一種假絲酵母菌及一種微生物代謝制備d-纈氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，利用從土壤中篩選出的一株假絲酵母制備高純度醫(yī)藥級D-纈氨酸的方法，主要步驟包括：將該菌株在30℃、300-400rpm的條件下培養(yǎng)24-28h，離心取菌體。將菌體加入含有DL-纈氨酸的溶液中，利用菌體代謝掉其中的L-纈氨酸，代謝過程中2-4小時調(diào)節(jié)pH，使其pH維持在6.0-6.2之間，反應(yīng)144-168小時pH不再上升時結(jié)束。離心除去菌體，于上清液中加入活性炭90-100℃脫色30-40min，過濾、濃縮、結(jié)晶、烘干得到高純度醫(yī)藥級的D-纈氨酸。該方法成本較低，過程簡單，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種假絲酵母菌及一種微生物代謝制備D-纈氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及D-纈氨酸的制備，更具體地說，涉及一種基于微生物代謝制備D-纈氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前市場上的D-纈氨酸主要是由化學(xué)法生產(chǎn)、酶拆分法生產(chǎn)，通過手性柱分離或者是采用氨基酰化酶拆分N-乙酰DL-纈氨酸的工藝，經(jīng)濃縮、醇析、除鹽、水解、精制、烘干得到D-纈氨酸。采用化學(xué)法生產(chǎn)的D-纈氨酸成分中其閾值不高，只能達(dá)到95%左右，同時生產(chǎn)過程中會采用大量的化學(xué)試劑,不僅成本高,收率低，同時生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的有機物、無機鹽、固廢和有機廢水，對環(huán)境不友好。微生物不對稱降解的原理生產(chǎn)D-纈氨酸不僅閾值高，收率高、生產(chǎn)成本低，而且采用的生物技術(shù)是國家鼓勵類的生產(chǎn)工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述問題，本發(fā)明提供了一種以DL-纈氨酸為原料及反應(yīng)底物生產(chǎn)D-纈氨酸的生物方法，利用假絲酵母代謝DL-纈氨酸中的L-纈氨酸制備得到純度為99.5-99.9%D-纈氨酸，具有生產(chǎn)過程簡單、條件溫和、生產(chǎn)過程無污染、產(chǎn)品純度高的特點。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種微生物有氧發(fā)酵生產(chǎn)D-纈氨酸。首先本發(fā)明提供了一種假絲酵母菌(Candida sp.) DLPU_D_Val，，保藏編號為CGMCC N0.7786。
[0005]本發(fā)明還提供了利用假絲酵母菌DLPU-D-Val制備D-纈氨酸的應(yīng)用。
[0006]具體說，本發(fā)明一種微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，向含有DL-纈氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母菌體DLPU-D-Val進(jìn)行有氧發(fā)酵，制得到D-纈氨酸；所述假絲酵母菌體 DLPU-D-Val 保藏編號為 CGMCC N0.7786。
[0007]優(yōu)選方式下，以體積質(zhì)量百分比計所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分:6-8%DL_纈氨酸，0.1~1.0%的葡萄糖或蔗糖或麥芽糖，0.2~2.0%的蛋白胨，酵母膏0.2~1.5%, 0.2~0.5%磷酸氫二鉀，0.3~1.0%磷酸二氫鉀，0.05~0.15%硫酸鎂，0.005~1.0%氯化鈣，5.0~10
毫克每升三氯化鐵，4.0~8.0毫克每升硫酸鋅。
[0008]發(fā)酵過程:將菌體加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~32°C、300~400rpm下進(jìn)行有氧發(fā)酵，過程中每隔2-4小時調(diào)節(jié)pH,使其pH維持在6.0-6.2之間，144-168小時pH不再上升時結(jié)束；發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液80-90°C殺菌30-40分鐘。用離心機離心發(fā)酵液，去除菌體，發(fā)酵清液用0.5-1.0%活性炭在90-10(TC脫色30-40分鐘，脫色液減壓濃縮，真空度大于-0.085MPa，待濃縮液中出現(xiàn)大量晶體時，停止?jié)饪s，冷卻到室溫，抽濾，濕晶體用甲醇漂洗,90-10CTC烘干得D-纟顏氨酸成品。
[0009]上述發(fā)酵過 程中調(diào)節(jié)pH選用10%硫酸。
[0010]此外本發(fā)明還提供了假絲酵母菌體的活化獲取方法，包括如下步驟:
[0011]1、配制斜面培養(yǎng)基，以體積質(zhì)量百分比計包括:0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%瓊脂粉;121。C滅菌30min ；[0012]2、將假絲酵母菌種接入所述斜面培養(yǎng)基中30°C、300~400rpm的條件下培養(yǎng)24~28h，離心取菌體。
[0013]本發(fā)明是利用從土壤中篩選出的一株假絲酵母制備高純度醫(yī)藥級D-纈氨酸的方法，屬發(fā)酵工程領(lǐng)域。。該菌株具有不對稱降解能力，利用微生物不對稱降解的原理，通過微生物降解DL-纈氨酸中的L-纈氨酸而不降解D-纈氨酸，再在發(fā)酵液中提純制備D-纈氨酸。本發(fā)明方法成本較低，過程簡單，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的化學(xué)方法，不使用有機溶劑，無廢水、鹽和固廢產(chǎn)生，是一種綠色生產(chǎn)工藝。
[0014]保藏說明
