A 細胞培養(yǎng)液；
(3)3 d后收集BRL-3A細胞培養(yǎng)液，置無菌瓶，-20°C凍存，使用前0.22μπι微孔濾膜過濾除菌，并調(diào)整PH值至7.2。3.雞胚胎干細胞專用培養(yǎng)基的配制
分別取600、800、900 mL上述BRL-3A細胞條件培養(yǎng)液，加入如下成份胎牛血清50或 100或150 mL，雞血清5或10或20 mL，非必需氨基酸中的一種或幾種共計5或10或25 mL，L-谷氨酰胺0. 146或0. 200或0. ^2g，β-巰基乙醇6或8或14 μ L、小鼠白血病抑制因子1\106或1.5\106或2父106 IU、堿性成纖維細胞生長因子10或30或50 μ g、干細胞生長因子5或10或20 μ g，用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL,配制成雞胚胎干細胞專用培養(yǎng)基，4°C保存?zhèn)溆谩?.雞胚胎干細胞的分離與培養(yǎng)
(1)取新鮮受精種雞蛋，新潔爾滅浸洗，再用75%酒精消毒，氣室朝上靜置5min ；
(2)無菌條件下打開雞蛋，將雞蛋置于無菌培養(yǎng)皿中，分開蛋清和蛋黃，并使胚盤朝上， 去除卵黃周薄膜上的蛋清；
(3)將一小片中央穿孔(直徑約為5mm)的濾紙放置到蛋黃上，使胚盤顯露在孔的中央， 眼科剪沿著濾紙快速的剪開卵黃膜，輕輕提起濾紙即可分離出胚盤；
(4)將附著在濾紙上的胚盤浸入PBS，小心洗去附著的卵黃；
(5)顯微鏡下用發(fā)環(huán)去除胚盤的暗區(qū)，移液器吸取明區(qū)細胞，加入雞胚胎干細胞培養(yǎng)基，輕輕吹打成離散的單個細胞或細胞團，分別接種于上述小鼠胚胎成纖維細胞、雞胚成纖維細胞或STO細胞制備的飼養(yǎng)層，置培養(yǎng)箱37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每M h半量換液，觀察細胞的生長狀態(tài)；
(6)7-8 d后，在飼養(yǎng)層上觀察到到呈集落狀生長的雞胚胎干細胞；
(7)通過雞胚胎干細胞的生長狀態(tài)、集落形成的數(shù)目及大小、集落的分化狀態(tài)等條件確定優(yōu)化的雞胚胎干細胞培養(yǎng)體系其中效果最好的飼養(yǎng)層細胞為STO細胞，最佳培養(yǎng)基配方為條件培養(yǎng)液800 mL，胎牛血清100 mL，雞血清10 mL，非必需氨基酸10 mL，L_谷氨酰胺0.146 g，β-巰基乙醇8 μ L、小鼠白血病抑制因子IX IO6 IU、堿性成纖維細胞生長因子 20 μ g、干細胞生長因子10 μ g，用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL，pH值7. 4。5.雞胚胎干細胞的傳代培養(yǎng)
(1)選擇細胞集落生長良好，隆起明顯，邊緣清晰，形態(tài)未表現(xiàn)分化的集落，PBS清洗1 或2次；
(2)加入新的PBS，37°C孵育8或9或10 min，在顯微鏡下觀察到細胞集落與飼養(yǎng)層稍分開時棄PBS，加入雞胚胎干細胞專用培養(yǎng)基；
(3)用吸管吸出細胞，適度的吹打獲得小細胞團，將細胞接種至2個新的已制備飼養(yǎng)層的培養(yǎng)孔，置培養(yǎng)箱37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每M h半量換液；
(4)待細胞生長成明顯集落后重復(1) - (3)的操作進行一下代的細胞傳代，在該培養(yǎng)體系中，傳至25代仍能保持雞胚胎干細胞的未分化狀態(tài)及高度增殖能力。雞胚胎干細胞的鑒定
將實施例1中得到的傳至2—25代的雞胚胎干細胞采用如下方法進行鑒定 1.形態(tài)學鑒定
雞胚胎干細胞與其它物種胚胎干細胞的形態(tài)類似，呈典型的集落狀生長，細胞集落與飼養(yǎng)層界限清晰，細胞連接緊密(見圖1 (A) —圖1 (F))，通過在顯微鏡下觀察其形態(tài)可初步鑒定。2.堿性磷酸酶染色鑒定
取生長狀態(tài)良好的雞胚胎干細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌以去除殘余培養(yǎng)基；加入4%多聚甲醛4°C固定15或20或30 min，棄固定液，PBS洗滌3次；加入BCIP/NBT染色液在37°C 孵育1. 5或1. 8或2 h，PBS洗滌3次，倒置顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示雞胚胎干細胞呈藍紫色，而飼養(yǎng)層細胞以及已分化細胞不著色(見圖2 (A))。3.胚胎干細胞表面特定抗原(SSEA-I)免疫細胞熒光法染色鑒定
取生長狀態(tài)良好的雞胚胎干細胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入預冷的固定液(丙酮無水乙醇3:2)固定30 min以上；PBS漂洗3次，加入封閉液(含10%胎牛血清的PBS)處理2 h； PBS漂洗，加入一抗(SSEA-I)，37°C水浴避光孵育1 h，PBST洗滌5 min X 3次，加入二抗 (IgG-FITC)，37°C水浴避光孵育45 min，PBST洗滌5 min X3次，加60%甘油一滴，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯著雞胚胎干細胞SSEA-I呈陽性，細胞顯黃綠色熒光，而飼養(yǎng)層細胞以及已分化細胞呈陰性(見圖2 (B))。4.體外分化試驗