[0015]本發(fā)明涉及的生物材料樣品的保藏信息:參據(jù)的微生物(株)為DLPU-D-Val，分類命名為假絲酵母(Candida sp.)，于2013年6月13日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏編號CGMCC N0.7786。CGMCC地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明提供了一種過程簡單，成本較低，利用DL-纈氨酸生產(chǎn)高純度D-纈氨酸的生產(chǎn)方法。具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0017]從土壤中篩選出可以代謝L-纈氨酸而不利用D-纈氨酸的假絲酵母(Candidasp.) DLPU-D-Val，保藏號為 CGMCC N0.7786 (以下簡稱 7786)。
[0018]配制斜面培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中的成分以體積質(zhì)量百分比計):0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%瓊脂粉，121。。滅菌30min。
[0019]將菌種接入上述斜面培養(yǎng)基中30°C、300~400rpm的條件下培養(yǎng)24~28h，離心取菌體?！?br> [0020]配制發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中的成分以體積質(zhì)量百分比計):6-8%DL-纈氨酸，葡萄糖或蔗糖或麥芽糖中的一種0.1~1.0%，蛋白胨0.2~2.0%，酵母膏0.2~1.5%，0.2~0.5%磷酸氫二鉀，0.3~1.0%磷酸二氫鉀，0.05~0.15%硫酸鎂，0.005~1.0%氯化鈣，5.0~
10毫克每升三氯化鐵，4.0~8.0毫克每升硫酸鋅。
[0021]將菌體加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入量為:每100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2-4克濕菌體。而后在30~32°C、300~400rpm下進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)，反應(yīng)過程中每隔2~4小時滴加10%的硫酸調(diào)節(jié)PH，使其維持在6.0~6.2之間，144~168小時pH不再上升時結(jié)束。
[0022]離心除去菌體，上清液中加入活性炭90~100°C脫色30~40min，過濾、濃縮、結(jié)晶、烘干得到高純度(99.5~99.9%)醫(yī)藥級標(biāo)準(zhǔn)D-纈氨酸。
[0023]實施例1:
[0024]先將本發(fā)明提供的菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)24小時。
[0025]配制發(fā)酵培養(yǎng)基配方，稱取DL-纈氨酸7克、葡萄糖0.5克、蛋白胨1.0克、酵母膏1.0克，磷酸二氫鉀0.25克，磷酸氫二鉀0.5克，硫酸鎂0.1克，氯化鈣0.01克，三氯化鐵
0.56毫克，硫酸鋅0.5毫克，自然pH，用自來水定容到100毫升裝在1000毫升的三角燒瓶中，121°C滅菌20分鐘，備用。
[0026]將7786培養(yǎng)的菌接種于裝有消毒后的100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入量為--每100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4克濕菌體。而后在30°C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為315rpm，發(fā)酵24小時后開始流加10%硫酸，每隔2-4小時流加一次，pH維持在6.0-6.2之間，發(fā)酵150小時后發(fā)酵液的PH值不再變化，發(fā)酵結(jié)束。
[0027]發(fā)酵液80°C殺菌30分鐘，用離心機離心除菌后，上清液100毫升加入0.6克的活性炭95°C脫色30min，趁熱抽濾，除去活性炭，取脫色清液減壓濃縮(真空為_0.090MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止，冷卻至室溫，抽濾。晶體用甲醇50毫升漂洗，離心得到晶體，95°C烘干3小時。得到D-纈氨酸3.1克。收率為44.29%。經(jīng)過高效液相色譜法測定D-纈氨酸的閾值為 99.58%ο
[0028]實施例2:
[0029]先將菌種7786在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)24小時。
[0030]配制發(fā)酵培養(yǎng)基配方，稱取DL-纈氨酸15克、葡萄糖1.0克、蛋白胨2.0克、酵母膏2.0克，磷酸二氫鉀0.5克，磷酸氫二鉀1.0克，硫酸鎂0.2克，氯化鈣0.02克，三氯化鐵
1.12毫克，硫酸鋅1.0毫克，自然pH，用自來水定容到200毫升裝在3000毫升的三角燒瓶中，121°C滅菌20分鐘，備用。
[0031]將7786活化的菌接種于裝有消毒后發(fā)酵的200ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入量為:每100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4克濕菌體。而后在31°C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為350rpm，發(fā)酵24小時后開始流加10%硫酸，每隔2-4小時流加一次，pH維持在6.0-6.2之間，發(fā)酵148小時后發(fā)酵液的PH值不再變化，發(fā)酵結(jié)束。