(1)雞胚胎干細胞的懸滴培養(yǎng)用口吸管和剝離針把雞胚胎干細胞克隆挑出，經(jīng) 0.05%胰蛋白酶消化液消化為分散的雞胚胎干細，離心，棄上清；加入10 mL分化培養(yǎng)基， 反復吹打形成細胞懸液，用多孔移液管在100 mm組織培養(yǎng)皿蓋下面滴加5排30 μ L/滴 (IO4ceIlsAiL)的細胞懸液，小心翻轉(zhuǎn)蓋子，使液滴懸掛于培養(yǎng)皿蓋子上，并置于含10 mL PBS的培養(yǎng)皿上，37. 50C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d ；
(2)分化胚胎干細胞的懸浮培養(yǎng)胚胎干細胞經(jīng)2d懸滴培養(yǎng)后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿蓋子并收集液滴，轉(zhuǎn)移到35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液中含20% (體積百分比)胎牛血清，不加任何抑制分化因子成分，并每天用吸管吹打，防止形成的擬胚體貼壁，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)5 d，隔天半量換液，可觀察到形成擬胚體(見圖2 (C))；
(3)ES細胞自然分化將上述所得擬胚體轉(zhuǎn)移到含2 mL分化培養(yǎng)基、經(jīng)0. 1%明膠處理的M孔培養(yǎng)板中，每孔接種一個擬胚體，讓雞胚胎干細胞貼壁進行自然分化；
(4)RT-PCR法檢測擬胚體中三個胚層特異性基因的表達CH-T、TTR及β-activin 分別是中胚層、內(nèi)胚層及外胚層的標志性基因，常規(guī)RT-PCR檢測擬胚體中這三個標志基因的表達情況。結(jié)果表明擬胚體經(jīng)自然分化后可高度表達上述三個胚層的標志基因，提示雞胚胎干細胞經(jīng)自發(fā)分化后可形成三個胚層的細胞(見圖2的D、E、F及圖3)。
權(quán)利要求
1.長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法，其特征在于分離期胚盤明區(qū)的細胞，經(jīng)機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養(yǎng)層，用上述雞胚胎干細胞在專用培養(yǎng)基及37 38°C環(huán)境下培養(yǎng)，3飛天傳代一次，專用培養(yǎng)基包括差件培養(yǎng)液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；雞血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5 — 25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巰基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；堿性成纖維細胞生長因子10 — 50 μ g ；干細胞生長因子5 — 20 μ g，將上述成分用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL，調(diào)pH值為7. 2—7. 5,條件培養(yǎng)液是這樣獲得的，培養(yǎng)BRL-3A細胞至細胞匯合后，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心分離后再經(jīng)濾膜過濾所得即為條件培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法，其特征在于分離X期胚盤明區(qū)的細胞，經(jīng)機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養(yǎng)層是這樣實現(xiàn)的，包括(1)小鼠胚胎成纖維細胞、雞胚成纖維細胞以及STO細胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)于含體積百分比為10%的胎牛血清、體積百分比衛(wèi)1%的雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液；(2)80%-90%細胞匯合時，棄培養(yǎng)液，PBS洗2— 3次；(3)加入終濃度為10μg/mL的絲裂霉素-C，37°C孵育2 — 2. 5 h ；(4)棄絲裂霉素-C，PBS充分洗滌細胞6—7次，確保完全去除絲裂霉素-C；(5)加適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化30s左右，加DMEM液終止消化，充分吹打，制備單細胞懸液；(6)1000rpm離心5— 8 min，用含體積百分比為10%胎牛血清、體積百分比為1%的雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5 X IO5個/mL，接種于經(jīng)0. 