[0032]發(fā)酵液85°C殺菌35分鐘，用離心機離心除菌后，上清液200毫升加入1.4克的活性炭90°C脫色35min，趁熱 抽濾，除去活性炭，取脫色清液減壓濃縮(真空度為_0.090MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止，冷卻至室溫，抽濾。晶體用甲醇100毫升漂洗，離心得到晶體，93°C烘干4小時。得到D-纈氨酸6.1克。收率為40.67%。經(jīng)過高效液相色譜法測定D-纈氨酸的閾值為99.88%ο
[0033]實施例3:
[0034]先將菌種7786在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)24小時。
[0035]配制發(fā)酵培養(yǎng)基配方，稱取DL-纈氨酸30克、葡萄糖2.0克、蛋白胨4克、酵母膏
4.0克，磷酸二氫鉀I克，磷酸氫二鉀2克，硫酸鎂0.4克，氯化鈣0.04克，三氯化鐵2.24毫克，硫酸鋅2毫克，自然pH，用自來水定容到400毫升裝在3000毫升的三角燒瓶中，121°C滅菌20分鐘，備用。
[0036]將7786活化的菌接種于裝有消毒后的400ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入量為:每100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2-4克濕菌體。而后在32°C培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為332rpm，發(fā)酵24小時后開始流加10%硫酸，每隔2-4小時流加一次，pH維持在6.0-6.2之間，發(fā)酵160小時后發(fā)酵液的PH值不再變化，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵液90°C殺菌30分鐘，用離心機離心除菌后，上清液400毫升加入3.2克的活性炭98°C脫色35min，趁熱抽濾，除去活性炭，取脫色清液減壓濃縮(真空度為-0.090MPa)到有晶體出現(xiàn)后停止,冷卻至室溫,抽濾。晶體用甲醇100毫升漂洗,離心得到晶體，92°C烘干3.5。得到D-纈氨酸13.0克。收率為43.33%。經(jīng)過高效液相色譜法測定D-纈氨酸的閾值為99.98%。
[0037]本發(fā)明針對含有DL-纈氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，僅降解L-纈氨酸而不降解D-纈氨酸，最后制得高純度的D-纈氨酸。以DL-纈氨酸計算D-纈氨酸的收率在40-45%，用高效液相色譜柱測定D-纈氨酸純度為99.5-99.9%。[0038]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同 替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.假絲酵母菌(Candidasp.) DLPU_D_Val，其特征在于，保藏編號為CGMCC N0.7786。
2.權(quán)利要求1所述假絲酵母菌DLPU-D-Val在制備D-纈氨酸的應(yīng)用。
3.—種微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，其特征在于，向含有DL-纈氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入假絲酵母菌體DLPU-D-Val進(jìn)行有氧發(fā)酵，制得到D-纈氨酸； 所述假絲酵母菌體DLPU-D-Val保藏編號為CGMCC N0.7786。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，其特征在于，以體積質(zhì)量百分比計所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分:6-8%DL-纈氨酸，0.1~1.0%的葡萄糖或蔗糖或麥芽糖，.0.2~2.0%的蛋白胨，酵母膏0.2~1.5%, 0.2~0.5%磷酸氫二鉀，0.3~1.0%磷酸二氫鉀，0.05~0.15%硫酸鎂，0.005~1.0%氯化鈣，5.0~10毫克每升三氯化鐵，4.0~8.0 毫克每升硫酸鋅； 發(fā)酵過程:將菌體加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~32°C、300~400rpm下進(jìn)行有氧發(fā)酵，過程中每隔2-4小時調(diào)節(jié)pH，使其pH維持在6.0-6.2之間，pH不再上升時結(jié)束； 發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液80-90°C殺菌30-40分鐘。用離心機離心發(fā)酵液，去除菌體，發(fā)酵清液用0.5-1.0%活性炭在90-100°C脫色30-40分鐘，脫色液減壓濃縮，真空度大于-0.085MPa,待濃縮液中出現(xiàn)大量晶體時，停止?jié)饪s，冷卻到室溫，抽濾，濕晶體用甲醇漂洗,90-10CTC烘干得D-纟顏氨酸成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，其特征在于，發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)pH選用10%硫酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一所述微生物代謝制備D-纈氨酸的方法，其特征在于，所述假絲酵母菌體的活化獲取: S1、配制斜面培養(yǎng)基，以體積質(zhì)量百分比計包括:0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%瓊脂粉;121。。滅菌30min ； S2、將假絲酵母菌種接入所述斜面培養(yǎng)基中30°C、300~400rpm的條件下培養(yǎng)24~.28h，離心取菌體。
【文檔編號】C12R1/72GK103667088SQ201310689801
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】張春枝, 畢妍, 浦軍平, 陳莉, 陳明, 祖國仁 申請人:大連工業(yè)大學(xué)