1%明膠包被的培養(yǎng)板，置37°C，5%C02，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(7)24 h后觀察細胞生長情況，若細胞未能鋪滿單層則補加絲裂霉素C處理過的細胞，以確保細胞能連成一片而沒有間隙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法，其特征在于培養(yǎng) BRL-3A細胞是將BRL-3A細胞接種于培養(yǎng)瓶，用BRL-3A細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法，其特征在于培養(yǎng) BRL-3A細胞時待細胞80%-90%匯合時，棄培養(yǎng)液，每55cm2生長面積的細胞加入10 mL新鮮 BRL-3A細胞培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法，其特征在于加入新鮮 BRL-3A細胞培養(yǎng)液3天后收集BRL-3A細胞培養(yǎng)液一即上清液，置無菌瓶，_20°C凍存，使用前離心分離并經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，然后調(diào)整pH值至7. 2。
6.長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的專用培養(yǎng)基，其特征在于包括— 900mL ；胎牛血清50—150 mL ；雞血清5 — 20 mL 非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5— 25 mL;L-谷氨酰胺0. 146 — 0.四2 g; β-巰基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1 一 2 X IO6 IU ；堿性成纖維細胞生長因子10—50 μ g ；干細胞生長因子5—20 μ g，將上述成分用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000 mL，調(diào)pH值為7. 2—7. 5,條件培養(yǎng)液是這樣獲得的，培養(yǎng)BRL-3A細胞至細胞匯合后，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心分離后再經(jīng)濾膜過濾所得即為條件培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的專用培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)BRL-3A細胞時待細胞80%-90%匯合時，棄培養(yǎng)液，每55cm2生長面積的細胞加入10 mL新鮮BRL-3A細胞培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的專用培養(yǎng)基，其特征在于加入新鮮BRL-3A細胞培養(yǎng)液3天后收集BRL-3A細胞培養(yǎng)液一即上清液，置無菌瓶，_20°C凍存，使用前離心分離并經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，然后調(diào)整pH值至7. 2。
全文摘要
長期傳代培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)基，其特征在于分離期胚盤明區(qū)的細胞，經(jīng)機械吹打分散成單個細胞或小細胞團后，接種于STO飼養(yǎng)層，用上述雞胚胎干細胞在專用培養(yǎng)基及37~38℃環(huán)境下培養(yǎng)，3~5天傳代一次，專用培養(yǎng)基包括條件培養(yǎng)液600-900mL；胎牛血清50-150mL；雞血清5-20mL；非必需氨基酸中的一種或幾種混合物5-25mL；L-谷氨酰胺0.146-0.292g；β-巰基乙醇6-14μL；小鼠白血病抑制因子1—2×106IU；堿性成纖維細胞生長因子10-50μg；干細胞生長因子5-20μg，將上述成分用DMEM高糖培養(yǎng)基定容至1000mL，調(diào)pH值為7.2-7.5，條件培養(yǎng)液是這樣獲得的，培養(yǎng)BRL-3A細胞至細胞匯合后，收集培養(yǎng)細胞的上清液，離心分離后再經(jīng)濾膜過濾所得即為條件培養(yǎng)液。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有可以實現(xiàn)雞胚胎干細胞的長期傳代培養(yǎng)，并具有細胞增殖快、克隆獲得率高的優(yōu)點。
文檔編號C12N5/0735GK102329771SQ20111030660
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者王丙云, 計慧琴, 陳志勝, 陳勝鋒 申請人:佛山科學技術(shù)學院